专利名称：禽流感病毒抗原检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断、检测禽流感病毒抗原的方法，以及用于该方法的禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒和制备方法。
背景技术：
禽流感是由A型流感病毒引起的家禽或野禽的一种从呼吸病到严重败血症等多种症状的传染性疾病综合征，被国际兽医局定为A类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，。除了禽类，A型流感病毒还感染其它种属的动物，如马、猪、等，1997年首次发现高致病性禽流感H5N1可感染人类。自禽流感于1878年在意大利发现以来，以在世界大多数国家和地区流行，给养鸡业造成巨大的经济损失，历史上危害最大，经济损失最严重的一次禽流感(H5N1)爆发于1983年美国滨州等地区，美国政府为此共花费了6000多万美元，间接经济损失估计达3.49亿美元。我国香港地区近期爆发的禽流感，据估计损失约达8000万港币。
近年来高致病性的禽流感在全球范围的频繁爆发，使得禽流感不仅仅是一种单纯的禽类普通传染病，而成为世界各国的政治经济事件，尤其是1997年首次发现高致病性禽流感H5N1可感染人类以来，高致病性禽流感已对人类的公共卫生安全构成了威胁。1997年及2003年在香港H5N1禽流感已感染18人，4人死亡，2003年年底开始至今尚在亚洲国家流行的已有上百人感染，几十人死亡。在经历去年SARS之后，人们已认识到了高致病性禽流感潜在的危害性。
禽流感被发现100多年来，各国政府都十分重视禽流感的防治研究，我国也有专门的机构研究禽流感。但A型流感病毒本身比较复杂，按照血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面抗原来区分，目前已发现了15种HA亚型和9种NA亚型，两者组来共有数千种属于许多不同抗原亚型的病毒，H5和H7各亚型主要应起高致病性禽流感，另外，A型流感病毒还存在抗原性转变和抗原性漂移的特点，这就使得禽流感的防治包括疫苗防治和检测诊断有一定的难度。首先是疫苗的研制生产有时很难跟上病毒型的变化，其次是病毒型抗原比较复杂，检测诊断优其定型技术难度大、周期长，难适应目前高致病性禽流感防治要求。
本发明采用禽流感全病毒抗原免疫家兔或羊制备多表位抗体，免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体，研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒，本试剂盒可特异性的检测流感病毒抗原，而切快速(5-20分钟出结果)，可用于发病现场快速诊断，在疫情控制中可帮助确定感染的范围，用于口岸和市场检疫可控制疫情的传播。同时也可用于禽流感病毒感染人的检测。
本发明的公开本发明的第一目的是为了提供一种禽流感病毒抗原的检测方法，该方法为一步法检测方法，灵敏度高、特异性强而且速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。
本发明的第二目的是为了提供一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒，该试剂盒针对禽流感病毒抗原检测提供一种简便而且直接的一步法检测盒，利用该试剂盒检测禽流感病毒抗原的灵敏度高、特异性强，而且速度快、操作简便，无需专门设施。
本发明的第三目的是为提供一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法，该方法简便、稳定性好、重复性好。
本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种禽流感病毒抗原检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗禽流感病毒抗体载于玻璃纤维或无纺部布载体上并在与胶体金标记抗体栽体相连的检测栽体上包被抗禽流感病毒抗体形成的检测线和由抗抗羊、兔或鼠IgG抗体形成的控制线(2)取鸡气管或肛门分泌物溶解液、血清或全血、肝脾等脏器提取液滴于胶体金标记抗体的栽体上，如上述分泌物、血清、全血或脏器含有禽流感病毒抗原则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒内设禽流感病毒抗原金标检测板。
所述的禽流感病毒抗原金标检测板是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和吸水端吸水层之间设有金标抗禽流感病毒抗体层在检测层上包被有检测线和控制线。
本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层和检测层的控制线和检测线的包被，然后在衬板上组合禽流感病毒抗原金标测试条和检测板。
所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备在浓度为0.004-0.012％的氯金酸中加入其体积的1.3-2％、浓度为1-3％的拧檬酸三钠，煮沸10-20分钟，可得到15-50纳米的胶体金溶液ii胶体金标记抗禽流感病毒抗体，在胶体金溶液中用0.2m碳酸钾溶液调pH8.0-8.4，按4-12mg/100ml加入禽流感病毒抗体，交拌后，再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2-4小时iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，去沉淀物，得上清液iv将上清液经10000转/分钟离心60-80分钟离心得沉淀物v将沉淀物按4-10ml0ml溶于0.02M Ph7.4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液该缓冲液中含0.2-0.6％的动物血清蛋白和0.01-0.06％叠氮钠vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺步至液体开始渗出为止而形成金标抗体层。
所述胶体金标记抗体为羊或兔抗禽流感病毒抗体、禽流感病毒单克隆抗体。
所述的检测层是在纤维素膜上设有禽流感病毒抗体构成的检测线和有抗羊、兔或鼠IgG抗体形成的控制线。其制备方法是浓度为0.8-2.4mg/ml的抗体溶液中加入1-3％的固定剂，再利用喷膜机将抗体喷在纤维素膜上，喷膜后37℃干燥，再用0.01ml pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封闭30分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
所述禽流感病毒抗体为羊或兔抗禽流感病毒抗体、禽流感病毒单克隆抗体。
本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明检测、诊断禽流感病毒抗原的方法为一步法，具有较高的特异性和灵敏性，且操作简便，无需专门设施。
2、本发明的诊断试剂盒检测禽流感病毒抗原时具有较高的特异性和灵敏性，检测过程操作讯速、快捷、方便，适用于临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合，3、本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。
图面说明
图1是发明检测板的外观结构示意图1-检测板2-加样孔3-观察孔图2是本发明检测板的内部结构示意图4-加样端吸水层5-金标抗体层6-控制线7-检测线8-检测层9-吸水端吸水层10-衬板本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种禽流感病毒抗原检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗禽流感病毒抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上并在与胶体金标记抗体栽体相连的检测栽体上包被禽流感病毒抗体形成的检测线和由兔、羊抗羊、兔IgG抗体形成的控制线(2)取鸡气管或肛门分泌物溶解液、血清或全血、肝脾等脏器提取液滴于胶体金标记抗体的栽体上，如上述分泌物、血清、全血或脏器含有禽流感病毒抗原则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
参照图1，一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒内设禽流感病毒抗原金标检测板1。
参照图2，所述的禽流感病毒抗原金标检测板1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水端吸水层9，在检测层和吸水端吸水层9之间设有金标禽流感病毒抗体层5在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层滤纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜；金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。
一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)和检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合禽流感病毒抗原金标测试条和检测板(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水纸层4和吸水端吸水层9；在其中段粘贴包被抗体的纤维素膜层8，在加样端吸水纸层4于纤维素膜层8的交接部位，夹贴含金标抗体5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层4中间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，再组装在塑料盒内。盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。
所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、浓度为1％的拧檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记禽流感病毒抗体，取100ml胶体金溶液，用0.2m碳酸钾溶液调pH8.4，加入6mg禽流感病毒抗体，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白，继续搅拌5分钟，4℃静置2-4小时iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10分钟，去沉淀物，得上清液iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉淀物v将沉淀物按4ml0ml溶于0.02M Ph7.4 Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液该缓冲液中含0.25％的牛血清白蛋白和0.02％叠氮钠vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺步至液体开始渗出为止，在37℃下2小时干燥而形成金标抗体层5。
所述胶体金标记抗体为羊、兔抗禽流感病毒抗体。
所述的检测层8是在纤维素膜上设有禽流感病毒抗体构成的检测线和有羊兔抗兔、羊IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取抗禽流感病毒抗体，调浓度为1mg/ml，加入2％的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7；再取羊、兔抗兔、羊IgG调浓度为2mg/ml，加入2％的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷控制线6，按20ul/10cm设置喷膜量，喷膜37℃干燥，2小时，再用0.01m pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封闭30分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
实施例二禽流感病毒抗原检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。
该试剂盒的制备方法除制备胶体金标记的抗体为抗禽流感病毒单克隆抗体外，其他条件与例一同。
权利要求
1.一种禽流感病毒抗原检测方法，其特征在于(1)将胶体金标记的禽流感病毒抗体载于玻璃纤维或无纺部布载体上并在与胶体金标记抗体栽体相连的检测栽体上包被抗禽流感病毒抗体形成的检测线和由抗羊、兔或鼠IgG抗体形成的控制线(2)取鸡气管或肛门分泌物溶解液、血清或全血、肝脾等脏器提取液滴于胶体金标记抗体的栽体上，如上述分泌物、血清、全血或脏器含有禽流感病毒抗原则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
2.如权利1所述的禽流感病毒抗原检测方法，其特征在于所述胶体金标记的禽流感病毒抗体为羊或兔抗禽流感病毒抗体或禽流感病毒单克隆抗体。
3.如权利1所述的禽流感病毒抗原检测方法，其特征在于所述的检测栽体上包被抗禽流感病毒抗体为羊或兔抗禽流感病毒抗体或禽流感病毒单克隆抗体。
4.一种禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设禽流感病毒抗原金标检测板(1)。
5.如权利要求4所述的禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒，其特征在于所述的禽流感病毒抗原金标检测板(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层(4)、检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和吸水端吸水层(9)之间设有金标禽流感病毒抗体层(5)在检测层(8)上包被有检测线(7)和控制线(6)。
6.一种权利要求4所述的禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于主要包括制备金标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)和检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合禽流感病毒抗原金标测试条和检测板(1)。
7.如权利要求6所述的禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，采用公知的胶体金制备工艺制备胶体金ii胶体金标记禽流感病毒抗体，在胶体金溶液中按4-12mg/100ml加入禽流感病毒抗体，经交拌后再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2-4小时iii将上述胶体金溶液经离心去沉淀物，得上清液iv将上清液离心得沉淀物v将沉淀物按4-10ml0ml溶于0.02M Ph7.4 Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液该缓冲液中含0.2-0.6％的动物血清蛋白和0.01-0.06％叠氮钠vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺步至液体开始渗出为止而形成金标抗体层(5)。
8.如权利要求6或7所述的禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述胶体金标记抗体为羊或兔抗禽流感病毒抗体或禽流感病毒单克隆抗体。
9.如权利要求6所述的禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的检测层(8)是在纤维素膜上设有羊或兔抗禽流感病毒抗体或禽流感病毒单克隆抗体构成的检测线(7)和有羊、兔抗兔、羊IgG抗体或羊、兔抗鼠抗体形成的控制线(6)，其制备方法是取抗禽流感病毒抗体，调浓度为0.8-1.2mg/ml，加入2％的固定剂，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线(7)；再取抗兔、羊或鼠IgG调浓度为1.8-2.4mg/ml，加入2％的固定剂，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷控制线(6)，按1.8-2ul/1cm设置喷膜量，喷膜37℃干燥，2小时，再用0.01m pH7.0含8-12％小牛血清的PBS，在37℃下封闭25-35分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
10.如权利要求9所述禽流感病毒抗原金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的固定剂为甲醛。
全文摘要
本发明涉及一种禽流感病毒抗原检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的羊或兔禽流感病毒抗体或单克隆抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上；并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被羊或兔抗禽流感病毒抗体或禽流感病毒单克隆抗体形成的检测线和由抗羊、兔或鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取鸡气管或肛门分泌物溶解液、血清、全血、肝脾等脏器提取液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述分泌物、血清、全血或脏器含有禽流感病毒抗原则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性；该诊断试剂盒包括禽流感病毒抗原金标检测板；该检测板包括加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标羊或兔抗禽流感抗体或禽流感病毒单克隆抗体层；检测层上包被有由羊或兔禽流感病毒抗体或禽流感病毒抗体形成的检测线和由抗羊、兔或鼠IgG抗体形成的控制线；本发明的方法为一步检测方法，灵敏度高、特异性强；而且速度快、简便，无需专门设备。
文档编号G01N33/552GK1725012SQ20051004263
公开日2006年1月25日 申请日期2005年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者李克生, 杜惠芬 申请人:李克生