专利名称：时间分辨荧光光谱测量和成像方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明是一种可以同时获取生物样品荧光光谱和荧光寿命信息的测量方法和装置。由于荧光寿命和荧光光谱分别对荧光分子所处的微环境和荧光团分子的种类敏感，因此，二者的同时测量能够为生物医学检测和分析提供互补的功能信息，本发明将在生物学、医学、材料科学等研究领域以及临床医学诊断方面具有重要的应用。
背景技术：
荧光光谱技术是生物医学研究及临床诊断领域广泛应用的有力工具。由于荧光分子所发出荧光的光谱取决于荧光团的组分、分子种类及其能级结构，因此荧光光谱的测量提供了一种区分样品中荧光分子种类的手段，在临床诊断中有助于揭示生物组织的各种代谢过程和病变状态。荧光寿命的测量提供了一种和光谱测量互补的对比信息，对于许多荧光光谱相同或类似的分子，通过测量其荧光寿命完全可以将它们区分开来；另外，由于荧光寿命和许多分子过程，如淬灭、扩散等的驰豫时间类似，因此，荧光寿命的测量也提供了荧光分子所处微环境的信息，可对pH值、离子浓度(Ca2+，Na+等)、氧压等生理参数进行定量测量。时间分辨荧光光谱技术已经引起了人们的广泛关注，并在生物医学检测及分析中获得应用。
由于生物医学中荧光团(包括自体荧光团和外源荧光团)的种类很多，荧光寿命范围很宽，一般在几百ps到几十ns，甚至到几百ns，因此时间分辨荧光光谱的测量，除要求具有很高的灵敏度和特异性外，还要求系统测量时间短、时间和光谱分辨率高、寿命测量范围宽以及能够同时测量各个波长处的荧光寿命。目前常用的时间分辨荧光光谱装置无法满足这些要求，其原因在于用于时间和光谱测量的探测器是分离的器件，没有很好地将光谱测量和寿命测量结合，因此，所得到的要么是一些有限的分立光谱的荧光寿命(如将时间相关单光子计数器和多色仪结合)，要么是需要通过多次测量来获得样品的时间分辨光谱信息，测量时间很长(如扫描单色仪和脉冲取样测量或成像光谱仪和门控脉冲像增强器结合)。
发明内容
本发明采用皮秒扫描相机作为探测器，用色散器件对样品所发出的荧光进行分光，其色散方向与扫描相机的狭缝一致，与相机的扫描方向垂直，一次测量就可以获得样品时间分辨的荧光光谱信息。
本发明的原理及装置的举例说明如图1所示，主要由高重复频率超短脉冲激光器101、脉冲提取器102、扩束透镜107和108、光电转换器105、数字延迟器106、显微物镜110、分光棱镜113、聚焦透镜114、皮秒扫描相机115、CCD读出系统116以及计算机117等组成。
本发明在高重复频率超短脉冲激光器如飞秒激光器光路中采用了脉冲提取装置，将高重复频率超短脉冲激光器如钛宝石激光器输出的超短脉冲重复频率从76MHz降到≤1MHz，因此可测的荧光寿命范围可从皮秒级到微秒级。
本发明采用特殊设计的扩束镜对激光束进行均匀扩束，以充分利用显微物镜的数值孔径，并通过显微物镜对样品进行高空间分辨照明，通过多光子或单光子激发，使样品被照明的点发出荧光。
本发明用一个分光棱镜实现荧光光谱分辨，分光后的光束再经过一个聚焦透镜后在扫描相机的狭缝上形成沿狭缝方向色散开的荧光谱线。
本发明利用一个三维微位移系统，通过样品的三维微位移，可以选择对样品中的不同位置和深度进行时间分辨荧光光谱的测量。
本发明采用特殊设计的扫描变像管和斜坡电压扫描电路，可在≤1MHz的重复频率下工作，并可在相同的重复频率下送出具有不同斜率的斜坡电压脉冲，从而可提供不同的时间分辨率和不同的时间量程。
本发明通过图像增强技术、高效光耦合技术和同步扫描工作模式，实现对微弱信号的高灵敏度探测。
本发明采用特殊设计的光学系统或光锥实现同步扫描变像管荧光屏和CCD读出系统之间的高效光耦合。通过CCD实时读出系统可以实时监测和记录样品的荧光光谱和时间分辨荧光强度等数据信息。
图1时间分辨荧光光谱测量方法及其装置。
图2时间分辨荧光光谱测量方法示意图-1。
图3时间分辨荧光光谱测量方法示意图-2。
图4时间分辨荧光光谱测量方法示意图-3。
具体实施例方式
下面结合附图对技术方案的实施作进一步的详细描述。
图1中，由高重复频率超短光脉冲激光器如钛宝石锁模飞秒激光器101，输出的超短脉冲经过脉冲提取器102后，重复频率从76MHz降到≤1MHz，通过反射镜103反射到时间分辨荧光光谱测量系统的光学平台上，被分束镜104分为两束光，其中一束光的能量较低，用于触发光电探测器PIN105，通过数字延迟器106后，输入到扫描相机115用以触发扫描电路；另外一束光为主光束，用于激发样品。主光束经一对扩束透镜107和108扩束，通过双色镜109后，平行照射到显微物镜110的后焦面，在样品112上会聚成一点，用于对样品的双光子激发。样品所发出的荧光被显微物镜收集，形成平行光束，经过棱镜分光系统113后，被聚焦透镜114会聚到扫描相机115的光电阴极上，并且光谱的色散方向与狭缝方向一致，与扫描相机的扫描方向垂直。通过扫描电路和同步扫描变像管偏转系统的共同作用，可测量出不同光谱的荧光寿命，即实现荧光光谱和荧光寿命的同时测量。通过特殊设计的光学系统或光锥实现同步扫描变像管荧光屏与CCD116的光耦合。通过该实时读出系统和计算机117，可以实时监测和记录样品的荧光光谱和时间分辨荧光强度等数据信息。通过高精度样品台111的三维移动，可选择对样品上不同位置和深度进行同时荧光光谱和寿命的测量。
图2中，由高重复频率超短光脉冲激光器如钛宝石锁模飞秒激光器201输出的近红外超短脉冲经过脉冲提取器202后，重复频率从76MHz降到≤1MHz。低重复频率的光脉冲通过倍频器203后，波长变为原来的一半，通过反射镜204反射到时间分辨荧光光谱测量系统的光学平台上，被分束镜205分为两束光，其中一束光的能量较低，用于触发光电探测器PIN206，通过数字延迟器207后，输入到扫描相机216用以触发扫描电路；另外一束光为主光束，用于激发样品。主光束经一对扩束透镜208和209扩束，通过双色镜210后，平行照射到显微物镜211的后焦面，在样品213上会聚成一点，用于对样品的单光子激发。样品所发出的荧光被显微物镜收集，形成平行光束，经过棱镜分光系统214后，被聚焦透镜215会聚到扫描相机216的光电阴极上，并且光谱的色散方向与狭缝方向一致，与扫描相机的扫描方向垂直。通过扫描电路和同步扫描变像管偏转系统的共同作用，可测量出不同光谱的荧光寿命，即实现荧光光谱和荧光寿命的同时测量。通过特殊设计的光学系统或光锥实现同步扫描变像管荧光屏与CCD217的光耦合。通过该实时读出系统和计算机218，可以实时监测和记录样品的荧光光谱和时间分辨荧光强度等数据信息。通过高精度样品台212的三维移动，可选择对样品上不同位置和深度进行同时荧光光谱和寿命的测量。
图3中，由输出波长为近紫外或蓝紫光的、重复频率可调的超短光脉冲激光器301输出的超短脉冲，通过反射镜302反射到时间分辨荧光光谱测量系统的光学平台上，被分束镜303分为两束光，其中一束光的能量较低，用于触发光电探测器PIN304，通过数字延迟器305后，输入到扫描相机314用以触发扫描电路；另外一束光为主光束，用于激发样品。主光束经一对扩束透镜306和307扩束，通过双色镜308后，平行照射到显微物镜309的后焦面，在样品311上会聚成一点，用于对样品的单光子激发。样品所发出的荧光被显微物镜收集，形成平行光束，经过棱镜分光系统312后，被聚焦透镜313会聚到扫描相机314的光电阴极上，并且光谱的色散方向与狭缝方向一致，与扫描相机的扫描方向垂直。通过扫描电路和同步扫描变像管偏转系统的共同作用，可测量出不同光谱的荧光寿命，即实现荧光光谱和荧光寿命的同时测量。通过特殊设计的光学系统或光锥实现同步扫描变像管荧光屏与CCD315的光耦合。通过该实时读出系统和计算机316，可以实时监测和记录样品的荧光光谱和时间分辨荧光强度等数据信息。通过高精度样品台310的三维移动，可选择对样品上不同位置和深度进行同时荧光光谱和寿命的测量。
图4中，401是时间分辨荧光光谱测量系统的光源，该光源既可以是飞秒超短光脉冲激光器耦合脉冲提取器(如图1所示)，又可以是飞秒光脉冲激光器和脉冲提取器输出的倍频光(如图2所示)，或者是输出波长为近紫外或蓝紫光的、重复频率可调的超短光脉冲激光器(如图3所示)。401的输出通过反射镜402反射到时间分辨荧光光谱测量系统的光学平台上，被分束镜403分为两束光，其中一束光的能量较低，用于触发光电探测器PIN404，通过数字延迟器405后，输入到扫描相机414用以触发扫描电路；另外一束光为主光束，用于激发样品。主光束经一对扩束透镜406和407扩束，通过双色镜408后，平行照射到显微物镜409的后焦面，在样品411上会聚成一点，用于对样品的单光子或双光子的激发。样品所发出的荧光被显微物镜收集，经过光学系统412后输入到棱镜或光栅光谱仪413中分光，然后成像到扫描相机414的光电阴极上，光谱的色散方向与狭缝方向一致，并与扫描相机的扫描方向垂直。通过扫描电路和同步扫描变像管偏转系统的共同作用，可测量出不同光谱的荧光寿命，即实现荧光光谱和荧光寿命的同时测量。通过特殊设计的光学系统或光锥实现同步扫描变像管荧光屏与CCD相机415的光耦合。通过该实时读出系统和计算机416，可以实时监测和记录样品的荧光光谱和时间分辨荧光强度等数据信息。通过高精度样品台410的三维移动，可选择对样品上不同位置和深度进行同时荧光光谱和寿命的测量。
综上所述，本发明利用超短脉冲飞秒激光器或近紫外和蓝紫光的超短脉冲激光器实现对样品的单或双光子激发，通过物镜收集样品所发出的荧光，并利用棱镜或光栅分光系统对其进行分光，当色散方向与扫描相机的狭缝方向一致，并与扫描方向垂直时，就可以同时获取样品的荧光光谱信息和寿命信息。解决了目前同时荧光光谱和荧光寿命测量中的测量时间长、时间分辨率不够高、寿命测量范围不够宽等问题，对实时、在体观察和分析生物体具有重要的应用价值，可广泛用于生物学、医学、材料科学等研究领域以及临床医学诊断方面。
权利要求
1.一种同时测量荧光光谱和荧光寿命或者时间分辨荧光光谱测量的方法，其特征是将高重复频率激光器、脉冲提取器、荧光显微镜、样品台、微位移系统、分光棱镜、皮秒扫描相机、CCD相机与计算机数字处理技术结合起来，形成一套基于高重复频率皮秒同步扫描相机的时间分辨荧光光谱测量系统或荧光光谱和荧光寿命同时测量系统。该系统采用扩束镜和显微物镜实现样品的高效单光子或多光子激发；用一个分光棱镜实现样品所发荧光的光谱分辨；通过选择光谱的色散方向与扫描相机的狭缝方向一致，并与变像管偏转系统的偏转方向垂直，可实现荧光光谱和荧光寿命的同时测量，或实现荧光光谱的测量，或实现荧光寿命的测量；通过样品的三维微位移，可选择对样品上不同位置和深度进行荧光光谱和寿命的同时测量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用高重复频率激光器，如钛宝石锁模飞秒激光器或其它高重复频率飞秒或皮秒激光器作为多光子或单光子激发的时间分辨荧光光谱测量系统的激发光源。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的激光器其光谱范围既可是固定波长的也可是可调波长的，波长允许变化范围400-1000nm，其脉冲重复频率既可是固定的，也可在一定的范围内改变，但每一次工作频率应当是稳定的，重复频率变化范围Hz-500MHz。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是在高重复频率激光器光路中采用脉冲提取装置，将高重复频率激光器输出的超短脉冲重复频率从50MHz-500MHz降到50kHz-1MHz。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是扩束镜采用特殊设计，可以对激光束均匀扩束，使光束能量在空间的分布均匀化。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是用一个具有大数值孔径的显微物镜，实现对样品的高效双光子或单光子激发。
7.根据权利要求1和6所述的方法，其特征是从样品发出的荧光通过显微物镜收集放大后，形成平行荧光光束。
8.根据权利要求1和7所述的方法，其特征是通过显微物镜所形成的荧光变成平行光，再通过分光棱镜分光，实现光谱分辨。
9.根据权利要求1和8所述的方法，系统的色散元件可以是棱镜，也可以光栅。
10.根据权利要求1、8和9所述的方法，系统的光谱分辨率可以通过更换棱镜或光栅进行改变。
11.根据权利要求1和9所述的方法，光栅分光系统，既可以只包含单个光栅，也可以包含多个光栅。
12.根据权利1和11所述的方法，光栅分光系统既可以是扫描输出单个波长的单色仪，也可以是连续输出的多色仪。
13.根据权利要求1和8所述的方法，其特征是位于棱镜和同步扫描相机光电阴极之间的会聚透镜可以由不同焦距的单透镜或复合透镜来代替。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征是荧光显微镜为多光子或单光子激发共焦显微镜，由于所完成的特殊设计，在400-1000nm光谱范围内都具有高的空间分辨率。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征是同步扫描变像管具有大工作面积的光电阴极，具有好的像质和小的时间畸变的电子光学聚焦系统，具有满足宽电子束像质要求的偏转系统。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征是所设计的扫描电路可以在50kHz-1MH重复频率下正常工作，并在相同的工作频率下可以具有不同的扫描电压斜率，从而获得不同的时间量程和时间分辨率。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征是快速光电转换器在超短光脉冲作用下产生电脉冲，并用该电脉冲触发扫描电路，产生所需的高压高重复频率斜坡电压脉冲，用于驱动同步扫描变像管的偏转系统。
18.根据权利要求1和17所述的方法，其特征是在快速光电转换器之前引入可变光延时器或在光电转换器和扫描电路之间引入一可变电延时器，通过调节其延时使入射到同步扫描变像管光电阴极上的光脉冲产生的电子脉冲与加在偏转系统上的斜坡电压脉冲同步。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征是同步扫描相机的时间扫描方向相对于分光系统的色散方向垂直，从而可精确测量不同光谱的荧光寿命。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用CCD实时读出系统，且CCD实时读出系统和同步扫描变像管之间的光耦合或者通过光学透镜或者通过光锥实现。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用三维微位移系统，通过样品的三维微位移，可以选择对样品上不同位置和深度进行同时荧光光谱和荧光寿命的测量。
22.根据权利要求1和21所述的方法，其特征是采用三维微位移系统或样品台，通过对样品的移动，实现样品两维或三维荧光光谱和寿命的测量或成像。
23.根据权利要求1和21所述的方法，其特征是采用光束扫描装置，使激发光点在样品上做两维快速扫描，实现样品两维荧光光谱和寿命的测量和成像。
全文摘要
本发明是一种利用皮秒扫描相机同时获取样品荧光光谱和荧光寿命信息的测量方法和装置。从超短脉冲激光器所发出的蓝紫光或近红外光在扩束后被物镜聚焦到样品上用于样品的单光子或双光子激发，样品所发出的荧光被物镜收集后由分光元件分光，通过聚束透镜会聚成像在皮秒扫描相机的光电阴极上。荧光的色散方向与扫描相机的狭缝方向相同，与扫描方向垂直，通过扫描电路和扫描变像管偏转系统的共同作用，可以同时测量出不同光谱的荧光寿命。由于荧光寿命和荧光光谱分别对荧光分子所处的微环境和荧光团分子的种类敏感，因此，二者的同时测量能够为生物医学检测和分析提供互补的功能信息，本发明将在生物学、医学、材料科学等研究领域以及临床医学诊断方面具有重要的应用。
文档编号G01N21/01GK1912587SQ200510092520
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者屈军乐, 牛憨笨, 刘立新, 陈丹妮, 林子扬, 郭宝平 申请人:深圳大学