专利名称：一种快速检测牛奶共轭亚油酸(cla)组成和含量的方法
技术领域：
本发明是一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，以气相色谱技术为核心，主要针对乳脂肪的分离、CLA异构体和十八碳单烯酸异构体的分离和区分，通过物理方法从牛奶中分离脂肪后进一步利用100米长毛细管柱分离CLA和十八碳单烯酸异构体，属于分析方法学领域。
背景技术：
CLAs是一组十八碳二烯酸结构和位置异构体的总称，理论上应该包括14种位置异构体，同时每个位置又有两种不同几何异构体(即顺式和反式)，因此总共有56种异构体。但CLA的最初来源仅限于具有抗癌作用的反刍动物源性异构体(c9t11CLA)。该物质最初在瘤胃内容物中发现，所以又称瘤胃酸。
由于CLA具有独特的生物学功能，因此关于CLA的相关研究已成为近几年国际研究热点之一。研究表明，反刍动物产品是人类获取天然CLA的主要生物来源，但乳脂肪中有400多种不同的脂肪酸，而CLA只是其中的一种具有共轭双键的微量多不饱和脂肪酸。目前乳脂肪经典的分析方法是用有机溶剂提取乳脂肪，然后通过酯化形成脂肪酸甲基酯(FAME)，随后进行层析分离(如利用气相色谱，GC)。但是目前对于牛奶CLA和C18:1(t-C18:1和c-C18:1)异构体的分析还没有国际一致的标准。
在乳脂肪的提取过程中，使用大量的(至少比样品多15倍以上)氯仿甲醇和水(8∶4∶3)混合物具有很好的提取效果，但由于氯仿具有毒性，同时脂肪层容易结合到界面处的蛋白层上，因此从安全、实验室污染和分离效果的角度考虑，不宜利用氯仿批量处理样品。Forch(1957)和Bligh(1959)的方法是从组织提取脂肪的经典方法，而Hara和Radin(1978)建立的利用有正己烷和异丙醇混合物提取乳脂肪的方法目前应用十分广泛，但该方法步骤繁琐，每天最多处理40个样品，当样品量少时，应用该方法比较适合。如果大批量处理样品时，该方法的应用受到限制。
利用GC确定挥发性衍生物是GC分析的一个必要步骤，而FAME具有较高的挥发性，因此脂肪酸的测定通常将其甲酯化后测定。常用的甲酯化试剂有盐酸(HCL)、硫酸(H2SO4)、三氟化硼(BF3)和甲醇钠(NaCH3)。HCL容易准备，适合于所有普通的脂类结构，例如游离脂肪酸、酯、酰胺、甘油脂等。盐酸催化甲酯化的过程通常在80度能够反映完全。在该条件下，共轭系统异构化而增加t，t异构体的含量，同时使CLA产生含甲氧基的副产物。降低温度，如60度或者室温后虽然降低了异构化的发生，但甲酯化不完全。硫酸对共轭双键的异构化作用于盐酸相似，一般在催化异丙脂的过程中应用较广。利用BF3除了不稳定外(即使在冷藏保存时)，其它和HCL具有类似的优缺点。因此不利于CLA的分析。利用NaCH3在50度加热10到15分时能够很快的形成FAME，当室温过夜时也能完全的转化，随后FAME可以利用正己烷提取。利用碱作催化剂的好处可以避免CLA的异构化，但和一些游离脂肪酸和酰胺类脂不发生反应。
CLA可经酸、碱催化后形成FAME，利用气相色谱(GC)分析，但由于酸催化可改变共轭稀中双键的构型而容易形成产生人造CLA，故酸催化法一般不常用。碱催化法分析效果较好，当采用甲醇钠或四甲基胍(TMG)作为酯化剂时，虽不产生异构体和人造CLA，但不能甲基化游离脂肪酸和N一结合脂肪酸(如鞘酯)。目前通过化工碱法催化亚油酸或催化富含亚油酸的油脂而合成的CLA，主要含有两种异构体，即c9t11C18:2和t10c12C18:2，但同时也形成两种副产物，即t8，c10-C18:2和c11，t13-C18:2。因此，上述两种方法均不适宜于分析游离脂肪酸高的样品。CLA中共轭双键的稳定性较亚油酸(LA)低，与花生四稀酸(C20:4，n-6；)和二十二碳六稀酸(C22:6，n-3，DHA)相似，因此，在分析此类脂肪酸前应防止其发生异构化和氧化。
随着分析技术的发展，现已能利用气相色谱、银离子交换液相色谱、红外光谱及电离质谱等进行CLA异构体的定量分析，但这些研究结果并不能完全适用于牛奶脂肪酸样品的分析上。例如当利用甲醇钠时，无法分析乳脂肪中的鞘磷脂和游离脂肪酸。但这些方法耗时、工作量大、成本高，而且不利于大批量的处理样品。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法。该方法可以提高乳脂肪的分离效率和质量和定量分析牛奶中优势CLA和C18:1异构体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，是从牛奶中通过两步超速离心分离出乳脂肪，第一步离心力为17000g-18500g，离心温度控制在4～8℃，离心时间20～40分钟，第二步离心力为18500g-25000g，离心温度控制在18～25℃之间，离心时间20～40分钟；然后通过脂肪酸酯化过程，使分离出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；最后通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量。
其中，第一步离心力应不低于17000g，但要比第二步离心力低，第一步离心力为17000g-18500g；第二步离心力应不低于18500g，但从目前使用的离心机来看，离心机的离心力都不超过25000g，因此，第二步离心力为18500g-25000g。
离心力RCF(g)与离心机转子的转速(rpm)的换算关系为RCF(g)＝1.11×10-6(rpm)2r，其中，RCF(g)为离心力；rpm为离心机转子的转速；r(mm)为旋转半径。因此，离心力RCF(g)可以通过所使用的离心机的旋转半径、控制离心机转子的转速得到。
乳脂肪中有400多种不同的脂肪酸，而CLA仅其中的一种具有共轭双键的微量多不饱和脂肪酸。目前乳脂肪经典的分析方法是用有机溶剂提取乳脂肪，然后通过酯化形成脂肪酸甲基酯(FAME)，随后进行层析分离(如利用气相色谱，GC)。因此，如果直接将乳脂肪酸的分析方法应用于牛奶CLA的分析过程中会有很多局限性。经典方法在乳脂肪的提取过程中，常使用大量的毒性有机溶剂[如氯仿甲醇和水混合物(毒性强)或者正己烷和异丙醇混合物(毒性低)]。而本发明的方法是采用两步超速离心分离乳脂肪，对于牛奶CLA和C18:1异构体具有很好的分离效果，本发明的方法可以提高乳脂肪的分离效率和质量和定量分析牛奶中优势CLA和C18:1异构体。
在本发明的快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法中，所述的脂肪酸酯化过程是利用酸碱混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，在其甲脂化的过程中，先加2wt％的氢氧化钠甲醇溶液于分离的乳脂肪中，振荡后在48-55℃水浴10-20分钟，然后加入5vt％的盐酸/甲醇溶液在78-82℃水浴40分钟-1小时20分钟后冷却到室温。
在本发明的快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法中，在其甲脂化的过程中，其优选的工艺参数是先加2wt％的氢氧化钠甲醇溶液于分离的乳脂肪中，振荡后在50℃水浴15分钟，然后加入5vt％的盐酸/甲醇溶液在80℃水浴1小时后冷却到室温。
所使用的氢氧化钠甲醇溶液为2wt％(质量百分比)的氢氧化钠甲醇溶液；盐酸/甲醇溶液为5vt％(体积百分比)的盐酸/甲醇溶液。
脂肪酸的测定通常将其酯化后测定，经典方法在脂肪酸酯化的过程中，常单纯的使用酸或者碱作为催化剂，容易造成CLA异构体的异构体化(单独使用酸，如盐酸、硫酸或三氟化硼)或者不能完全酯化脂肪酸(当单独使用碱时，如利用甲醇钠不能酯化游离脂肪酸)。而本发明的方法是采用利用酸碱混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，可以提高定量分析牛奶中优势CLA和C18:1异构体的准确性。
在本发明的快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法中，所述的通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量过程，是利用100米长毛细管柱结合二阶升温程序通过气相色谱仪火焰检测牛奶的脂肪酸组成和含量，该二阶升温程序是，在68-72℃维持3-5分钟，然后以12-14℃/分升到175-180℃维持25-30分钟后，再以3.8-4.2℃/分升温到210-220℃维持25-35分，程序总共运行75-85分钟。
在本发明的二阶升温程序的优选工艺参数是在70℃维持4分钟，然后以13℃/分升到175℃维持27分钟后，再以4℃/分升温到215℃维持25分，程序总共运行75分钟。
本发明的优点与有益效果在于，一般牛奶在分析脂肪酸组成前应尽可能的抑制脂肪酶和磷酸酶等分解酶的作用，因此常需要在-70度冰柜贮存，这样限制了样品的贮存量和处理效率。本发明的优点在于通过超速离心的方法，每天可以大批的处理牛奶样品(至少每天可处理300个样)，分离出乳脂肪后，体积小便于贮存和后续的分析，也避免了大量使用毒性有机溶剂。同时在甲酯化的过程中，可以选择出理想内标，采用酸碱混合甲酯化的方法，完全有效的催化脂肪酸形成甲基酯，弥补了单独利用酸或碱催化酯化的不足之处。气相色谱条件的优化，主要包括分离系统和温度的有机结合，最后借助气相配置100米极性毛细管柱和二阶升温程序，提高了分析的精度和可靠性。
本发明的方法可以确定牛奶的脂肪酸组成和含量，尤其对于牛奶CLA和C18:1异构体具有很好的分离效果。本方法与经典的参考方法相比，对于乳脂肪酸组成没有显著的影响，但弥补了经典方法存在耗时、工作量大、环境污染、成本高和处理效率低缺陷，每天可以处理300个样品，能极大地提高分析效率。
图1是四种CLA和C18:1异构体的标准图谱。
图2是25种脂肪酸标准物的分离图谱。
具体实施例方式
针对拟解决的技术问题和制定的技术方案，本发明具体实施方式
通过实例说明如下。
实施例1标准物的配置在最初CLA上市时，大多数商品源CLA混合物含有四种主要的异构体，即t8，c10，c9t11，c11，t13和t10，c12CLA，同时在每种异构体中相应的含有少量的c，c和t，t异构体。目前市售的CLA主要含两种异构体(c9，t11和t10，c12)，同时相应伴随着两种微量的c，c和t，t异构体。本申请中主要选用了牛奶含量最高的两种CLA异构体(即c9t11和t10c12)，同时选用了c9c11和t9t11异构体判断处理过程对CLA异构化的影响。所有脂肪酸标准物见表1。将每种脂肪酸标准物质利用色谱纯正己烷溶解后定容，最终的浓度如表1示。
表1用于牛奶脂肪酸分析的标准物质
实施例2乳脂肪的分离本申请中，利用日立牌高速离心机，首先将牛奶样品(如果牛奶样品事先经冷冻保存，需在室温水浴中化冻)在17800×g以上，4～8℃离心30分钟后，收集上层粗脂肪层约1g于2ml Eppendorf离心管中，在20000×g以上，20～25℃离心20分钟(注意此时离心后会分成3层，上层为脂肪层；中间为蛋白质、微量脂肪和其它的水溶性物质；下层为水相)，收集上层黄色清亮脂肪层冷冻保存或者直接用于后续分析。
实施例3脂肪酸的甲酯化定量称取实例2中分离的乳脂肪(不超过40mg)，加150ul浓度为5mg/ml的C17:0、2mlNaOCH3/Methanol(2质量％)于带螺盖的试管中，振荡后在50℃水浴15分钟，然后加入2ml盐酸/甲醇溶液(5体积％)在80℃水浴1小时后冷却到室温，加入2ml蒸馏水和6ml正己烷，震荡，静止分层或离心分层。吸取上层，在GC下分析检测。
实施例4毛细管柱选择目前主要有两种100米长极性毛细管柱(CP Sil88和SP2560)，本申请采用SP2560(Supelco Inc.，Bellefonte，PA，USA)能够很好的分离大部分CLA和C18:1异构体，而50米和60米的毛细管柱不宜于分离CLA和C18:1异构体。
实施例5升温程序本申请采用了二阶升温程序。即在70℃维持4分钟，然后以13℃/分升到175℃维持27分钟后，再以4℃/分升温到215℃维持30分钟，程序总共运行80分钟。
实施例6内标物质的选择内标选择的理想条件是待测样品中不含，与待检测样品具有相似的火焰检测灵明度。牛奶中一些支链脂肪酸由于其含量低，如C13:0、C15:0、C17:0、C19:0、C21:0和C23:0常可用作内标。但在分析牛奶样时，由于C19:0的峰和C18:1、C18:2的峰十分接近，而C21:0的峰在CLA异构体之间出现，因此C19:0和C21:0不宜用作内标。本申请选用了C17:0作内标。同时，样品处理过程中内标应该在甲酯化的那一步加入，便于计算回收率。
实施例7CLA和C18:1异构体的区分CLA异构体主要在C18:3和C20:1和C20:2之间。利用100m长的毛细管柱分离CLA异构体具有理想的效果，异构体的分离的先后顺序是c/t，c/c和t/t异构体，其中c9t11CLA是主要的异构体，占总CLA的75-85％。四种CLA的标准图谱如图1示CLA异构体分离的先后顺序为c9t11 CLA、t10c12 CLA、c9c11 CLA和t9t11 CLA。
牛奶中总的Tc18:1含量范围在1-7％，C18:1的峰出现在C18:0和C18:2之间。本申请中应用的几种C18:1的标准图谱见图1，其中出峰的先后顺序为t11 C18:1、t12C18:1、c9 C18:1和c12 C18:1。
实施例8牛奶中所有常规脂肪酸标准物质的分离利用100米长的毛细管柱(SP2560)，采用上述二阶升温程序，对本申请应用的25种脂肪酸进行分析，分离图谱如图2示。
实施例9利用该方法与其它分析方法结果比较为了验证本方法在分析牛奶样品中的可靠性，本方法与其它报道的方法进行了比较。利用中国农业科学院畜牧所提供的富CLA生鲜牛奶，按照实例2到实例6的过程操作(每种方法10个重复，其中5个样品为个体奶牛每日早中晚的混合样，其余5个样品为143头牛全天的混合样)，不同的分析方法之间每种脂肪酸的显著性差异利用SAS(9.0)软件包进行统计分析，结果如表2。
表2不同处理方法对牛奶脂肪酸组成的影响
备注方法1本发明方法方法2Christ等(1982)方法3Kelly等(1998a)方法4Palmquist(1988)从表2的测定结果可以看出，对于牛奶样品中CLA及C18:1异构体的分析时，除方法4外，本申请所采用的方法和其它几种文献报道分析牛奶肪脂肪酸的参考方法之间没有显著的差异。由于方法4中仅采用酸法甲酯化，从CLA的异构体可以看出，c9t11CLA比其它三种方法低，而c9c11CLA和t9t11CLA的含量高于其它三种方法。可以看出，本申请采用的方法(方法1)在分析大批量样品十分有效，每天可以处理300个样品，同时节省时间、劳动量和有机试剂，即能提高分析效率，又能减少毒性有机溶剂造成的污染。
应用范围本方法适合于牛奶和不同油脂脂样品中CLA、C18:1异构体及其它脂肪酸组成和含量的测定，但如果要精确测定牛奶中磷酯的含量时，本方法不宜。
权利要求
1.一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，其特征在于是从牛奶中通过两步超速离心分离出乳脂肪，第一步离心力为17000g-18500g，离心温度控制在4～8℃，离心时间20～40分钟，第二步离心力为18500g-25000g，离心温度控制在18～25℃之间，离心时间20～40分钟；然后通过脂肪酸酯化过程，使分离出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；最后通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量。
2.按照权利要求1所述一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，其特征在于，所述的脂肪酸酯化过程是利用酸碱混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，在其甲脂化的过程中，先加2wt％的氢氧化钠甲醇溶液于分离的乳脂肪中，振荡后在48-55℃水浴10-20分钟，然后加入5wt％的盐酸/甲醇溶液在78-82℃水浴40分钟-1小时20分钟后冷却到室温。
3.按照权利要求1或2所述一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，其特征在于，所述的通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量过程，是利用100米长毛细管柱结合二阶升温程序通过气相色谱仪火焰检测牛奶的脂肪酸组成和含量，该二阶升温程序是，在68-72℃维持3-5分钟，然后以12-14℃/分升到175-180℃维持25-30分钟后，再以3.8-4.2℃/分升温到210-220℃维持25-35分，程序总共运行75-85分钟。
全文摘要
一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，是从牛奶中通过两步超速离心分离出乳脂肪，第一步离心力为17000g－18500g，离心温度控制在4～8℃，离心时间20～40分钟，第二步离心力为18500g－25000g，离心温度控制在18～25℃之间，离心时间20～40分钟；通过脂肪酸酯化过程，使分离出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量。本发明的方法可以确定牛奶的脂肪酸组成和含量，尤其对于牛奶CLA和C18:1异构体具有很好的分离效果。本方法与经典的参考方法相比，对于乳脂肪酸组成没有显著的影响，但弥补了经典方法存在耗时、工作量大、环境污染、成本高和处理效率低缺陷，每天可以处理300个样品，能极大地提高分析效率。
文档编号G01N30/68GK1715909SQ20051009005
公开日2006年1月4日 申请日期2005年8月11日 优先权日2005年8月11日
发明者王加启, 卜登攀, 周凌云, 刘仕军, 于建国 申请人:中国农业科学院畜牧研究所