Lrp4/Corin多巴胺能神经元祖细胞标志物的制作方法

专利名称：Lrp4/Corin多巴胺能神经元祖细胞标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测和选择多巴胺能神经元祖细胞的多核苷酸探针和抗体，以及使用上述多核苷酸探针和抗体的多巴胺能神经元祖细胞的检测和选择方法，还有使用多巴胺能神经元祖细胞等治疗帕金森病等神经变性疾病的试剂盒及治疗方法。
背景技术：
多巴胺系统是与哺乳动物脑内重要的运动调节、激素分泌调节、情绪调节等相关的非常重要的系统。因而，多巴胺能性神经传导的异常可引发各种神经系统障碍。例如，帕金森病是由中脑黑质的多巴胺能神经元特异性脱落原因引起的锥体外系统神经变性疾病(HARRISON’S PRINCIPLESOF INTERNAL MEDICINE第2卷第23版，Isselbacher et al.等编，McGraw-Hill Inc.，NY(1994)pp.2275-7)。帕金森病的治疗方法，主要采用口服给与L-DOPA(3，4-二羟基苯丙氨酸)的方法以补偿多巴胺产量的减少，但已知该方法疗效的持续性不好。
在帕金森病的治疗方面，最近科研人员正在尝试一种移植含有多巴胺能神经元祖细胞的6-9周龄流产胎儿的中脑腹侧区以补偿失去的多巴胺能神经元的方法(专利文献1；非专利文献1-6)。但是，现阶段，该方法不仅在细胞供应方面和伦理方面存在问题(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33106；Turner et al.(1993)Neurosurg.331031-7)，而且还被指出在感染污染的危险性、移植物的免疫排斥(Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29977-80；Widner and Brudin(1988)Brain Res.Rev.13287-324)、由于与糖酵解相比胎儿组织更主要地依赖脂类代谢而造成的存活率低下(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33106)等各个方面存在问题。
为了解决伦理层面、供应不足等问题，科研人员又提出了例如利用猪源的皮质、纹及中脑细胞的方法等。(例如，参考专利文献2-4)。在这些方法中，为了抑制排斥反应，必须要进行改变细胞表面抗原(MHC-I类抗原)的繁杂操作。作为消除移植物排斥的方法，例如，有科研人员提出可通过同时移植Sertoli细胞而进行局部免疫抑制(专利文献5-6及非专利文献7)。虽然也可从MHC匹配的有血缘关系的人、其他人的骨髓、骨髓银行及脐带血银行等获取移植细胞，但如果能够利用患者自身的细胞，就可以无需多余的操作和步骤而解决排斥反应的问题。
因而，有望实现来自于胚胎干细胞(ES细胞)、骨髓间质细胞等非神经系统细胞的体外多巴胺能神经元分化体系作为移植材料的应用，而以此代替流产胎儿来源的细胞。实际上，有报道称向大鼠帕金森病模型的病变纹移植ES细胞，可以形成功能性的多巴胺能神经元(非专利文献8)。可以认为将来，源自ES细胞或患者本人的神经干细胞的再生治疗会越来越重要。
在神经组织损伤的治疗方面，脑机能的再构建是必须的，为了能够与周围的细胞形成合适的连接(形成网络)，必须移植不是成熟细胞的可以体内分化为神经元的细胞。在神经元祖细胞移植方面，除上述供给方面之外，该祖细胞可能分化为不均一的细胞群，也是存在的问题之一。例如，在帕金森病的治疗中，必须从含有儿茶酚胺的神经元中选择性地移植多巴胺能神经元。目前为止，作为已经提出的可用于帕金森病治疗的移植细胞，例如包括纹状体(非专利文献3和9)、人胎儿神经来源的无限增殖化细胞系(专利文献7-9)、NT2Z细胞的有丝分裂后人神经元(专利文献10)、原始神经元细胞(专利文献11)、通过外源基因转化而产生多巴胺等儿茶酚胺类物质的细胞、骨髓基质细胞(专利文献12-13)、基因修饰的ES细胞(非专利文献8)等。此外，有人提出还可以利用通过使胎儿中脑组织来源的神经祖细胞与FGF-8及Shh相接触而形成的多巴胺能神经元(专利文献14)和通过以视黄酸处理NT2神经细胞而形成的表达酪氨酸羟化酶的细胞(专利文献15)。然而，上述材料均非仅含有多巴胺能神经元或可分化为多巴胺能神经元的细胞。
作为从未分化的细胞群中选择性地浓缩、分离多巴胺能神经元的方法，有人提出在多巴胺能神经元表达的酪氨酸羟化酶(以下也称为“TH”)等的基因的启动子/增强子的控制下，将表达荧光蛋白的报告基因导入细胞群中的各细胞，通过分离发出荧光的细胞，实现多巴胺能神经元在存活状态下的可视化，进而进行浓缩、分离或鉴定的方法(专利文献16)。在该方法中，外源基因导入这样繁琐复杂的过程是必不可少的，而且在用于于基因治疗的目的时，报告基因的存在也造成毒性、免疫原性方面的问题。
专利文献专利文献1美国专利第5690927号专利文献2特表平10-508487号公报专利文献3特表平10-508488号公报专利文献4特表平10-509034号公报专利文献5特表平11-509170号公报专利文献6特表平11-501818号公报专利文献7特表平8-509215号公报专利文献8特表平11-506930号公报专利文献9特表2002-522070号公报专利文献10特表平9-5050554号公报专利文献11特表平11-509729号公报专利文献12特表2002-504503号公报专利文献13特表2002-513545号公报专利文献14美国专利第6277820号专利文献15国际公开第00/06700号专利文献16特开2002-51775号公报非专利文献1Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271541-8非专利文献2Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271549-55非专利文献3Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271556-63非专利文献4Kordower et al.(1995)N.Engl.J.Med.3321118-24非专利文献5Defer et al.(1996)Brain 11941-50非专利文献6Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29977-80非专利文献7Selawry and Cameron(1993)Cell Transplant 2123-9非专利文献8Kim et al.(2002)Nature 41850-56非专利文献9Lindvall et al.(1989)Arch.Neurol.46615-31发明的公开发明要解决的课题现阶段，帕金森病移植治疗方面的一个大问题是流产胎儿的中脑腹侧区和体外分化诱导的多巴胺能神经元前体细胞均是多种细胞的混合物。考虑到形成神经回路方面的安全性，优选分离出单一的目的类型的细胞并加以应用。而且，考虑到形成肿瘤的危险性，以使用经分离的分裂停止后的神经细胞为佳。更进一步，考虑到移植时细胞在脑内的存活以及正确形成网络的能力，希望能够分离出更早期的多巴胺能神经元祖细胞以增进治疗效果。
解决该课题的方法因此，为了分离多巴胺能神经元祖细胞的特异性基因，将E1 2.5小鼠中脑腹侧区沿背腹方向进一步切分为两个区域，并采用改进的差减法(N-RDA，representational difference analysis，代表性差别分析法；RDA(Listsyn NA(1995)Trends Genet.11303-7))(“DNA片段的量均一化方法及差减法”(WO2002/103007小册子))鉴定了在含有多巴胺能神经元的最靠腹侧的区域中特异性表达的基因。其结果，本发明人等成功分离了Lrp4/Corin。Lrp4编码II型跨膜蛋白(

图1)。
在中脑，Lrp4 mRNA在腹侧中心部分特异性地表达，其表达区域与存在多巴胺能神经元祖细胞的区域一致。进而，比较Lrp4与多巴胺神经元标志物TH的表达，发现两者的信号在背腹方向的位置一致但不重合(图4和5)。这表明在停止细胞分裂并移动至神经管外层的该祖细胞中不表达Lrp4mRNA。因此，通过将Lrp4 mRNA作为指标，可以特异性地检测和选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
因而，本发明提供可特异性地检测Lrp4 mRNA的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志多核苷酸探针，以及利用该探针选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法。更进一步，本发明涉及利用这样的核苷酸探针选择出的分裂停止前的多巴胺能神经元增殖祖细胞(以下也简称为“多巴胺能神经元增殖祖细胞”)、利用该增殖祖细胞分离多巴胺能神经元增殖祖细胞的特异性基因及从该祖细胞到多巴胺能神经元的各成熟阶段的特异性基因的方法、以及以成熟为指标筛选诱导该祖细胞分化或增殖的化合物的方法。而且，对使用本发明的核酸探针选出的增殖祖细胞进行培养，可获得含有分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞的多巴胺能神经元系细胞。这里，多巴胺能神经元系细胞是指多巴胺能神经元增殖祖细胞、分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞和/或多巴胺能神经元。多巴胺能神经元系细胞同样可用于分离向多巴胺能神经元成熟的各阶段的特异性基因的方法，以及以成熟为指标的筛选诱导该祖细胞分化或增殖的化合物的方法。因此，本发明涉及对利用本发明的核酸探针选出的多巴胺能神经元增殖祖细胞进行培养而获得多巴胺能神经元系细胞的方法、通过该方法获得的细胞、使用该细胞分离向多巴胺能神经元成熟的各阶段的特异性基因的方法、以及以成熟为指标的筛选诱导该细胞分化或增殖的化合物的方法。
进一步，制备了抗Lrp4抗体，针对Lrp4蛋白的表达进行了研究。首先，在确认组织内的表达时(图8)，发现其与Lrp4 mRNA同样地发生了表达。在这个实验中，虽然在TH表达区可检出Lrp4蛋白的信号，但由于增殖祖细胞向神经管最外层伸展出突起，所以无法区分该信号是突起上的蛋白质的检测结果还是TH表达细胞也同样表达Lrp4蛋白。接下来，使用抗Lrp4抗体采用流式细胞术，分析了在细胞表面是否表达Lrp4蛋白。样品使用已确认表达Lrp4 mRNA的细胞即在体外将ES细胞分化诱导(源自基质细胞的诱导活性(SDIA)法)为多巴胺能神经元祖细胞而得的细胞。结果可以确认该细胞中Lrp4蛋白确实在细胞表面表达(图9)。如果利用这样的在细胞表面表达的蛋白质作为分离标志物，就可以在存活状态下对细胞进行选择，因此是特别优选的(参考图15)。此外，采用5阶段(5-stage)法在体外将ES细胞分化诱导为多巴胺能神经元祖细胞，通过RT-PCR及使用抗Lrp4单克隆抗体的流式细胞术确认了Lrp4的表达。结果表明，采用5阶段法分化而得的多巴胺能神经元祖细胞中同样表达Lrp4(图17A、B)。
接下来，从经诱导分化(SDIA法)的细胞及胎鼠中脑腹侧细胞中，使用抗Lrp4抗体，通过细胞分选器对Lrp4阳性细胞进行分离。针对分离出的细胞通过RT-PCR方法进行基因表达分析时，虽可确认神经元增殖祖细胞标志物即巢蛋白(Nestin)的表达，但进一步实验还表明含有表达分裂停止后的神经元标志物即MAP2的细胞(图10)。此外，与Lrp4阴性细胞群相比，Lrp4阳性细胞群中，分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞标志物Nurrl和TH的表达水平更高。因而，与Lrp4 mRNA为指标时的情况不同，以Lrp4蛋白为指标使用抗体进行细胞选择时，可以分离出含有分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞的多巴胺能神经元祖细胞。以下，在本说明书中，“多巴胺能神经元祖细胞”是指多巴胺能神经元增殖祖细胞及分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞。此外，对于使用抗Lrp4抗体从采用SDIA法在体外诱导分化ES细胞而得的细胞中分离出的细胞，进行了ES细胞特异性表达的Eras和Nanog的表达分析。结果可以确认两者的基因在Lrp4阳性细胞中不表达，而在Lrp4阴性细胞中表达(图18)。因而，通过使用抗Lrp4抗体对细胞进行选择，在诱导分化后同样可以选择、除去未分化的ES细胞。进一步，从含有由采用5阶段法在体外诱导分化ES细胞而得的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群中分离出Lrp4阳性细胞。接下来，对分离出的Lrp4阳性细胞进行体外培养的结果表明，诱导产生了TH蛋白阳性的多巴胺能神经元(图17C)。这表明采用5阶段法诱导的Lrp4阳性细胞是多巴胺能神经元祖细胞，并可在体外成熟。
因而，本发明提供可特异性地检测出Lrp4蛋白的抗体、以及利用该抗体选择多巴胺能神经元祖细胞的方法。进一步，本发明涉及利用该抗体选择的多巴胺能神经元祖细胞，以及利用该祖细胞分离多巴胺能神经元祖细胞的特异性基因及由该祖细胞向多巴胺能神经元成熟的各阶段的特异性基因的方法、以及以成熟为指标的筛选诱导该祖细胞分化或增殖的化合物的方法。而且，对使用本发明的抗体选择出的该祖细胞进行培养，可以获得其它分化阶段的多巴胺能神经元系细胞。这些细胞同样可用于筛选向多巴胺能神经元成熟的各阶段的特异性基因的方法、以及以成熟为指标的筛选诱导该祖细胞分化或增殖的化合物的方法。因而，本发明还涉及对使用本发明的抗体选择出的多巴胺能神经元祖细胞进行培养而获得多巴胺能神经元系细胞的方法、通过该方法获得的细胞、使用该细胞分离向多巴胺能神经元分化成熟的各阶段中的特异性基因的方法、以及以成熟为指标的筛选诱导该细胞分化或增殖的化合物的方法。
进一步，本发明人等将使用抗Lrp4单克隆抗体分离出的Lrp4表达细胞移植入帕金森病模型小鼠纹状体。其结果，接受移植的小鼠纹状体内发现EGFP阳性细胞(表1)，由此可知所移植的Lrp4蛋白阳性细胞可在帕金森病模型小鼠的纹状体内植活。而且，几乎所有的植活的细胞均为成熟神经元标志物MAP2阳性，还观察到EGFP阳性的轴突伸长到纹状体内(表1及图16)。与所移植的Lrp4蛋白阳性细胞为神经祖细胞相对，几乎所有植活的细胞均已分化为成熟的神经细胞分化并已成熟，且这些植活的细胞中有约20％是TH阳性的，这强烈地暗示所移植的Lrp4蛋白阳性细胞中至少有一部分分化为多巴胺能神经元。因此，可以认为根据本发明分离的多巴胺能神经元祖细胞通过移植到脑内可分化为多巴胺能神经元，其对于帕金森病的治疗是有效的。即本发明还涉及含有根据本发明分离的多巴胺能神经元祖细胞的试剂盒，其用于治疗神经变性疾病优选帕金森病；以及治疗神经变性疾病优选帕金森病的方法，包括向患者脑内移植该多巴胺能神经元祖细胞。
发明的效果至今为止，未见有关编码在多巴胺能神经元增殖祖细胞中特异性表达的膜蛋白的基因的报告。针对在细胞膜表面表达的Lrp4蛋白的抗体被认为对于多巴胺能神经元祖细胞的分离是非常有效的。例如，使用抗Lrp4抗体从中脑腹侧区或者含有体外诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的培养细胞中分离Lrp4表达细胞，可以获得纯的多巴胺能神经元祖细胞(图15)。而且，在采用两种不同方法(SDIA法和5阶段法)诱导的任何一种多巴胺能神经元祖细胞中都可确认Lrp4的表达，因此不论细胞的来源如何，Lrp4都可以用作多巴胺能神经元祖细胞标志物。进一步，在Lrp4阳性细胞中未确认ES细胞中特异性表达的Eras和Nanog的表达，所以以Lrp4的表达为指标，可挑选出未分化的ES细胞。
进一步，本发明中，分离而得的多巴胺能神经元祖细胞可直接或在体外增殖后进行移植。本发明的多巴胺能神经元祖细胞具有在脑内的最适区域分化成熟的可能性及在体内增殖的可能性，可以期待其具有长期性的治疗效果。而且，如果使Lrp4表达细胞在体外分化、成熟后进行移植，对于那些由于某种原因在体内不能分化为多巴胺能神经元的情况，同样可以期待其治疗效果。考虑到肿瘤化等危险性，如果在对体外增殖的Lrp4表达细胞进行诱导分化后，使用65B13(WO2004/038018小册子)等分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞标志物分离细胞，用这样分离的细胞进行移植，可能具有更高的安全性。无论何种方法，通过分离出Lrp4表达细胞并用于移植治疗，由于只分离出目的类型的细胞，所以具有高的安全性，而且因为可以使用最初期的多巴胺能神经元祖细胞，所以在存在活率、网络形成能力等方面也可期待更好的治疗效果。即使有些情况下使用刚分离出的初期的该祖细胞不能获得最佳治疗效果，由于可通过体外培养等手段使采用本发明的标志物分离出的该祖细胞成熟，可以制备处于最适分化阶段的材料(图6)。
另一方面，纯的多巴胺能神经元祖细胞在多巴胺能神经元特异性基因的分离等帕金森病治疗的靶标探索方面也是有效的。特别是，多巴胺能神经元祖细胞不仅对于多巴胺能神经元成熟过程的研究及以成熟为指标的筛选体系，而且对于可在体外或体内使该祖细胞增殖的药物的筛选、以及可在体内诱导该祖细胞分化的药物(体内再生治疗药物)的筛选等均是有价值的。
附图的简要说明图1Lrp4的结构模式图。TM跨膜域；FTIfrizzeled域；LDLaLDL受体域；SR清道夫受体域；Protease丝氨酸蛋白酶结构域。
图2采用原位杂交法分析Lrp4及Shh的mRNA在E12.5小鼠后脑腹侧和脊髓的表达情况，图2为显示其结果的照片。
图3采用原位杂交法分析Lrp4、Shh、酪氨酸羟化酶(TH)及NCAM的mRNA在E12.5小鼠中脑腹侧的表达情况，图3为显示其结果的照片。
图4Lrp4在中脑表达模式的模式图及显示采用原位杂交法分析Lrp4、酪氨酸羟化酶(TH)、Sim-1和NCAM的mRNA在E12.5小鼠中脑腹侧表达情况的结果的照片。VZ脑室区(ventricular zone)、ML套层(mantle layer)。
图5采用原位杂交分析Lrp4的mRNA在E12.5小鼠中枢神经系统的表达情况，图5为显示其结果的照片。A矢状面；BA中方框内部分的放大照片；CA中红线位置的断面；D显示Lrp4、Shh及酪氨酸羟化酶(TH)的mRNA在E12.5小鼠中脑腹侧的表达情况。
图6多巴胺能神经元产生至成熟期间，Lrp4、NCAM、TH和DAT的mRNA的表达时期的模式图。
图7上图为采用SDIA法进行ES细胞向多巴胺能神经元的诱导分化的模式图及照片。下图的照片显示了采用SDIA法由ES细胞诱导分化多巴胺能神经元、以RT-PCR方法研究Lrp4 mRNA的表达随时间变化情况的结果。
图8显示Lrp4蛋白在E12.5小鼠中脑的表达情况的照片。
图9使用抗Lrp4抗体对Lrp4蛋白在SDIA分化细胞的细胞表面的表达情况进行流式细胞术分析，图9为显示其结果的照片。
图10对Lrp4阳性细胞中各种多巴胺能神经元标志物的表达情况进行RT-PCR分析，图10为显示其结果的照片。
图11显示多巴胺能神经元产生至成熟期间，Lrp4 mRNA和蛋白以及THmRNA表达时期的模式图。表明在Lrp4表达细胞中，可以增殖的多巴胺能神经元祖细胞与分裂已停止的多巴胺能神经元前体细胞两者共存。
图12显示对Lrp4阳性细胞的分化阶段进行研究的结果的照片。
图13显示在体外增殖Lrp4阳性细胞的结果的照片。
图14显示Lrp4阳性细胞向多巴胺能神经元分化的照片。
图15显示使用抗Lrp4抗体分离及应用多巴胺能神经元祖细胞的方法的模式图。
图16显示移植的Lrp4阳性细胞在体内分化的照片。
图17显示5阶段法分化细胞中，Lrp4的表达与Lrp4阳性细胞向多巴胺能神经元分化的图及照片。照片C中，箭头所示为TH蛋白阳性的多巴胺能神经元。
图18Lrp4阳性细胞及Lrp4阴性细胞中，ES细胞特异性基因(ERas与Nanog)的表达情况的RT-PCR分析，图18为显示其结果的照片。
发明的最佳实施方式以下，针对本发明的实施方式进行说明。以下的实施方式是用于说明本发明的示例，并非意味着本发明仅限于这些实施方式。只要不脱离其要旨，本发明可以各种形态实施。而且本说明书引用的文献和公开公报、专利公报及其它专利文献均作为参考并入本说明书中。
标志物多核苷酸探针本发明的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物多核苷酸探针可作为选择和/或检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的标志物和/或试剂使用。作为该探针使用的多核苷酸含有多巴胺能神经元增殖祖细胞中检出的、与SEQ IDNO1或2的碱基序列互补的碱基序列。SEQ ID NO1为小鼠Lrp4 cDNA碱基序列；而SEQ ID NO2为人Lrp4 cDNA碱基序列。这些序列已分别在GenBank登录(小鼠登录号NM_016869；人登录号XM_035037)。
这里，“标志物多核苷酸探针”是指能够检测出Lrp4的表达特别是其转录的mRNA的、由数个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的碱基或碱基对组成的聚合物。已知双链cDNA可在组织原位杂交中作为探针使用，本发明的标志物也包括这样的双链cDNA。用于检测组织中RNA的特别优选的探针标志物多核苷酸包括例如RNA探针(核糖核酸探针)。而且，根据需要，本发明的标志物多核苷酸探针可以含有非天然的碱基，例如4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-3-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基辫苷、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖基辫苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-甲酯、尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷、辫苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷等。
而且，本发明的标志物多核苷酸探针含有与编码SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列。除SEQ ID NO1或2的碱基序列之外，编码SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的碱基序列还包括由于遗传密码子的简并而与SEQ ID NO1或2的序列不同的碱基序列。此外，本发明的标志物多核苷酸探针还包括含有与编码在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的序列的碱基序列互补的序列的那些。SEQ ID NO3或4的氨基酸序列不含信号序列，小鼠Lrp4(SEQ ID NO3)的113-135位氨基酸、人Lrp4(SEQ ID NO4)的46-68位氨基酸是形成跨膜区的部分。而且，SEQ ID NO3和4的序列也已分别在GenBank登录(人XP_035037、小鼠NP_058565)。
这里，“与某碱基序列互补”并非仅指碱基序列与模板完全配对的情况，其中还包括至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％(例如97％或99％)配对的情况。所谓配对意为以T(RNA中为U)对应于模板多核苷酸碱基序列中的A、以A对应于其中的T或U、以C对应于其中的G、以G对应于其中的C而形成链。而特定的多核苷酸在碱基序列水平的同源性，可由BLAST算法(Altschul(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)确定。作为基于该算法的针对碱基序列的程序，研究人员已经开发出BLASTN(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10)，此程序可用于确定标志物多核苷酸探针序列的同源性。关于具体的分析方法，例如可以参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等。
进一步，本发明的标志物多核苷酸探针包括含有在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列构成的多核苷酸杂交的碱基序列的多核苷酸。关于Lrp4，含有SEQ ID NO1或2所示的碱基序列的，均为公知，但也可能存在其它同种型(alternative isoform)及等位(allelic)突变体，含有与这样的同种型、等位突变体互补的序列的，也可用作本发明的标志物多核苷酸。以含有SEQ ID NO1或2的碱基序列的多核苷酸为探针，可采用集落杂交、蚀斑杂交、Southern印迹等公知的杂交方法从人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、鸡、猪、牛、山羊、绵羊等动物的cDNA文库及基因组文库中获得这样的同种型和等位突变体。关于cDNA文库的构建方法，可以参考《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.》(Cold Spring HarborPress(1989))。此外，也可利用商品化的cDNA文库和基因组文库。
更具体的，在cDNA文库的制作中，首先采用胍超离心法(Chirwin et al.(1979)Biochemistry 185294-9)、AGPC法(Chomczynsk and Sacchi(1987)Anal.Biochem.162156-9)等公知的方法，从表达Lrp4的细胞、脏器、组织等制备总RNA，并使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等纯化mRNA。也可以使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)这样的用于直接制备mRNA的试剂盒。接下来，由所得的mRNA使用逆转录酶合成cDNA。市售的有诸如AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业)等用于cDNA合成的试剂盒。作为其它方法，可以采用5’-RACE法(Froham et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858998-9002；Belyavskyet al.(1989)Nucleic Acids Res.172919-32)利用PCR合成及扩增cDNA。此外，为了制备高全长率的cDNA文库，可以采用寡核苷酸帽法(Marugama andSugano(1994)Gene 138171-4；Suzuki(1997)Gene 200149-56)等公知的方法。通过上述操作获得的cDNA可以整合至适当的载体中。
本发明中的严紧的杂交条件包括例如“2×SSC、0.1％SDS、50℃”、“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、0.1％SDS、37℃”等条件；更严紧的条件包括例如“2×SSC、0.1％SDS、65℃”、“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”、“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”等条件。更详细地讲，一种使用Rapid-hyb缓冲液(Amersham Life Science)的方法是在68℃进行30分钟或更长的预杂交后，加入探针，于68℃保温1小时或更长使杂交体形成，然后于室温2×SSC、0.1％SDS中清洗3次、每次20分钟，再于37℃、1×SSC、0.1％SDS中清洗3次、每次20分钟，最后于50℃，1×SSC、0.1％SDS中清洗2次、每次20分钟。另外，例如可于55℃在Expresshyb Hybridization Solution(CLONTECH)中进行30分钟或更长的预杂交后，加入标记探针，37℃～55℃温育1小时或更长，然后于室温、2×SSC、0.1％SDS中清洗3次、每次20分钟，再于37℃下1×SSC、0.1％SDS中清洗1次、20分钟。这里，例如通过提高预杂交、杂交或第二次清洗时的温度，可以获得更为严紧的条件。例如将预杂交和杂交的温度设置为60℃，而作为更为严紧的条件则可设置为68℃。本领域技术人员可在这样的缓冲液盐浓度、温度等条件的基础上，添加其它探针浓度、探针长度、反应时间等各种条件，对获取Lrp4的同种型、等位突变体及对应的其它生物物种来源的基因所需的条件进行设定。
关于杂交方法的详细步骤可以参考《(Molecular Cloning，ALaboratoryManual 2nded.》(Cold Spring Harbor Press(1989)；特别是Section9.47-9.58)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4)、《DNA Cloning1CoreTechniques，A Practical Approach 2nded.》(Oxford University(1995)；关于条件请特别参考Section 2.10)等。杂交多核苷酸包括例如含有与含有SEQ IDNO1或2的碱基的碱基序列具有至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％(例如至少95％，乃至99％)的同一性的碱基序列的多核苷酸。与上述同源性的确定相同，这种同一性也可通过BLAST算法(Altschul(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)确定。除上述针对碱基序列的BLASTN程序外，作为基于此算法的针对氨基酸序列确定其同一性的程序、研究人员开发了BLASTX(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10)等，上述程序均可加以利用。正如前面提及的那样，关于具体的分析方法可以参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等。
此外可以使用以SEQ ID NO1或2的碱基序列为基础设计的引物，利用基因扩增技术(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987)Section 6.1-6.4)，从人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、鸡、猪、牛、山羊、绵羊等动物的cDNA文库和基因组文库中获取Lrp4的同种型、等位突变体等具有与Lrp4类似的结构和功能的基因。
可以采用常规方法进行测序以确认多核苷酸的碱基序列。例如，可以采用双脱氧核苷酸链末端终止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-7)进行确认。此外，还可以利用合适的DNA测序仪进行序列分析。
并且，本发明的标志物多核苷酸包含(1)与SEQ ID NO1或2的碱基序列互补的序列；(2)与编码SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的碱基序列互补的序列；(3)与编码在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的序列的碱基序列互补的序列；及(4)由这样的碱基序列构成的多核苷酸，所述碱基序列含有在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列组成的多核苷酸杂交的各碱基序列中的至少15个连续的碱基。这样的由含有至少15个连续的碱基的碱基序列构成的多核苷酸，可用作对Lrp4 mRNA的表达进行检测的探针或进行扩增检测的引物。通常，作为探针使用时，其应由15-100个、优选15-35个碱基构成；而作为引物使用时，其应至少由15个、优选至少由30个碱基构成。在作为引物使用时，其可设计为3’末端区域与目标序列互补，而在5’末端添加限制性酶识别位点、标签等的形式。这样的包括含有至少连续的15个碱基的碱基序列的多核苷酸，可与Lrp4多核苷酸杂交。
进一步，本发明的标志物多核苷酸还包含可在严紧条件下与包含下列任意一项的碱基序列的第一链多核苷酸杂交的第二链多核苷酸(1)SEQ IDNO1或2的碱基序列；(2)包含编码多肽的多核苷酸的碱基序列，所述多肽包含SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(3)包含编码多肽的多核苷酸的碱基序列，所述多肽包含SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区域的序列；及(4)包含可在严紧条件下与包含SEQ ID NO1或2的碱基序列的多核苷酸杂交的多核苷酸构成的碱基序列。第二链多核苷酸优选地包括含有优选至少连续的15个碱基的碱基序列的多核苷酸。
采用上述的杂交法、PCR法等，可由表达Lrp4的细胞制备本发明的标志物多核苷酸探针。而且，基于Lrp4的公知的序列信息，可以通过化学合成制备本发明的标志物多核苷酸探针。特别是组织中的RNA检测所优选的核糖核酸探针，例如可以采用在质粒载体pSP64中反方向插入克隆出的Lrp4基因或其部分、然后对插入序列部分进行失控(run-off)转录的方法获取。pSP64含有SP6启动子，此外，通过噬菌体T3、T7启动子及RNA聚合酶的组合制备核糖核酸探针的方法也是公知的。本发明的标志物多核苷酸探针可用作识别多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂，在上述的试剂中，除有效成分即多核苷酸之外，根据需要还可以混入例如灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、助溶剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等。
抗体本发明提供可用于从脑组织或培养细胞中选择多巴胺能神经元祖细胞的多巴胺能神经元祖细胞标志物抗体(以下也称为“本发明的抗体”)。与Lrp4mRNA不同，Lrp4多肽不仅在分裂停止前的多巴胺能神经元祖细胞中表达，而且还在分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞中表达，因此通过使用针对该多肽的本发明的抗体，可用于选择及/或获取分裂停止前后的多巴胺能神经元祖细胞。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFV)(Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-83；The Pharmacology Monoclonal Antibody，Vol.113，Rosenburg andMoore ed.，Springer Verlag(1994)pp.269-315)、人源化抗体、多特异性抗体(LeDoussal et al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.758-62；Paulus(1985)Behring Inst.Mitt.78118-32；Millstein and Cuello(1983)Nature 305537-9；Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk et al.(1989)Int.J.Cancer 43944-9)，以及Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等抗体片段。而且，根据需要还可采用PEG等对本发明的抗体进行修饰。另外，本发明的抗体还可与β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、GST、绿色荧光蛋白(GFP)等一起作为融合蛋白进行生产，这样无需第二抗体即可进行检测。而且，本发明的抗体可通过采用生物素标记修饰，从而有利于使用抗生物素蛋白、链球菌抗生物素蛋白等进行抗体的回收。
本发明的抗体是针对(1)-(6)任意一项的特异性抗体(1)由SEQ ID NO1或2的碱基序列所编码的多肽；(2)由SEQ ID NO3或4的氨基酸序列构成的多肽；(3)由在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的氨基酸序列构成的多肽；(4)由在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸缺失、插入、替换或添加的氨基酸序列构成的多肽；(5)由可在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列的互补序列杂交的碱基序列编码的多肽；(6)至少具有8个氨基酸残基的上述(1)-(5)的多肽的片段多肽。
此外，本发明的抗体可以是与包含下列(1)-(4)任意一项的氨基酸序列或其部分序列的多肽相结合的抗体(1)SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸缺失、替换或添加，或者其组合而导致的变异的氨基酸序列；(4)包含多肽的氨基酸序列，所述多肽由可在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列的互补序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码；上述的由部分序列构成的多肽，例如包含具有优选至少连续6个氨基酸残基(例如8个、10个、12个或15个或更多的氨基酸残基)的多肽。
在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸的缺失、替换或添加，或者其组合而成的变异的氨基酸序列，包括例如(i)在SEQ IDNO3所示的氨基酸序列中缺失1-9个(例如，1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、更优选1个)氨基酸的氨基酸序列；(ii)在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列中添加1-9个(例如，1-5个、优选1-3个，更优选1-2个更优选1个)氨基酸的氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO3所示的氨基酸序列中的1-9个(例如，1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、更优选1个)氨基酸替换为其它氨基酸的氨基酸序列；(iv)发生上述(i)-(iii)的组合所导致的变异的氨基酸序列。
在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸的缺失、替换或添加，或者由其组合所引起的变异的氨基酸序列，包括例如(i)在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中缺失1-9个(例如，1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、更优选1个)氨基酸的氨基酸序列；(ii)在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中增加1-9个(例如，1-5个、优选1-3个，更优选1-2个更优选1个)氨基酸的氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的1-9个(例如，1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、更优选1个)氨基酸替换为其它氨基酸的氨基酸序列；(iv)发生上述(i)-(iii)的组合所导致的变异的氨基酸序列。
这里，氨基酸的缺失意为在序列中缺失一个以上的氨基酸残基的变异，缺失包括在氨基酸序列的末端缺失氨基酸残基和在氨基酸序列的中间缺失氨基酸残基。
这里，氨基酸的添加意为在序列中增加一个以上的氨基酸残基的变异，添加包括在氨基酸序列的末端增加氨基酸残基和在氨基酸序列的中间增加氨基酸残基。
这里，氨基酸的替换意为序列中的一个以上的氨基酸残基被改变为不同种类的氨基酸残基的变异。通过这样的替换改变氨基酸序列时，优选进行保守替换。保守替换是指改变序列而使其编码与替换前的氨基酸性质相似的氨基酸。氨基酸按性质例如可以分为非极性氨基酸(Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val)、不带电的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Gly、Ser、Thr、Tyr)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(Arg、His、Lys)、中性氨基酸(Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)、脂肪族氨基酸(Ala、Gly)、支链氨基酸(Ile、Leu、Val)、羟基氨基酸(Ser、Thr)、酰胺型氨基酸(Gln、Asn)、含硫氨基酸(Cys、Met)、芳香族氨基酸(His、Phe、Trp、Tyr)、杂环氨基酸(His、Trp)、亚氨基酸(Pro、4Hyp)等。
因而，优选在非极性氨基酸之间、或在不带电的氨基酸之间进行替换。其中，作为保持蛋白质性质的替换，优选Ala、Val、Leu和Ile之间、Ser和Thr之间、Asp和Glu之间、Asn和Gln之间、Lys和Arg之间、Phe和Tyr之间的替换。而发生变异的氨基酸的个数和位点没有特别限制。
特别优选的本发明的抗体包括例如实施例4中使用的两种抗Lrp4抗体及包含其片段的变体。这两种抗体已经以下述保藏号进行了国际保藏。
(1)保藏机构的名称和地址名称独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心地址日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)(2)保藏日期2004年7月14日(4)保藏号FERM BP-10315和FERM BP-10316(由在日本国内保藏的FERM P-20120和FERM P-20121移送保藏)本发明的抗体可以通过利用Lrp4多肽或其片段、或者表达该多肽或片断的细胞作为致敏抗原而进行生产。此外Lrp4多肽的短片段，可以与牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清白蛋白等载体(carrier)结合的形式作为免疫原使用。此外，可将铝佐剂，弗氏完全(或不完全)佐剂、百日咳菌佐剂等公知的佐剂与Lrp4多肽或其片段联合使用，以强化针对抗原的免疫应答。
本发明中的“Lrp4多肽”是肽聚合物，优选的实例包括例如具有SEQ IDNO3或4的氨基酸序列的蛋白质。构成Lrp4多肽的氨基酸残基可以是天然存在的，也可以是经过修饰的。而且，Lrp4多肽包括缺失跨膜区的蛋白以及经其它多肽序列修饰的融合蛋白。
在本发明中，Lrp4多肽只要具有Lrp4多肽的抗原性，还包括含有在SEQID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸的缺失、插入、替换或添加的氨基酸序列的多肽。包含发生一个或数个氨基酸的缺失、插入、替换或添加的氨基酸序列的多肽维持与原多肽相同的生物学活性是公知的事实(Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-6；Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res.106487-500；Wang等(1984)Science 2241431-3；Dalbadie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 796409-13)。而且，采用公知的《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.》(Cold SpringHarbor Press(1989))、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987-1997)；特别是Section 8.1-8.5)、Hashimoto-Goto等(1995)Gene152271-5、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92、Kramer andFritz(1987)Method.Enzymol.154350-67、Kunkel(1988)Method.Enzymol.852763-6等所述的定点诱变方法制备编码所需多肽的多核苷酸，并使其适当表达，可以获得这样的含有在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸的缺失、插入、替换或添加的氨基酸序列的、保持了Lrp4的抗原性的多肽。此外，除上述的定点诱变之外，还可以采用以突变源处理基因的方法，或者选择性地切开基因，然后去除、添加或替换所选的核苷酸，最后进行连接的方法。
Lrp4多肽片段是与上述Lrp4多肽的一部分同一的、由优选连续的至少6个的氨基酸残基(例如，至少8个、10个、12个或15个的氨基酸残基)构成的多肽片段。特别优选的片段可以是缺失了氨基末端、羧基末端、跨膜区的多肽片段。Lrp4的多肽片段包括含有α螺旋和α螺旋形成区、α两亲性区、β片层和β片层形成区、β两亲性区、底物结合区、高抗原指数区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、转角和转角形成区以及表面形成区的片段。本发明中的Lrp4多肽片段，只要具有Lrp4多肽的抗原性，可以是任何片段。多肽的抗原决定部位，可采用分析蛋白质氨基酸序列的疏水性/亲水性的方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Bio.157105-22)、二级结构分析方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47251-76)进行预测，也可进一步通过计算机程序(Anal.Biochem.151540-6(1985))或采用合成短肽并检验其抗原性的PEPSCAN法(特表昭60-500684号公报)等进行确认。
Lrp4多肽及多肽片段，可以用表达Lrp4的细胞、组织等为原材料，基于其物理性质等进行分离。此外，也可采用公知的基因重组技术或化学合成方法制备。例如，在体外制备Lrp4多肽时，可依照体外翻译(Dasso和Jackson(1989)Nucleic Acids Res-173129-44)等方法，在无细胞试管体系中制备多肽。与此相对，在使用细胞制备多肽时，首先要将编码所需多肽的多核苷酸整合入合适的载体，然后选择合适的宿主细胞，以该载体进行转化，培养转化细胞，可以获得所需的多肽。
合适的载体包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体、克隆载体、表达载体等各种载体(Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring HarborPress(1989)、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987))。载体上具有可控制目标多核苷酸在所导入的宿主细胞内的表达的调控序列，多核苷酸连接在该调控序列下游。这里的“调控序列”，如宿主细胞是原核生物包括启动子、核糖体结合位点及终止子；如宿主细胞是真核生物则为启动子和终止子，根据情况还包括反式激活因子、转录因子、稳定转录产物的polyA信号、剪接及多腺苷化信号等。这种调控序列包含与之相连的多核苷酸的表达所必需的全部构成要素。载体可以携带选择标记。此外，通过与目的基因连接的方式将编码必要的信号肽的序列整合至载体中，可以将细胞内表达的多肽移送至内质网腔，或者当宿主细胞是革兰氏阴性菌时将其分泌至周质或胞外区。可以利用异源蛋白来源的信号肽作为这样的信号肽。而且，必要时可加入接头，或插入起始密码子(ATG)、终止密码子(TAA、TAG或TGA)。
pBEST(Promega)是示例性的可在体外进行多肽表达的载体。而且，各种适合于在原核细胞宿主内进行表达的载体均是公知的(参考《微生物学基础讲座8基因工程》(共立出版)等)，在选择原核细胞作为宿主时，本领域技术人员可适当地选出适合于所选宿主的载体和将载体导入宿主的方法。此外，适合用作Lrp4多肽及其抗原性片段表达宿主的还有酵母等真菌类、高等植物、昆虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类及各种培养细胞系(COS、Hela、C123、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤细胞、骨髓瘤、Vero、Namalwa、Namalwa KJM-1、HBT5637(特开昭63-299号公报)等)，适合于每种细胞的载体系统和将载体导入宿主细胞的方法均是公知的。而且，在动物活体内(参考Susumu(1985)Nature 315592-4；Ludon(1998)Biotechnol.Annu.Rev.41-54等)和植物体内表达外源蛋白质的方法也是已知的，这些方法可应用于Lrp4多核苷酸的表达。
可以通过利用限制性酶位点的连接酶反应将DNA插入载体中(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987)Section 11.4-11.11；Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring Harbor Press(1989)Section 5.61-5.63)。此外，必要时，考虑到所用宿主的密码子使用频率，可以选择表达效率高的碱基序列，从而设计编码Lrp4多肽的表达载体(Grantham等.(1981)Nucleic Acids Res.9r43-74)。产生Lrp4多肽的宿主细胞内含有编码Lrp4多肽的多核苷酸，只要该多核苷酸不位于其在宿主细胞基因组中天然存在的位置上，其可以处于其自身的启动子的支配之下，也可整合至基因组中，还可作为染色体外的结构而保持。将载体转导(转化(转染))入宿主细胞可以采用公知的传统方法进行。
例如，当宿主为细菌(大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))时，可以采用例如Cohen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))、原生质体法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979)、感受态法(J.Mol.Biol.56，209(1971))；当宿主为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)时，可采用例如Hinnen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1927(1978))、锂离子法(J.Bacteriol.，153，163(1983))；当宿主为植物细胞时，可采用例如叶盘(leaf disk)法(Science，227，129(1985))、电穿孔法(Nature，319，791(1986))、农杆菌法(Horsch等，Science，227，129(1985)、Hiei等，Plant J.，6，271-282(1994))；当宿主为动物细胞时，可采用例如Graham的方法(Virology，52，456(1973))；当宿主为昆虫细胞时，可采用例如Summers等的方法(Mol.Cell.Biol.，3，2156-2165(1983))。
宿主细胞的培养可采用适于所选细胞的公知的方法进行。例如当选择动物细胞时，可以使用DMEM(Virology 8396(1959))、MEM(Science 122501(1952))、RPMI1640(J.Am.Med.Assoc.199519(1967))、199(Proc.Soc.Biol.Med.731(1950))或IMDM等培养基，根据需要加入胎牛血清(FCS)等血清，于pH约6-8、30-40℃培养15-200小时左右。另外，必要时可在培养过程中更换培养基或进行通气和搅拌。
通常，采用基因重组技术生产的Lrp4多肽，如果该多肽分泌至细胞外，可首先回收培养基；特别是当使用转基因生物时，可回收体液等。而如果多肽在细胞内表达，则可溶解细胞并回收溶解成分。然后通过适当地组合公知的蛋白质纯化方法，例如盐析、蒸馏、各种层析、凝胶电泳、凝胶过滤、超滤、重结晶、酸抽提、透析、免疫沉淀、溶剂沉淀、溶剂抽提、硫酸铵或乙醇沉淀等，可以纯化所需的多肽。公知的层析方法包括阴离子或阳离子交换等离子交换层析、亲和层析、反相层析、吸附层析、凝胶过滤层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、磷酸纤维素层析以及凝集素层析等(Strategies for Protein Purification and CharacterizationA Laboratory CourseManual，Marshak等.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。层析可采用HPLC、FPLC等液相层析的方式进行。此外，当产物为GST融合蛋白时，可使用谷胱甘肽柱进行纯化；而当产物为组氨酸标签融合蛋白时，则可使用镍柱进行纯化。当以融合蛋白的形式生产Lrp4多肽时，可在纯化后根据需要使用凝血酶或因子Xa等切去不必要的部分。
此外，还可纯化获取天然来源的多肽。例如，可利用针对Lrp4多肽的抗体，通过亲和层析进行纯化(Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons(1987)Section 16.1-16.19)。而且，根据需要可使用胰凝乳蛋白酶、葡糖苷酶、胰蛋白酶、蛋白激酶及赖氨酰内肽酶等酶类，对纯化后的多肽进行修饰。另一方面，除上述与Lrp4多肽制备相同的合成和基因工程方法外，还可使用肽酶等适当的酶，通过酶切Lrp4多肽制备Lrp4的多肽片段。
根据需要，用于选择多巴胺能神经元祖细胞的多克隆抗体，可以例如通过上述工艺纯化的Lrp4多肽或其片段与所需的佐剂共免疫哺乳动物，由该免疫动物获取血清而获得。这里，对所使用的动物没有特别限定，一般为啮齿目、兔形目和灵长目动物。所述啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠、仓鼠等；兔形目动物包括例如兔等；灵长目动物包括例如猴(例如食蟹猴、猕猴、阿拉伯狒狒和黑猩猩等)等。动物免疫按如下方式进行以磷酸盐缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline，PBS)或生理盐水适当稀释并悬浊致敏抗原，根据需要与佐剂混合并乳化后，注射至动物腹腔内或皮下。然后，优选每4-21天给与数次与弗氏不完全佐剂混合的致敏抗原。可采用常用的方法对血清中所需抗体的水平进行测定，以此验证是否产生抗体。最后，血清本身可作为多克隆抗体使用，也可进一步纯化后再加以利用。具体方法例如可以参考《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987)Section 11.12-11.13)。
此外，为生产多克隆抗体，可首先从按上述方法免疫的动物体内取出脾脏，从脾脏中分离出免疫细胞，用聚乙二醇(PEG)等使该免疫细胞与合适的骨髓瘤细胞融合从而建立杂交瘤。细胞融合可按Milstein的方法(Galfreand Milstein(1981)Methods Enzymol.733-46)进行。这里，合适的骨髓瘤细胞特别包括例如可通过药物对融合细胞进行选择的细胞。使用这种骨髓瘤细胞时，可通过在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液中进行培养来选择融合的杂交瘤，因为该培养液对除融合细胞以外的其它细胞均是致死的。接下来，从建立的杂交瘤中选择产生可与本发明的多肽及其片段结合的抗体的克隆。然后，将选出的克隆移植入小鼠等的腹腔，回收腹水可以获得单克隆抗体。此外，具体的方法可参考《Current Protocols in MolecularBiology)》(John Wiley&Sons(1987)Section 11.4-11.11)。本发明的杂交瘤优选FERM BP-10315和FERM BP-10316。
另外，杂交瘤还可通过以下方法获得在体外用免疫原致敏已感染EB病毒的淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人源的骨髓瘤细胞(U266等)融合，从而获取产生人抗体的杂交瘤(特开昭63-17688号公报)。此外，使用通过致敏具有人抗体基因谱(repertoire)的转基因动物而制备的抗体生成细胞，也可获得人抗体(WO92/03918；WO93-02227；WO94/02602；WO94/25585；WO96/33735；WO96/34096；Mendez等.(1997)Nat.Genet.15146-56等)。不使用杂交瘤的实例有在产生抗体的淋巴细胞等免疫细胞中导入癌基因而永生化的方法。
本发明的抗体还可采用基因重组技术制备(参考Borrebaeck和Larrick(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillan Publishers Ltd.，UK)。首先，从杂交瘤或抗体生成细胞(例如致敏淋巴细胞等)克隆出编码抗体的基因。将获得的基因整合入适当载体，再将该载体导入宿主，然后培养宿主即可产生抗体。这样的重组抗体也包括在本发明的抗体中。代表性的重组抗体包括，例如，包含非人源抗体可变区和人源抗体恒定区的嵌合抗体，以及包含非人源抗体互补决定区(CDR)和人源抗体构架区(FR)及恒定区的人源化抗体(Jones等(1986)Nature 321522-5；Reichmann等(1988)Nature 322323-9；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Bio.2593-6；MethodsEnzymol.20399-121(1991))。
本发明抗体片段可通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶处理前述的多克隆或单克隆抗体进行生产。此外，也可使用编码抗体片段的基因采用基因工程方法生产(参见Co等，(1994)J.Immunol.1522968-76；Better和Horwitz(1989)Methods Enzymol.178476-96；Pluckthun和Skerra(1989)Methods Enzymol.178497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol.121652-63；Rousseaux等(1986)121663-9；Bird和Walker(1991)Trends Biotechnol.9132-7)。
多特异性抗体包括双特异性抗体(BsAb)、双抗体(diabody)(Db)等。多特异性抗体可以采用(1)使用不同种的双功能接头将不同特异性的抗体化学偶联(Paulus1985))Behring Inst.Mill.78118-32)方法、(2)使分泌不同单克隆抗体的杂交瘤相融合的方法(Millstein和Cuello(1983)Nature305537-9)、(3)用不同多克隆抗体的轻链基因和重链基因(4种DNA)转染小鼠骨髓瘤细胞等真核生物细胞表达系统后，分离双特异性的单价部分的方法(Zimmermann(1986)Rev.Physio.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk等(1989)Int.J.Cancer 43944-9)等方法制备。另一方面，双体抗体是包含可通过基因融合构建的二价的两条多肽链的二聚体抗体片段，可采用公知的方法制备。(参考Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-8；EP404097；WO93/11161)。
抗体和抗体片段的回收与纯化，可使用蛋白A和蛋白G进行，此外也可与制备抗体以外的多肽时相同，采用前述的蛋白纯化技术进行(AntibodiesA Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。例如，当利用蛋白A纯化本发明抗体时，可使用Hyper D、POROS或Sepharose F.F.(Pharmacia)等蛋白A柱。所获抗体的浓度可通过测定其吸光度或通过酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
抗体的抗原结合活性可采用测定吸光度、荧光抗体法、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)或ELISA等方法确定。例如，当采用ELISA法进行测定时，首先是将本发明抗体固定在平板等载体上，然后加入Lrp4多肽，再加入含有目标抗体的样品。这里，含有目标抗体的样品可包括抗体生成细胞的培养上清、纯化的抗体等。接下来，加入识别本发明抗体的第二抗体，温育平板。然后，清洗平板，检测结合在第二抗体上的标记。即，如果第二抗体用碱性磷酸酶标记，可通过加入对硝基苯磷酸等酶的底物并测吸光度的方法来测定其抗原结合活性。此外，抗体的活性评价，也可使用BIAcore(Pharmacia)等商品化的系统完成。
本发明涉及以抗Lrp4抗体为有效成分的、识别多巴胺能神经元祖细胞的试剂。除有效成分即本发明的抗体之外，根据需要上述试剂中可以加入例如灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、助溶剂、缓冲剂、蛋白质稳定剂(BSA、明胶等)、防腐剂等。
多巴胺能神经元祖细胞的选择方法等本发明提供获取作为选择性的均一群体的多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法。使用本发明的标志物多核苷酸探针，可以选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。而且，本发明还提供获取作为选择性的均一群体的多巴胺能神经元祖细胞的方法。使用本发明的抗体，可以合适地选择多巴胺能神经元祖细胞。这样，使用本发明的多核苷酸探针或抗体，最终可特异性地选择向多巴胺能神经元分化的多巴胺能神经元系细胞。
这里，术语“选择”包括检测出某样品中表达标志物的细胞的存在、以及在检测出其存在后进一步分离或离析两方面含义。本发明提供选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，该方法包括使含多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞样品与本发明的多核苷酸探针相接触的步骤。该方法中，优选用放射性同位素或非放射性化合物对标志物多核苷酸探针进行标记。例如，用于标记的放射性同位素包括35S、3H等。使用放射性同位素标记的标志物多核苷酸探针时，通过乳胶放射自显影检测银颗粒，可以检测出与标志物结合的RNA。此外，用于标志物多核苷酸探针标记的非放射性同位素包括生物素、地高辛等。生物素标记的标志物可使用标记有例如荧光或碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶的抗生物素蛋白来检测。而地高辛标记的标志物则可使用标记有例如荧光或碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶的抗地高辛抗体来检测。采用酶分子标记时是通过与酶的底物共保温，使稳定的色素在标志物的位置沉着，从而可以进行检测。特别是利用了荧光的原位杂交法(FISH)操作简便，所以是尤其优选的。
此外，本发明提供选择多巴胺能神经元祖细胞的方法，其包括使用于选择本发明的多巴胺能神经元祖细胞的抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触的步骤。即，通过使预期含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品与本发明的抗体相接触、并选择与抗体结合的细胞，可以获取多巴胺能神经元祖细胞(图13)。在与细胞样品接触前，本发明的抗体可固定化于适当的载体上备用。而且，在使本发明的抗体与细胞样品相接触并结合后，依据抗体的亲和性进行纯化，可以选择性地回收与该抗体结合的细胞。例如，当本发明的抗体结合有生物素时，可以将其添加至结合有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的平板上或层析柱中进行纯化。另外，例如可以将磁性微粒结合在抗体上，利用磁铁回收该抗体以及在细胞表面表达与该抗体结合的Lrp4的细胞。此外，利用细胞分选机和荧光等标记的抗Lrp4抗体，可以通过流式细胞术选择表达Lrp4的多巴胺能神经元祖细胞。
这样获得的多巴胺能神经元祖细胞群中，例如含有至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、特别优选至少70％的多巴胺能神经元祖细胞。
本发明提供通过培养使用本发明的多核苷酸探针或抗体选出的多巴胺能神经元祖细胞，选择和/或生产分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞的方法。而且，本发明还提供使本发明的标志物多核苷酸探针或抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触并选择多巴胺能神经元祖细胞，通过培养上述选出的祖细胞，选择及/或生产分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞的方法。
进一步，根据本发明，通过培养使用本发明的标志物多核苷酸探针或抗体选出的多巴胺能神经元祖细胞，并进而使用分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞标志物进行选择及/或筛选(screening)，可以获得肿瘤化危险性低的、特别适合于移植治疗的分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞。分裂停止后的多巴胺能神经元祖细胞标志物包括例如65B13、Nurrl、TH等(WO2004/038018；Kawasaki等(2000)Neuron 2831-40；Wallen等(1999)Exp.Cell.Res.253737-46)。例如，使本发明的标志物多核苷酸探针或抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触，并选择多巴胺能神经元祖细胞，进一步根据需要进行培养，将这样的多巴胺能神经元祖细胞与针对65B13多肽的抗体相接触并选择表达65B13多肽的细胞，由此可以选择和/或生产分裂停止的多巴胺能神经元前体细胞。
本发明提供通过培养使用本发明的标志物多核苷酸探针或抗体选出的多巴胺能神经元祖细胞，来选择和/或生多巴胺能多巴胺能神经元的方法。而且，本发明还提供使本发明的标志物多核苷酸探针或抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触并选择多巴胺能神经元祖细胞，通过培养上述选出的细胞，选择和/或生多巴胺能多巴胺能神经元的方法。
而且，根据本发明，通过培养使用本发明的标志物多核苷酸探针或抗体选出的多巴胺能神经元祖细胞、并进而使用多巴胺能神经元标志物进行选择和/或筛选，可以获取肿瘤化危险性低的、特别适合于移植治疗的多巴胺能神经元。多巴胺能神经元标志物包括例如DAT等(Development.2004.131(5)1145-55.)。例如，使本发明的标志物多核苷酸探针或抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触，并选择多巴胺能神经元祖细胞，进而通过使培养的多巴胺能神经元祖细胞与针对DAT的抗体相接触，并选择表达DAT的细胞，可以选择及/或生多巴胺能多巴胺能神经元。
本发明提供对于经培养或未经培养的使用本发明的抗体选出的多巴胺能神经元祖细胞，进一步除去分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞，从而选择及/或生产可培养增殖的多巴胺能神经元祖细胞的方法。此外，本发明提供使本发明的抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触，并选择多巴胺能神经元祖细胞，培养或不培养上述选出的细胞，并进一步除去分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞，从而选择及/或生产可培养增殖的多巴胺能神经元祖细胞的方法。
在除去分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞时，可以使用分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞标志物选择和/或除去分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞，以获得具有培养增殖潜力的多巴胺能神经元祖细胞。分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞标志物包括例如65B13、Nurrl、TH等(WO2004/038018；Kawasaki等(2000)Neuron 2831-40；Wallen等(1999)Exp.Cell.Res.253737-46)。例如，使本发明的抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触，并选择多巴胺能神经元祖细胞，进一步使根据需要进行培养的多巴胺能神经元祖细胞与针对65B13多肽的抗体相接触，并选择不表达65B13多肽的细胞，可以选择及/或生多巴胺能多巴胺能神经元增殖祖细胞。
表达Lrp4的多巴胺能神经元祖细胞的选择及/或筛选，也可利用针对Lrp4的启动子进行(例如，参考特开2002-51775号公报)。例如，可以将通过后述的Lrp4表达调控区分析所获得的启动子与编码GFP等可检测标志物的基因连接而形成构建体，用携带该构建体的载体转染细胞。另外，可以将编码标志物的基因敲入(knock in)Lrp4基因座。不论采用何种方法，均可特异性地在多巴胺能神经元祖细胞中检测出标志物基因的表达，使得特异性细胞的选择成为可能。
这里使用的细胞样品，优选中脑腹侧区细胞或含有在体外诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的培养细胞。多巴胺能神经元细胞的体外诱导分化，可以用公知的ES细胞、骨髓间质细胞、神经来源的无限增殖细胞系(特表平8-509215号公报；特表平11-506930号公报；特表2002-522070号公报)、原始神经元细胞(特表平11-509729号公报)等细胞为起始材料，采用公知的方法进行。通常，将从脑的多巴胺能区获得的组织与神经组织来源的支持细胞层共培养，即可使之分化为多巴胺能神经元。另一方面，一些已知的方法可由纹状体、皮质等通常的非多巴胺能神经组织诱导形成多巴胺能神经元(特表平10-509319号公报)。此外，有报告称在低氧条件下进行培养，可以获得更多含有多巴胺能神经元的细胞(特表2002-530068号公报)。此外，也可采用5阶段法(Lee等(2000)Nat.Biotech.18675-679、mousedopaminergic neuron differentiation kit(R&D Systems))由ES细胞(CCE)诱导分化多巴胺能神经元。用于本发明的多巴胺能神经元祖细胞选择的细胞样品，可以是采用包括上述方法在内的任何方法分离或培养的细胞群。
此外，用于固定本发明的抗体的载体，优选对细胞是无害的。载体包括例如合成的或天然产生的有机高分子化合物，玻璃珠、硅胶、氧化铝、活性炭等无机材料，以及在它们表面包被有多糖或合成高分子等的材料。载体的形状没有特别限制，可以是例如薄膜状、纤维状、颗粒状、中空纤维状、无纺布状、多孔形状或蜂窝形状，并且可对其厚度、表面积、宽度、长度、形状和大小进行各种改变，从而控制接触面积。
用于治疗神经变性疾病的含有多巴胺能神经元祖细胞的试剂盒以及利用多巴胺能神经元祖细胞的神经变性疾病治疗方法以Lrp4 mRNA的表达为指标，使用多核苷酸探针获得的细胞是多巴胺能神经元增殖祖细胞，以Lrp4多肽的表达为指标，使用抗体获得的细胞是多巴胺能神经元祖细胞，因此无论以mRNA或是多肽为指标均可获得多巴胺能神经元系的细胞群。与传统的混合细胞群或导入外源基因的多巴胺能神经元相比，采用本发明的方法获得的祖细胞，在安全性、存活率、网络形成能力等方面均更适于与姿势反射、运动及奖赏相关行为(reward-associated behaviors)相关的疾病，特别是帕金森病等神经变性疾病、精神分裂症及药物成瘾(Hynes等(1995)Cell 8095-101)的移植治疗。以Lrp4的表达为指标获得的细胞，可以直接或在体外增殖后用于移植(图13)。这种细胞由于具有在脑内的最适位置分化成熟的潜力，可望具有治疗效果。即，本发明还提供含有用于治疗神经变性疾病的试剂盒(以下也称为“本发明的试剂盒”)，其包含使用本发明的标志物多核苷酸探针或抗体选择和/或生产的多巴胺能神经元增殖祖细胞、分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞和/或多巴胺能神经元；还提供以及以向患者脑内移植该细胞为特征的神经变性疾病的治疗方法。进一步，本发明还提供使用本发明的标志物多核苷酸探针或抗体选择和/或生产的多巴胺能神经元增殖祖细胞、分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞和/或多巴胺能神经元用于生产治疗神经变性疾病的试剂盒的用途。在本发明中，神经变性疾病优选帕金森病。除细胞之外，本发明的试剂盒还可以含有药学上允许的载体。这些载体包括例如生理盐水、磷酸缓冲液、培养液、血清、生物体液、羧甲基纤维素溶液、可充当细胞支架的固体(例如，cytodex3(Amersham Bioscience，17-0485-01)等)、细胞外基质成分(例如，胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、昆布氨酸、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、糖胺聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白或两种或两种以上的上述物质的组合等)或者凝胶状支持物等。此外，本发明的试剂盒中可以加入pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等。本发明的试剂盒可用于一次接种，也可用于数次接种。此外，可根据接种的人或动物的体重、年龄及给药方式等选择适合的给药量。
以Lrp4 mRNA的表达为指标选择的多巴胺能神经元祖细胞具备在体内进一步增殖的潜力，可以期待其具有更长期的治疗效果。而且，在体外，通过选择培养基等条件，可以使以Lrp4 mRNA的表达为指标选择的多巴胺能神经元祖细胞分化至适当的阶段，因此，其作为各种神经移植的材料是优选的。例如，对于上述以Lrp4 mRNA的表达为指标选择的多巴胺能神经元祖细胞，进一步以分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞标志物(例如65B13、Nurrl、TH等)为指标进行选择，可以获得在移植方面具有更高安全性的细胞。本发明涉及在体外培养上述祖细胞并使之分化增殖的方法。进行培养的多巴胺能神经元祖细胞也可以是分裂停止后的前体细胞。
采用本发明方法获得的多巴胺能神经元祖细胞时，可以例如移植1×102～1×108个细胞、优选1×103～1×106个细胞、更优选5～6×104个细胞。首选方法是将细胞悬液移植到脑中的立体定位脑手术(stereotaxic surgery)。此外，细胞移植也可通过显微外科手术进行。关于神经元组织移植的方法，可以参考Backlund等(Backlund等(1985)J.Neurosurg.62169-73)，Lindvall等(Lindvall等(1987)Ann.Neurol.22457-68)或Madrazo等(Madrazo等(1987)New Engl.J.Med.316831-4)的方法。
此外，本发明细胞还可用于分离多巴胺能神经元祖细胞的特异性基因及祖细胞成熟为多巴胺能神经元的各个阶段的特异性基因，探寻帕金森病治疗的靶标，阐明多巴胺能神经元的成熟过程，以及以成熟作为指标进行筛选。
基因表达水平的比较使用本发明的多核苷酸探针或抗体获得的多巴胺能神经元祖细胞可用做分离在该细胞中特异性表达的基因的材料。进一步，还可以研究和分离由分化、诱导或增殖本发明的多巴胺能神经元祖细胞而得的细胞中特异性表达的基因。此外，通过研究在分化/诱导/增殖的细胞中和原祖细胞中表达水平存在差异的基因，也可以调查被认为多巴胺能神经元体内分化必需的基因。这些基因可作为治疗由多巴胺能神经元缺陷引起的疾病的候选对象，因此确定与分离它们是极具价值的。
本发明的多巴胺能神经元祖细胞与由该祖细胞分化/诱导/增殖的细胞或其它细胞之间、或者分化/诱导/增殖的细胞与其它细胞之间的基因表达水平的比较，可采用常用的细胞原位杂交、Northern印迹杂交、RNA斑点印迹杂交、反转录PCR、RNA酶保护试验、DNA微阵列杂交、基因表达系列分析(SAGE；serial analysis of gene expression)(Velculescu等(1995)Science270484-487)，差减杂交(subtractive hybridization)和代表性差别分析(RDA)(Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-307)等方法。
在细胞原位杂交中，使用特定RNA序列的特异性标记探针与由细胞制备的总RNA或polyA+RNA杂交，可研究各种细胞中发生RNA加工、转运和细胞质定位的位置等。此外，RNA的大小可使用凝胶电泳等进行大小分级来测定。此外，使用定量荧光原位杂交(FISH)和数字成像显微镜可原位可视化RNA转录产物(Femino等(1998)Science 280585-90)，这些技术适用于本发明。
采用反转录PCR分析基因表达时，可粗略定量特定基因的表达情况。采用本方法，也可检测和分析同一RNA转录产物的各种同种型。反转录PCR方法中，首先使用外显子特异性引物进行反转录PCR反应，如果检出预期产物之外的扩增产物，则对这些产物进行分析，就能够鉴定选择性剪接产生的mRNA同种型。例如，可以参考Pykett等(1994)Hum.Mol.Genet.3559-64中记载的方法。当需要快速地进行粗略表达情况分析时，本发明的利用PCR的方法因迅速、灵敏、简便是特别优选的。
使用DNA芯片可以提高基因表达筛选的效率。这里，DNA芯片是指在玻璃等载体表面高密度固定了寡核苷酸、DNA克隆等的小型阵列。例如，为了进行多重表达筛选，可以将针对各目标基因的cDNA克隆或基因特异性的寡核苷酸固定在芯片上以制备微阵列。接下来，从本发明多巴胺能神经元祖细胞或由该祖细胞分化/诱导/增殖获得的细胞制备RNA，再经反转录酶处理得到cDNA。然后，将所得cDNA样品用荧光标记物或其它标记物标记，并与微阵列杂交。结果，在总标记cDNA中，细胞中表达活跃的基因所占比例变高，而未显著表达的基因所占比例变低。即，表示标记cDNA与芯片上cDNA克隆或寡核苷酸之间杂交的荧光信号强度，反映了标记cDNA中各序列的表达程度，这使得基因表达的定量成为可能。
此外，mRNA差异展示技术使用简并PCR引物进行反转录PCR，可以同时分析本发明的多巴胺能神经元祖细胞和由该祖细胞分化/诱导/增殖而获得的细胞中的多个基因的表达情况。首先，准备改变了指定mRNA的polyA尾3’端的一个或两个碱基的修饰oligo-dT引物，并对从本发明的多巴胺能神经元祖细胞或由该祖细胞分化/诱导/增殖而获得的细胞，及用于比较表达的对照细胞分离的总RNA进行反转录酶反应(Liang等(1993)NucleicAcids Res.213269-3275)。如果改变的碱基是“G”，那么可选择性扩增在polyA尾紧邻前方为“C”的mRNA；而如果改变的碱基是“CA”，则可选择性扩增在polyA尾紧邻前方为“TG”的mRNA。接下来，准备长约10个碱基的任意序列作为第二引物，使用上述修饰的oligo-dT引物和该第二引物进行PCR扩增反应。使用泳动距离长的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，从而将扩增产物按大小分级分离。采用这种方法，可检测出来源于分别在本发明的细胞和对照细胞中特异性表达的mRNA的cDNA，因其条带仅出现在一方的样品的电泳结果中。该方法还可用于分析未经鉴定的基因的表达。
SAGE可以同时检测多个转录产物的表达，且不需要特殊检测装置，是优选的分析方法之一。首先，采用标准方法从本发明的多巴胺能神经元祖细胞或由该祖细胞分化/诱导/增殖而获得的细胞中提取polyA+RNA。接下来，使用生物素化的oligo-dT引物将上述RNA转变为cDNA，然后用识别4碱基序列的限制性酶(锚定酶(anchoring enzyme)，AE)处理。这样，AE处理片段在其3’端带有生物素基团。接下来，使AE处理片段与链霉抗生物素蛋白结合，将结合的cDNA分成两部分，分别使各部分与不同的双链寡核苷酸衔接子(接头)A或B连接。这些接头的构成如下(1)突出的单链部分，它具有与经锚定酶作用形成的突出部分序列互补的序列；(2)作为标签酶(tagging enzyme，TE)的IIS-型限制性酶(在距离识别位点不超过20bp的固定位点酶切)的5’碱基识别序列；(3)充分满足构建PCR特异性引物需要的附加序列。这里，用标签酶酶切与接头连接的cDNA，这样仅有与接头结合的cDNA序列部分变成短序列的标签。然后，使具有不同接头的两种混合物相互连接，并用接头A和B特异的引物进行PCR扩增。结果，可获得扩增产物，其是含有可与接头A和B连接的两种连接序列标签(双标签，ditag)的多种序列的混合物。用锚定酶处理扩增产物，游离的双用通常的连接反应将标签部分相连成链状，然后进行克隆。测定克隆的碱基序列，可读出一定长度的连续双标签。这样测定了克隆的核苷酸序列，又获得了序列标签的信息，就可鉴定对应于每一种标签的mRNA的存在。
差减杂交常常用于克隆那些在多种组织或细胞中具有表达差异的基因，该方法同样可用于克隆在本发明的多巴胺能神经元祖细胞或由该祖细胞分化/诱导/增殖而获得的细胞中特异性表达的基因。首先，制备本发明的多巴胺能神经元祖细胞中的测试细胞DNA样品(以下称待试DNA)。然后，制备比照细胞的DNA(以下称驱动DNA)。待试DNA和驱动DNA可互换使用。任一种情况均是检测存在于待试DNA但不存在于驱动DNA中的基因。然后，将制备的待试DNA与过量的驱动DNA混合、变性使之成为单链DNA，随后退火。通过调节退火条件，可将不存在于驱动DNA中的特异性序列作为仅由待试DNA来源的DNA构成的双链DNA而分离出来。关于更详细方法，可以参考Swaroop等(1991)Nucleic Acids Res.191954和Yasunaga等(1999)Nature Genet.21363-9。
RDA方法是使用PCR选择性扩增不存在于驱动DNA中的待试DNA序列的方法，和上述其它方法一样，该方法也可应用于本发明。关于更为详细的步骤，可以参考Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-7和Schutte等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925950-4。
采用以上方法检测和分离出的多巴胺能神经元祖细胞或由该祖细胞分化/诱导/增殖而获得的细胞中的特异性基因，可采用上述的各种公知方法插入载体等，进行序列测定和表达分析。
以多巴胺能神经元祖细胞成熟为指标的筛选本发明提供筛选方法，该方法包括使被检物质与本发明的多巴胺能神经元祖细胞接触的步骤，以及检测由接触引起的该祖细胞的分化和增殖的步骤。采用这种筛选方法获得的化合物显示了在多巴胺能神经元的分化、增殖等方面的调节功能，其作为治疗由多巴胺能神经元缺陷引起的疾病的候选治疗对象，是非常有价值的。本发明的多巴胺能神经元祖细胞包括例如使用本发明的多核苷酸探针或抗体选择出的细胞、以及由这些细胞分化/诱导/增殖而获得的细胞。
这里，“被检物质”可以是任何类型的化合物、包括基因文库的表达产物、合成低分子化合物文库、合成肽文库、抗体、细菌释放物、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)提取液、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)培养上清、纯化或部分纯化的多肽、来源于海洋生物、植物或动物的提取物、土壤、随机噬菌体肽展示文库等。
通过与不与被检物质接触时的细胞状态相比较，可以检测细胞的分化和增殖。细胞分化和增殖的检测，可在显微镜下通过形态学观察完成，也可通过检测、定量细胞中产生的多巴胺等物质进行。
Lrp4的表达调控区分析Lrp4的表达调控区可利用Lrp4的基因序列采用公知的方法从基因组DNA克隆。例如，S1作图法这样的确定转录起始位点的方法(细胞工程，增刊8，新细胞工程实验方案，东京大学医科学研究所制癌研究部编，秀润社(1993)pp.362-374)是已知的，并可应用于本发明。通常，将基因5’端的15-100bp、优选30-50bp作为探针DNA，对基因组DNA文库进行筛选，可以克隆基因的表达调控区(在本发明中是SEQ ID NO1或2的全部或部分碱基)。以这种方式获得的克隆包含10kbp以上的5’非编码区，接下来可通过核酸外切酶处理将其截短或片段化。最后，对于截短的含有可能的表达调控区的部分序列，可以用报告基因评价其是否表达、表达的强度及调控等，从而确定维持Lrp4表达调控区活性的最小必要单元。
可以用Neural Network(http://www.fruitfly.org./seq_tools/promoter.html；Reese等，BiocomputingProceedings of the 1996 Pacific Symposium，Hunterand Klein ed.，World Science Publishing Co.，Singapore，(1996))等程序预测基因表达调控区。此外，预测表达调控区的最小活性单元的程序也是已知的(http://biosci.cbs.umn.edu./software/proscan/promoterscan.htm；Prestridge(1995)J.Mol.Biol.249923-32)，并可应用于本发明。
以这种方式分离的Lrp4基因表达调控区，可用于体内在多巴胺能神经元增殖祖细胞中特异性地产生所需的蛋白。
Lrp4的配体Lrp4多肽具有跨膜域，因此被认为在天然状态中是以包埋在细胞膜内的状态存在。Lrp4在多巴胺能神经元祖细胞中表达，因此被认为与多巴胺能神经元祖细胞的增殖调控及神经元的分化、成熟相关。因此，可能对Lrp4显示激动功能或拮抗功能的配体，可能可以用于体内、离体和体外调控多巴胺能神经元的分化。在鉴定Lrp4多肽的配体时，首先是使本发明多肽与候选化合物接触，检测其是否结合。此时，可使用固定在载体上的，或以包埋于细胞膜中的形式表达的Lrp4多肽。对于候选化合物没有具体限制，包括基因文库的表达产物、海洋生物来源的天然成分、各种细胞的提取物、已知化合物和肽、植物来源的天然成分、生物体组织提取物、微生物培养上清和通过噬菌体展示方法随机制备的肽群体(J.Mol.Biol.222301-10(1991))等。此外，候选化合物可以是带有标记的，以便于检测结合。
Lrp4的表达抑制通过本发明，已经明确Lrp4 mRNA在多巴胺能神经元增殖祖细胞中瞬时表达，因此Lrp4被认为与祖细胞的增殖调控及神经元的分化、成熟相关。因此，阻碍Lrp4基因表达的物质有望用于体内、离体和体外调控多巴胺能神经元的分化。阻碍基因表达的物质，包括例如反义核酸、核酶及双链RNA(small interfering RNA，siRNA)。因此，本发明提供这样的反义核酸、核酶及双链RNA。
抑制靶基因表达的反义机制包括(1)通过形成三股螺旋抑制转录起始，(2)通过在由RNA聚合酶形成的局部开环结构位点形成杂交体抑制转录，(3)合成过程中通过与RNA形成杂交抑制转录，(4)通过在内含子-外显子连接区形成杂交体抑制剪接、(5)通过在剪接体形成位点形成杂交抑制剪接，(6)通过与mRNA形成杂交体抑制mRNA迁移到细胞质，(7)通过与加帽部位或polyA添加部位形成杂交体抑制剪接、(8)通过与起始因子结合部位形成杂交体抑制翻译起始，(9)通过与核糖体结合部位形成杂交体抑制翻译，(10)通过与mRNA编码区或多核糖体结合部位形成杂交体抑制肽链延长、和(11)通过与核酸/蛋白质作用位点形成杂交体抑制基因表达(平岛和井上《新生物化学实验讲座2核酸IV基因的复制与表达》日本生化学会编，东京化学同人，pp.319-347(1993))。
本发明的Lrp4反义核酸可以是通过上述(1)-(11)的任何机制抑制基因表达的核酸，即该反义核酸不仅可包含针对要阻碍其表达基因的编码区序列的反义序列，还可包含针对非编码区序列的反义序列。可将编码反义核酸的DNA连接在允许其表达的合适的调控序列之下来使用。反义核酸只要能有效抑制靶基因表达，并非必须与该基因的编码区或非编码区完全互补。这种反义核酸的链长应至少在15bp，优选至少100bp，更优选至少500bp；且通常不超过3000bp，优选不超过2000bp，更优选不超过1000bp。这种反义核酸与目标基因转录产物的互补链优选具有至少90％、更优选至少95％的同一性。这种反义核酸可基于Lrp4多核苷酸，采用硫代磷酸酯法(Stein(1988)Nucleic Acid Res.163209-3221)制备。
“核酶”是带有RNA组分的催化剂的总称，大致可分为大核酶(largeribozyme)和小核酶(small ribozyme)。大核酶切断核酸的磷酸酯键，且反应后反应位点上保留5’-磷酸基和3’-羟基。大核酶又进一步分为(1)在5’-剪接位点进行鸟苷引发的转酯反应的第I组内含子RNA；(2)以经由套索结构的两步反应形式自剪接的第II组内含子RNA；及(3)通过水解反应在5’端酶切前体tRNA的RNA酶P的RNA成分。与此相对，小核酶是相对较小的结构单元(40bp左右)，切断RNA产生5’-羟基和2’-3’环磷酸。小核酶包括例如锤头型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225)和发卡型核酶(Buzayan(1986)Nature 323349；Kikuchi和Sassaki(1992)NucleicAcids Res.196571；菊地洋(1992)化学与生物30112)。核酶容易改变和合成，并且许多修饰方法均是公知的，例如通过将核酶底物结合部分设计成与靶位点附近的RNA序列互补，可获得识别和切割靶RNA中的碱基序列UC、UU或UA的锤头型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225；小泉诚和大冢荣子(1990)蛋白质核酸酶352191；Koizumi等(1989)NucleicAcid Res.177059)。发卡型核酶也可采用公知的方法设计和制备(Kikuchi和Sasaki(1992)Nucleic Acid Res.196571；菊地洋(1992)化学与生物30112)。
本发明的反义核酸和核酶可作为反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒等的病毒载体、利用脂质体等的非病毒载体、或裸DNA用于离体或体内基因治疗，从而调控细胞内的基因表达。
RNA干扰是指由向细胞内导入双链人工RNA引起的具有相同碱基序列的RNA的降解现象(Fire et al.(1998)Nature 391806-11)。本发明的siRNA只要阻碍Lrp4 mRNA的转录，没有特别限制。一般的，siRNA是针对目标mRNA的有义链和反义链的组合，其为最少10个碱基至与目标mRNA相同。优选15-75个、更优选18-50个、更优选20-25个核苷酸长。
为抑制Lrp4的表达，可采用公知的方法将siRNA导入细胞。例如，设计在一条链上编码构成siRNA的两条RNA链的DNA，将该DNA整合到表达载体中，用该表达载体转化细胞，即可以具有发卡结构的双链RNA的形式在细胞内表达siRNA。还设计了通过转染持续产生siRNA的质粒表达载体(例如RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector(BD Biosciences Clontech))。
siRNA的碱基序列，可使用例如Ambionwebsite(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.heml)的计算机程序设计。用于筛选功能性siRNA的试剂盒(例如，BD Knockout RNAiSystem(BD Biosciences Clontech))也已实现商品化，可以加以利用。
实施例以下通过实施例更详细地说明本发明，但是这些实施例并不在任何意义上限制本明。
实施例1 多巴胺能神经元祖细胞特异性基因的分离及序列分析为了分离多巴胺能神经元祖细胞特异性的基因，将E12.5鼠中脑腹侧部分沿着背腹方向进一步切分成两个部分，采用差减(N-RDA)法鉴定含有多巴胺能神经元的最腹侧区域中特异性表达的基因。分离的片段之一就是编码Lrp4/Corin的cDNA片段。Lrp4编码II型跨膜蛋白(图1)。
(1)N-RDA法(1-1)衔接子(adapter)的制备将下述的寡核苷酸退火，配制成100μM。
(ad2ad2S+ad2A、ad3ad3S+ad3A、ad4ad4S+ad4A、ad5ad5S+ad5A、ad13ad13S+ad13A)ad2Scagctccacaacctacatcattccgt(SEQ ID NO5)ad2Aacggaatgatgt (SEQ ID NO6)ad3Sgtccatcttctctctgagactctggt(SEQ ID NO7)ad3Aaccagagtctca(SEQ ID NO8)ad4Sctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt(SEQ ID NO9)ad4Aacacactcacag(SEQ ID NO10)ad5Sccagcatcgagaatcagtgtgacagt(SEQ ID11)ad5Aactgtcacactg(SEQ ID NO12)ad13Sgtcgatgaacttcgactgtcgatcgt(SEQ ID13)ad13Aacgatcgacagt(SEQ ID NO14)(1-2)cDNA合成从由日本SLC获得的小鼠的12.5天胚胎中切出中脑腹侧，进一步沿腹背方向切分成两个部分。使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)制备总RNA，使用cDNA合成试剂盒(TAKARA)合成双链cDNA。用限制性内切酶RsaI消化后，加入ad2，以ad2S为引物，用15个循环的PCR扩增cDNA。扩增条件是在72℃温育5分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行15循环，最后在72℃温育2分钟。N-RDA的PCR反应全部以如下组成的反应液进行10×ExTaq 5μl2.5mM dNTP4μlExTaq 0.25μl100μM引物0.5μlcDNA 2μl蒸馏水38.25μl(1-3)驱动方(Driver)的制作将用ad2S扩增的cDNA进一步用5个循环的PCR扩增。扩增条件是在94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行5个循环，最后在72℃温育2分钟。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA，RsaI消化。每次差减各使用3μg。
(1-4)待试方(Tester)的制作将用ad2S扩增的cDNA进一步用5个循环的PCR扩增。扩增条件是在94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行5个循环，最后在72℃温育2分钟。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA，RsaI消化。向60ng的经RsaI消化的cDNA中加入ad3。
(1-5)第一次差减将在上述3以及4中制作的待试方以及驱动方混合，乙醇沉淀后，溶解到1μl的1xPCR缓冲液中。98℃5分钟后，加入1xPCR缓冲液+1M NaCl1μl。进一步98℃5分钟后，使之在68℃杂交16小时。
将杂交的cDNA以ad3S为引物，用10个循环的PCR扩增后(在72℃温育5分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行10个循环)、用绿豆核酸酶(TAKARA)消化，用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。进一步用13个循环的PCR扩增。扩增条件是在94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行13个循环，最后在72℃温育2分钟。
(1-6)归一化向第一次差减中扩增的cDNA 8ng中加入1μl 2xPCR缓冲液。98℃5分钟后，加入1xPCR缓冲液+1M NaCl 2μl。进一步98℃5分钟后，使之在68℃杂交16小时。
将杂交的cDNA用RsaI消化，用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。以ad3S为引物，用11个循环的PCR扩增之后(94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行11个循环，最后在72℃温育2分钟)用RasI消化，加入ad4。
(1-7)第二次差减以上述6中加入了ad4的cDNA 20ng为待试方，与上述3的驱动方混合，进一步用与上述5同样的方法进行差减。最后向RsaI消化的cDNA中加入ad5。
(1-8)第三次差减以上述7中加入了ad5的cDNA 2ng为待试方，与上述3的驱动方混合，进一步用与上述5同样的方法进行差减。最后向RsaI消化的cDNA中加入ad13。
(1-9)第四次差减以上述8中加入了ad13的cDNA 2ng为待试方，与上述3的驱动方混合，然后用与上述5同样的方法进行差减。将扩增的cDNA克隆到pCRII(Invitrogen)，使用ABI3100测序仪分析碱基序列。
实施例2 Lrp4基因的表达分析接下来，用Lrp4基因，按照下面的方案进行原位杂交表达分析。
首先将小鼠12.5日胚胎用OCT包埋，制作厚度为16μm的新鲜冷冻切片。使之在载玻片上干燥后，用4％PFA在室温固定30分钟。用PBS清洗后，在65度杂交(1μg/ml DIG化的RNA探针、50％甲酰胺、5xSSC，1％SDS，50μg/ml酵母RNA，50μg/ml肝素)40小时。然后在65度清洗(50％甲酰胺、5xSSC，1％SDS)、在室温用RNA酶(5μg/ml RNA酶)处理5分钟。65度用0.2xSSC清洗，室温用1xTBST清洗之后，进行封闭(封闭试剂Roche)。使之与碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体(DAKO)反应，清洗(1xTBST、2mM Levamisole)后，以NBT/BCIP(DAKO)为底物使之显色。
通过原位杂交的表达分析结果显示，在作为多巴胺能神经元产生时期的E12.5中，Lrp4 mRNA在从中脑，到后脑、脊髓的腹侧中心部分特异性地表达。其从后脑到脊髓显示与Shh mRNA同样的表达模式，表明对于组织导体区即底板(floor plate)是特异的(图2及图5)。在中脑中，表达仅在Shh mRNA表达区域中更为中心的区域可见(图3以及5)。
根据与多巴胺的成熟标志物NCAM mRNA比较的结果，Lrp4 mRNA表达细胞是NCAM mRNA阴性的脑室区域(Ventricular Zone(VZ))内的增殖祖细胞。进一步与多巴胺能神经元的标志物TH mRNA比较，尽管由于TH mRNA仅在套层(mantle layer)中表达，不能在同一细胞中发现两者的表达，但两者在背-腹轴方向的表达范围完全一致(图3及图5)。我们知道，一般神经管(neural tube)内的神经细胞首先在VZ内增殖，在分化开始的同时停止分裂，然后移动到相邻外侧的ML后成熟。所以，可以认为多巴胺能神经元增殖祖细胞在TH表达区域的相邻内侧的VZ内增殖，分裂停止后移动到外侧，然后表达TH mRNA。也就是说，可以认为Lrp4 mRNA在中脑的多巴胺能神经元增殖祖细胞中特异性地表达(图4及图6)。
实施例3 从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元中Lrp4的表达下面研究在体外ES细胞诱导分化成多巴胺能神经元时是否表达Lrp4。
首先，通过SDIA法(Kawasaki et.al.(2000)Neuron 28(1)31-40)从ES细胞诱导分化多巴胺能神经元(参照图7上部)。分别在诱导后4、6、8、10、12天回收细胞，使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)回收总RNA，进行RT-PCR。RT-PCR中，最初对于1μg的总RNA，使用RNA PCR试剂盒(TaKaRa)进行cDNA合成。其中，将相当于10ng、1ng、0.1ng的cDNA用作模板，使用以下的反应体系进行PCR。
10×ExTaq 2μl2.5mM dNTP 1.6μlExTaq 0.1μl100μM引物 各0.2μlcDNA 1μl蒸馏水 14.9μl94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行35个循环，最后在72℃温育2分钟。
使用以下序列的引物。
Lrp4TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO15)/CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO16)THGTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG(SEQ ID NO17)/GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC(SEQ ID NO18)DATCTCCGAGCAGACACCATGACCTTAGC(SEQ ID NO19)/AGGAGTAGGGCTTGTCTCCCAACCTG(SEQ ID NO20)根据RT-PCR的表达分析的结果，Lrp4在ES细胞(CCE)以及基质细胞(PA6)中不表达，但诱导分化后，Lrp4与TH一样在第四天被诱导表达(图8)。所以，本发明的标志物多寡核苷酸探针作为标志物，不仅可用于分离胎儿中脑来源的多巴胺能神经元增殖祖细胞，还可用于分离在体外从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
实施例4 Lrp4蛋白质的表达分析以下使用Lrp4基因中编码胞外区域的基因序列，通过以下方案制备抗Lrp4抗体，通过免疫组织染色进行表达分析。
首先，将Lrp4基因中编码胞外区域(161-502氨基酸)的基因序列基因导入293E细胞，表达并回收Lrp4蛋白质的胞外部分。将回收的蛋白质免疫仓鼠后，取出淋巴细胞使之与骨髓瘤细胞融合。培养融和细胞，得到其培养上清液。接着将小鼠12.5日胚胎在4℃用4％PFA/PBS(-)固定2小时后，在4℃用20％蔗糖/PBS(-)置换过夜，再用OCT包埋。制作厚度为12μm的切片，贴到载玻片上，在室温干燥30分钟，再次用PBS(-)润湿。然后在室温进行封闭(10％正常猴血清、10％正常山羊血清/Block Ace)20分钟后，使之与制作的抗Lrp4单克隆抗体(混合FERM BP-10315、FERM BP-10316使用(每份1/4稀释的培养上清，10％正常猴血清，10％正常猴血清，2.5％Block Ace/PBS))以及抗TH抗体(Chemicon，0.7μg/ml，10％正常猴血清；10％正常山羊血清；2.5％Block Ace/PBS)在室温反应1小时后，进一步在4℃反应过夜。在0.1％Triton X-100/PBS(-)中，室温进行4次10分钟的清洗。使之与Cy3标记抗仓鼠IgG抗体、FITC标记抗小鼠IgG抗体(Jackson、10μg/ml、10％正常猴血清；10％正常山羊血清；2.5％Block Ace/PBS)在室温反应1小时，同样进行清洗后，用PBS(-)室温清洗10分钟，封装。
根据使用制备的抗Lrp4单克隆抗体的免疫组织染色的表达分析结果，如原位杂交的表达分析结果那样，在处于多巴胺能神经元产生时期的E12.5中，发现了Lrp4在中脑腹侧的表达(图8)。与多巴胺能神经元的标志物TH蛋白质的表达相比较，Lrp4蛋白质在表达TH蛋白质的中脑最腹侧的VZ侧表达，所以可以认为Lrp4蛋白质是在多巴胺能神经元祖细胞中表达。
接着，使用抗Lrp4单克隆抗体，通过流式细胞术进行Lrp4表达细胞的检测。
首先，用SDIA法在体外从ES细胞诱导分化多巴胺能神经元祖细胞。将含有该组细胞的细胞群用细胞分散缓冲液(Invitrogen)分散后，不经过固定、渗透处理，直接用抗Lrp4单克隆抗体(混合FERM BP-10315、FERMBP-10316使用(每份1/4稀释的培养上清、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基))在4℃染色20分钟。然后用1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基在4℃进行3次3分钟的清洗，用生物素标记的抗仓鼠IgG抗体(Jackson，10μg/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/SDIA分化培养基)在4℃染色20分钟，同样清洗后，用PE标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen、20μg/ml、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基)在4℃染色20分钟，同样清洗。染色后，在流式细胞仪上检测Lrp4表达细胞。
根据使用制备的抗Lrp单克隆抗体通过流式细胞术检测表达细胞的结果，检测出了表达Lrp4蛋白质的群体(图9)。因为未经固定、渗透处理即能检测出Lrp4蛋白质表达细胞，所以可以认为通过使用带有细胞分选仪的流式细胞仪分离活细胞状态的Lrp4蛋白质表达细胞。Lrp4蛋白质被认为在多巴胺能神经元祖细胞中表达，所以可以认为抗Lrp4抗体对于多巴胺能神经元祖细胞的分离是有用的。
实施例5 用抗体分离Lrp4表达细胞下面，分析用抗Lrp4抗体分离的Lrp4蛋白质阳性细胞的性质。
首先，采取与实施例4同样的方法用抗Lrp4抗体将E12.5小鼠胎儿中脑腹侧区域以及含有用SDIA法在体外从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群染色，通过细胞分选仪分离Lrp4阳性细胞和阴性细胞。分离后立即从分离的细胞用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)回收总RNA，合成cDNA，用与实施例1同样的方法扩增cDNA用作RT-PCR的模板。将相当于4ng、0.4ng、0.04ng扩增cDNA的cDNA作为模板，用以下反应体系进行PCR。
10×ExTaq 1μl2.5mM dNTP 0.8μlExTaq 0.05μl100μM引物 各0.1μlcDNA 1μl蒸馏水 6.95μl94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行26个循环，最后在72℃温育2分钟。
Lrp4TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO15)/CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO16)THGTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG(SEQ ID NO17)/GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC(SEQ ID NO18)NurrlCACTCCTGTGTCTAGCTGCCAGATGC(SEQ ID NO21)/AGTGCGAACACCGTAGTGCTGACAGG(SEQ ID NO22)
巢蛋白GATGAAGAAGAAGGAGCAGAGTCAGG(SEQ ID NO23)/ATTCACTTGCTCTGACTCCAGGTTGG(SEQ ID NO24)MAP2CCATGATCTTTCCCCTCTGGCTTCTG(SEQ ID NO25)/TTTGGCTGGAAAGGGTGACTCTGAGG(SEQ ID NO26)RT-PCR的表达分析结果正如预想的那样，发现了增殖祖细胞标志物巢蛋白的表达，还发现Lrp4蛋白质阳性细胞集团中含有表达分裂停止后的标志物MAP2的细胞(图10)。所以，这表明Lrp4蛋白质的表达在mRNA的表达停止后仍可持续，Lrp4蛋白质作为标记物不仅可用于分离多巴胺能神经元增殖祖细胞，而且可用于分离分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞(图11)。此外，与Lrp4阴性集团相比，作为分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞标志物的Nurrl和TH高水平表达，这证明了Lrp4阳性细胞确实是多巴胺能神经元系的祖细胞(图10)。
下面研究用Lrp4抗体分离的Lrp4蛋白质阳性细胞集团中含有的增殖祖细胞和分裂停止后前体细胞的比例。
将分离的细胞接种在包被了聚-L-鸟氨酸(Sigma，PBS中，0.002％)、层粘连蛋白(Invitrogen，PBS中，5μg/ml)和纤连蛋白(Sigma，PBS中，5μg/ml)的载玻片上，在37℃、N2(Invitrogen、1x)、B27(Invitrogen、1x)、抗坏血酸(Sigma，200μM)BDNF(Invitrogen，20ng/ml)/SDIA分化培养基中温育40分钟使之贴壁。贴壁的细胞用4％PFA/PBS在4℃固定20分钟，用PBS在4℃进行2次10分钟的洗涤。然后，用0.3％TritonX-100/PBS在室温进行15分钟的渗透处理，用10％正常猴血清/Block Ace在室温进行20分钟的封闭。接着，用抗巢蛋白抗体(Chemicon，2μg/ml，10％正常猴血清，2.5％Block Ace，0.1％Triton X-100/PBS)、抗βIII-微管蛋白抗体(BABCO、1/2000、0.5μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应1小时、接着4℃反应过夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室温进行3次5分钟的清洗后，与FITC标记的抗小鼠IgG抗体、Cy5标记的抗兔IgG抗体(均为Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应30分钟。然后同样进行清洗，用PBS在室温洗涤5分钟，封固观察。
将分离的细胞同样接种在载玻片上，在向上述培养基中添加了BrdU(Roche；5-溴-2’-脱氧-尿苷标记和检测试剂盒II，1x)的培养基中，37℃培养18小时后，同样进行上述步骤直到封闭，使之与2N HCl在37℃反应20分钟，然后用PBS清洗3次，与抗BrdU抗体、DNA酶(Roche；5-溴-2’-脱氧-尿苷标记和检测试剂盒II，1x，1x浓度，于温育缓冲液中)在37℃反应30分钟。进一步与抗BrdU抗体(Sigma、44μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应1小时，接着在4℃反应过夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室温进行3次5分钟的清洗后，与FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、2.5％BlockAce、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应30分钟。然后同样进行清洗、封固、观察。
并且，标志物染色的结果证明，大多数Lrp4阳性细胞是巢蛋白阳性的增殖祖细胞，其中一部分细胞为分裂停止后标志物βIII-微管蛋白阳性(图12)。而且确认了分离的细胞高频率地摄入BrdU，并实际地在体外增殖(图13)。
接着确认分离的Lrp4阳性细胞分化成多巴胺能神经元。
将分离的细胞接种在包被了聚-L-鸟氨酸(Sigma，PBS中，0.002％)、层粘连蛋白(Invitrogen，PBS中，5μg/ml)和纤连蛋白(Sigma，PBS中，5μg/ml)的载玻片上，在37℃、N2(Invitrogen、1x)、B27(Invitrogen、1x)、抗坏血酸(Sigma、200μM)BDNF(Invitrogen、20ng/ml)、bFGF(R&D、10ng/ml)/SDIA分化培养基中温育24小时。然后用不含bFGF的上述培养基再培养6天。将培养的细胞用4％PFA/PBS在4℃固定20分钟，用PBS在4℃进行2次10分钟的洗涤。然后，用0.3％Triton X-100/PBS在室温进行15分钟的渗透处理，用10％正常猴血清/Block Ace在室温进行20分钟的封闭。接着，用抗TH抗体(Chemicon；0.3μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)、抗βIII-微管蛋白抗体(BABCO、1/2000、0.5μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应1小时、接着4℃反应过夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室温进行3次5分钟的清洗后，与FITC标记的抗小鼠IgG抗体、Cy5标记的抗兔IgG抗体(二者都为Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、2.5％BlockAce、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应30分钟。然后同样进行清洗，用PBS在室温洗涤5分钟，封固观察。
与对照即未分离的细胞相比，分离的细胞在体外培养的结果是明显诱导了更多TH蛋白质阳性的多巴胺能神经元。所以，这证明了Lrp4细胞确实是多巴胺能神经元系的祖细胞，且可以体外成熟(图14)。
实施例6 向帕金森病模型小鼠纹状体移植分离的Lrp4蛋白质阳性细胞。
使用抗Lrp4单克隆抗体，用流式细胞术分离Lrp4表达细胞，将该细胞移植到帕金森病模型小鼠纹状体中。
首先，用SDIA法在体外从ES细胞诱导分化多巴胺能神经元祖细胞，将含有该祖细胞的细胞群用细胞分散缓冲液(Invitrogen)分散后，不经过固定、渗透处理，在4℃用在实施例4中制备的抗Lrp4单克隆抗体(混合使用FERM BP-10315、FERM BP-10316(每份1/4稀释的培养上清、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基))在4℃染色20分钟。然后用1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基在4℃进行3次3分钟的清洗，用生物素标记的抗仓鼠IgG抗体(Jackson；10μg/ml、1％胎牛血清、1mMEDTA/SDIA分化培养基)在4℃染色20分钟，同样清洗后，用PE标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen、20μg/ml、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基)在4℃染色20分钟，同样清洗。染色后，在流式细胞仪上分离出Lrp4表达细胞。
接着，将分离的Lrp4蛋白质阳性细胞移植到帕金森病模型小鼠纹状体，分析脑内的Lrp4蛋白质阳性细胞的性质。
首先，通过向12周龄的小鼠(slc)的单侧的前脑内侧束(medial forebrainbundle)中注入1.25μl的6-OHDA(Sigma；2μg/μl)，杀灭从中脑投射到纹状体的多巴胺能神经元来制备帕金森病模型小鼠。模型小鼠制作后第二周，向每只鼠的注入了6-OHDA一侧的纹状体中移植3×104个Lrp4蛋白质阳性细胞。移植的Lrp4蛋白质阳性细胞是这样制备的将基因导入ES细胞使得EGFP基因在CAG启动子(Niwa等.(1991)Gene.108193-200)控制下表达；用SDIA法在体外将该ES细胞诱导分化为多巴胺能神经元祖细胞；用实施例4相同的方法用抗Lrp4抗体对含有该祖细胞的细胞群体进行染色，并通过细胞分选仪分选而得。
移植后第三周，腹腔内给与500μl 10％溶于盐水的鸟拉坦进行麻醉，麻醉起效后开胸，从左心室注入生理盐水(大冢)30ml灌注后，用4％PFA/PBS(-)30ml灌注固定(perfusion-fix)。固定后取出脑，进一步在4％PFA/PBS(-)中浸渍固定8小时。然后切成2mm厚的片，在20-40％蔗糖/PBS(-)中置换过夜，包埋到OCT中。制备厚度为10-12μm的切片，贴到载玻片上后，在室温干燥30分钟，再次用PBS(-)湿润。然后在室温封闭(10％正常猴血清/BlockAce)20分钟，与抗GFP抗体(Molecular probes、20μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)、抗MAP2抗体(Sigma、小鼠腹水、100倍稀释、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)或者抗TH抗体(Chemicon、1μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)在室温反应1小时后，进一步4℃反应过夜。然后用0.1％Triton X-100/PBS(-)在室温进行四次清洗，每次10分钟。接着，与Alexa Fluor488标记的抗兔IgG抗体(Molecular Probes；4μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)、Cy3标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)或者Cy5标记的抗绵羊IgG抗体(Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)在室温反应1小时后，同样进行清洗，用PBS(-)在室温清洗十分钟，封固。
并且，通过免疫组织染色进行各种标志物的表达分析。
其结果首先在移植的小鼠的纹状体内发现了EGFP阳性细胞(表1)。由此，可以认为移植的Lrp4蛋白质阳性细胞在帕金森病模型小鼠的纹状体中植活。
而且也确认了植活的绝大多数细胞都是成熟神经元标志物MAP2阳性的，EGFP阳性的轴突在纹状体内伸展较长(表1以及图16)。
表1

(表1表示移植的Lrp4阳性细胞在体内向TH阳性细胞分化的情况。在以6-OHDA破坏#6小鼠及#7小鼠的多巴胺能神经元2周后移植Lrp4蛋白质阳性细胞，在移植后三周灌注。)由此可见，移植的Lrp4蛋白质阳性细胞是神经祖细胞，相对于此，大多数植活的细胞都分化以及成熟为成熟的神经细胞。而且这些植活的细胞中约有20％是TH阳性，这强烈地暗示移植的Lrp4蛋白质阳性细胞的至少一部分分化成了多巴胺能神经元。
所以，根据本发明分离的多巴胺能神经元祖细胞通过移植到脑内可能分化成多巴胺能神经元，可以认为根据本发明分离的多巴胺能神经元祖细胞对于治疗是有效的。
实施例7 采用5阶段法从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元中Lrp4的表达研究使用5阶段法在体外将ES细胞诱导分化成多巴胺能神经元时Lrp4是否表达。
首先，通过5阶段法(Lee et.al.(2000)Nat.Biotech.18675-679)，小鼠多巴胺能神经元分化试剂盒(R&D systems))从ES细胞(CCE)诱导分化多巴胺能神经元。分别在阶段1的第2天、阶段2的第4天、阶段3的第6天、阶段4的第4、6天、阶段5的第4、7天回收细胞，用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)回收总RNA，进行RT-PCR。在RT-PCR中，最初相对于1μg的总RNA，使用RNA PCR kit(TaKaRa)进行cDNA合成。将其中相当于10ng、1ng、0.1ng的cDNA用作模板，用以下反应体系进行PCR。
10×ExTaq 2μl2.5mM dNTP1.6μlExTaq 0.1μl100μM引物各0.2μlcDNA 1μl蒸馏水14.9μl94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行32个循环，最后在72℃温育2分钟。
使用以下序列的引物。
Lrp4TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO15)/CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO16)THGTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG(SEQ ID NO17)/GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC(SEQ ID NO18)RT-PCR的表达分析结果证明，Lrp4在未分化的ES细胞状态的阶段1中不表达，但是在产生多巴胺能神经元祖细胞的阶段4中被诱导表达(图17A)。
接着，在采用5阶段法在体外使ES细胞诱导分化成多巴胺能神经元的情况下，使用抗Lrp4单克隆抗体通过流式细胞仪检测了Lrp4表达细胞。
首先，用细胞分散溶液Accumax(Innovative Cell Technologies，Inc.)分散含有采用5阶段法在体外从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群(阶段4、第7天)后，不经过固定、渗透处理，用抗Lrp4单克隆抗体(混合FERM BP-10315、FERM BP-10316使用(每份1/2稀释的培养上清)在4℃染色20分钟。然后用1％胎牛血清、1mM EGTA、4.5mg/ml葡萄糖、40ng/ml DNA酶I/不含Ca·Mg的Hanks’平衡盐溶液(HBSS-)在4℃进行3次3分钟的清洗，用PE标记的抗仓鼠IgG抗体(8μg/ml(BDBioscience)、1％胎牛血清、1mM EGTA、4.5mg/ml葡萄糖、40ng/ml DNA酶I/不含Ca·Mg的Hanks’平衡盐溶液(HBSS-))在4℃染色30分钟，同样清洗。染色后，在流式细胞仪上检测Lrp4表达细胞。
根据使用抗Lrp4单克隆抗体的流式细胞术检测Lrp4表达细胞的结果，在含有采用5阶段法在体外从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群中，检出了表达Lrp4蛋白质的集团(图17B)。所以不仅是SDIA法，采用5阶段法从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞同样表达Lrp4，可以认为其作为细胞分离的标志物是有价值的。
实施例8 使用抗体分离的Lrp4表达细胞在体外分化成熟研究使用抗Lrp4抗体分离的Lrp4蛋白质阳性细胞在体外是否分化成多巴胺能神经元。
对含有用5阶段法在体外从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群，采取与实施例4相同的方法用抗Lrp4抗体进行染色，并通过细胞分选仪分离Lrp4阳性细胞。将分离的细胞接种在包被了聚-L-鸟氨酸(Sigma，PBS中，0.002％)和纤连蛋白(Sigma，PBS中，5μg/ml)的载玻片上，在N2(Invitrogen、1x)、抗坏血酸(Sigma、200μM)BDNF(R&DSystems，20ng/ml)/DMEM/F12中37℃温育七天。然后，将培养的细胞用2％PFA、0.15％苦味酸/PBS在4℃固定20分钟，用PBS在4℃进行2次10分钟的洗涤。然后，用0.3％Triton X-100/PBS在室温进行30分钟的渗透处理，用10％正常猴血清、10％正常山羊血清/Block Ace在室温进行20分钟的封闭。接着，用抗TH抗体(Chemicon；0.4μg/ml、10％正常猴血清、10％正常山羊血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)、抗MAP2抗体(Sigma；腹水1/200；10％正常猴血清、10％正常山羊血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室温反应1小时、接着4℃反应过夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室温进行4次10分钟的清洗后，与FITC标记的抗小鼠IgG抗体、Cy3标记的抗兔IgG抗体(二者均为Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、10％正常山羊血清、2.5％Block Ace、0.1％TritonX-100/PBS)在室温反应30分钟。然后同样进行清洗，用PBS在室温洗涤5分钟，封固观察。
在体外培养Lrp4阳性细胞的结果是TH蛋白质阳性的大多数多巴胺能神经元被诱导(图17C)，所以，表明采用5阶段法诱导的Lrp4阳性细胞是多巴胺能神经元祖细胞，并可在体外成熟。Lrp4在通过两种不同的分化方法(SDIA法、5阶段法)诱导的多巴胺能神经元祖细胞之中均表达，使用抗Lrp4抗体可以分离任何一种多巴胺能神经元祖细胞。由于这些原因，Lrp4被认为可以有效地用作多巴胺能神经元祖细胞标志物，而与其细胞来源无关。而且，5阶段法不需与动物来源的细胞以及成分接触即能够分化诱导多巴胺能神经元祖细胞，其临床应用值得期待。Lrp4在该方法中用作细胞分离标志物，可以认为将其应用于包括帕金森病在内的神经变性疾病的移植治疗的可能性很高。
实施例9 通过使用抗Lrp4抗体对多巴胺能神经元祖细胞进行分离而除去未分化的ES细胞制备来源于ES细胞的移植细胞时，在安全性方面最重要的就是除去会造成畸胎瘤的未分化ES细胞。因为Lrp4在未分化的ES细胞中不表达(实施例3)，所以有望使用Lrp4作标志物进行分离除去未分化的ES细胞。为了确认这一点，利用RT-PCR，通过检测ES细胞特异性基因Eras(Nature.2003 423(6939)541-5)以及Nanog(Cell.2003 113(5)631-42.)的表达，来研究采用SDIA法在体外从ES细胞诱导分化的细胞用Lrp4抗体分离后，所得的细胞中是否含有未分化的ES细胞。
首先，用与实施例5同样的方法，在含有通过SDIA法在体外从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群中，通过细胞分选仪分离Lrp4阳性细胞以及阴性细胞。分离后立即从分离的细胞回收总RNA，制备扩增cDNA，将相当于4ng、0.4ng、0.04ng的cDNA用作模板，用以下反应体系进行PCR。
10×ExTaq 1μl2.5mM dNTP 0.8μlExTaq 0.05μl100μM引物 各0.1μlcDNA 1μl蒸馏水 6.95μl94℃温育2分钟后，将94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的反应进行26个循环(Lrp4，巢蛋白)或者30个循环(Eras，Nanog)，最后在72℃温育2分钟。
使用以下序列的引物(Lrp4和巢蛋白在实施例5中记载)ERasTGCTCTCACCATCCAGATGACTCACC(SEQ ID NO27)/TGGACCATATCTGCTGCAACTGGTCC(SEQ ID NO28)NanogTCCAGCAGATGCAAGAACTCTCCTCC(SEQ ID NO29)/TTATGGAGCGGAGCAGCATTCCAAGG(SEQ ID NO30)其结果是在Lrp4阳性细胞集团中，没有发现ES细胞特异表达的ERas以及Nanog的表达，而另一方面在Lrp4阴性集团中检测到了ERas以及Nanog的表达(图18)。由此表明，通过使用Lrp4的细胞分离，能够除去采用SDIA法分化诱导的细胞中含有的未分化ES细胞。
产业上应用的潜能本发明确定了Lrp4是在多巴胺能神经元增殖祖细胞中特异的、且瞬时表达的基因。更加详细的关于其表达的研究结果确认，Lrp4 mRNA在多巴胺能神经元增殖祖细胞、Lrp4蛋白在包含分裂停止前后的细胞的多巴胺能神经元祖细胞中分别特异地表达。因而，以细胞中该Lrp4 mRNA或者Lrp4多肽的表达为指标，能够选择出在安全性、存活率以及网络形成能力方面均适于包括帕金森病在内的神经变性疾病的移植治疗的多巴胺能神经元系细胞。像本发明这样，以Lrp4作为标志物获取细胞时，即使是用于需要成熟细胞的治疗等情形，仍然能够容易地在体外使之分化至适宜状态。而且，使用本发明的方法获得的多巴胺能神经元祖细胞，可以分离该细胞中特异性表达的基因。进一步，可以认为该细胞在开发针对帕金森病等神经变性疾病的药物方面也是有价值的。尤其是，以Lrp4mRNA为指标获得的多巴胺能神经元增殖祖细胞是处于神经元形成初期的祖细胞，它们可用来阐明神经元的成熟过程，即与成熟过程相关的各种因子的作用。这些因子的阐明有望对神经变性疾病的治疗作出巨大贡献。更进一步，以该细胞的成熟为指标，还能够筛选调节(抑制或者促进)该过程的物质。
序列表<110>卫材株式会社(EISAI CO.，LTD.)<120>Lrp4/Corin多巴胺能神经元祖细胞标志物<140>PCT/JP05/013453<141>2005-07-22<150>JP2004-213743<151>2004-07-22<150>JP2004-315060<151>2004-10-29<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4864<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>1ctagtcccca ggcagacggt ccctcactcc tgtggcttgg cgtcggagac gctggcagtc 60atgggcaggg tttccttcag cgttcgggtc agctccgtgc ggagagcccg ctgctcttgt 120cctgggcgat gctacctctc ctgcagagtc cctccaacca ccgccctccg tgcactgaac 180ggtcttggct gcgcgggggt tccgggggag actgcaggtg gagccgtcgg acccggcccc 240ttggggaccc gtggcttcct ctccgggtcc aagttccagg ctcccggcag ctggaaggat 300tgctttggag ccccgcctgc tccagacgtc ttgagagcag acaggagcgt gggcgagggc 360tgtcctcaga agctggtgac tgctaacttg ctgcgcttcc tcctgctggt gctcatcccc 420tgcatctgcg ccctcatcgt gctgctggcc atcctgctgt cctttgtggg aacattaaaa 480agggtttatt tcaaatcaaa tgacagtgaa cctttggtca ctgatgggga agctcgagtg 540cctggtgtta ttcctgtaaa tacagtttat tatgagaaca caggggcgcc ctctctgccc 600cccagccagt ccactccagc ctggacaccg agagctcctt ctccagagga ccagagtcac 660aggaacacaa gcacctgcat gaacatcact cacagccagt gtcaaattct gccctaccac 720agcacgttgg cacctctctt gccaattgtc aaaaacatgg acatggagaa gttcctcaag 780ttcttcacgt acctccatcg cctcagttgc tatcaacata tcctgctctt cggctgtagc 840ctcgccttcc ctgagtgcgt tgttgatggc gatgacaggc atggtcttct accctgtaga 900tctttctgtg aggctgcaaa agaaggatgc gaatctgtcc tgggaatggt gaactcctcc 960tggccggatt ccctcagatg ctctcagttt agggaccaca ctgagactaa cagcagtgtc 1020
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Tyr Trp Ser Asp Ser Thr Leu His Arg Ile Ser Arg Ala Asn Leu104010451050Asp Gly Ser Gln His Glu Asp Ile Ile Thr Thr Gly Leu Gln Thr105510601065Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Ala Ile Gly Arg Lys Val Tyr Trp107010751080Thr Asp Thr Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Gly Asn Leu Asp Gly108510901095Ser Met Arg Lys Val Leu Val Trp Gln Asn Leu Asp Ser Pro Arg110011051110Ala Ile Val Leu Tyr His Glu Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp111511201125Trp Gly Glu Asn Ala Lys Leu Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser113011351140Asp Arg Ala Val Leu Ile Asn Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly114511501155Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala116011651170His Thr Glu Arg Ile Glu Ala Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg117511801185His Thr Leu Val Ser Pro Val Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu119011951200Leu Asp Ser Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile120512101215His Arg Ala Asp Lys Gly Thr Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg122012251230Ser Asn Leu Pro Gly Leu Met Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala123512401245Gln Pro Leu Gly Phe Asn Lys Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys125012551260
Ser His Leu Cys Leu Pro Arg Pro Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys126512701275Pro Thr Gly Ile Gln Leu Lys Gly Asp Gly Lys Thr Cys Asp Pro128012851290Ser Pro Glu Thr Tyr Leu Leu Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg129513001305Arg Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asp His Thr Asp Val His Val Pro131013151320Val Pro Glu Leu Asn Asn Val Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val132513301335Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Thr Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg134013451350Arg Ala Asp Leu Asn Gly Ser Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg135513601365Gly Leu Lys Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg137013751380Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser138513901395Arg Leu Asp Gly Ser Cys Arg Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu140014051410Asp Glu Pro Arg Ala Ile Ala Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu141514201425Phe Trp Thr Asp Trp Gly His Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn143014351440Leu Asp Gly Ser Glu Arg Lys Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly144514501455Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr146014651470Trp Val Asp Ala His Leu Asp Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn
147514801485Gly Lys Leu Arg Gln Val Leu Val Ser His Val Ser His Pro Phe149014951500Ala Leu Thr Gln Gln Asp Arg Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln150515101515Thr Lys Ser Ile Gln Arg Val Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys152015251530Glu Thr Val Leu Ala Asn Val Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val153515401545Val Ser Pro Gln Arg Gln Thr Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn155015551560Asn Gly Gly Cys Thr His Leu Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe156515701575Val Cys Ala Cys Pro Asp Glu Pro Asp Ser Arg Pro Cys Ser Leu158015851590Val Pro Gly Leu Val Pro Pro Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser159516001605Glu Lys Ser Pro Val Leu Pro Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr161016151620Ser Ser Thr Thr Arg Thr Arg Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly1625 16301635Arg Cys Ser Glu Arg Asp Ala Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser164016451650Asn Asp Ala Val Pro Ala Ala Pro Gly Glu Gly Leu His Ile Ser165516601665Tyr Ala Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ile Leu Leu Ile Leu Val Val167016751680Ile Ala Ala Leu Met Leu Tyr Arg His Lys Lys Ser Lys Phe Thr168516901695
Asp Pro Gly Met Gly Asn Leu Thr Tyr Ser Asn Pro Ser Tyr Arg170017051710Thr Ser Thr Gln Glu Val Lys Ile Glu Ala Ile Pro Lys Pro Ala171517201725Met Tyr Asn Gln Leu Cys Tyr Lys Lys Glu Gly Gly Pro Asp His173017351740Asn Tyr Thr Lys Glu Lys Ile Lys Ile Val Glu Gly Ile Cys Leu174517501755Leu Ser Gly Asp Asp Ala Glu Trp Asp Asp Leu Lys Gln Leu Arg176017651770Ser Ser Arg Gly Gly Leu Leu Arg Asp His Val Cys Met Lys Thr177517801785Asp Thr Val Ser Ile Gln Ala Ser Ser Gly Ser Leu Asp Asp Thr179017951800Glu Thr Glu Gln Leu Leu Gln Glu Glu Gln Ser Glu Cys Ser Ser180518101815Val His Thr Ala Ala Thr Pro Glu Arg Arg Gly Ser Leu Pro Asp182018251830Thr Gly Trp Lys His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Glu Ser Gln Val183518401845<210>5<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>5cagctccaca acctacatca ttccgt 26<210>6<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>6acggaatgat gt 12<210>7<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>7gtccatcttc tctctgagac tctggt 26<210>8<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>8accagagtct ca 12<210>9<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>9ctgatgggtg tcttctgtga gtgtgt 26<210>10<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>10acacactcac ag 12<210>11<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>11ccagcatcga gaatcagtgt gacagt 26<210>12<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>12actgtcacac tg 12<210>13<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>13gtcgatgaac ttcgactgtc gatcgt 26<210>14<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的衔接子序列<400>14acgatcgaca gt 12<210>15<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>15tagtctacca ctgctcgact gtaacg 26<210>16<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列<400>16cagagtgaac ccagtggaca tatctg 26<210>17<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>17gttcccaagg aaagtgtcag agttgg 26<210>18<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>18gaagctggaa agcctccagg tgttcc 26<210>19<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>19ctccgagcag acaccatgac cttagc 26<210>20<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>20aggagtaggg cttgtctccc aacctg 26<210>21<211>26<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>21cactcctgtg tctagctgcc agatgc 26<210>22<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>22agtgcgaaca ccgtagtgct gacagg 26<210>23<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>23gatgaagaag aaggagcaga gtcagg 26<210>24<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>24attcacttgc tctgactcca ggttgg 26<210>25<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>25ccatgatctt tcccctctgg cttctg 26<210>26<211>26
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>26tttggctgga aagggtgact ctgagg 26<210>27<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>27tgctctcacc atccagatga ctcacc 26<210>28<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>28tggaccatat ctgctgcaac tggtcc 26<210>29<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>29tccagcagat gcaagaactc tcctcc 26<210>30<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>30ttatggagcg gagcagcatt ccaagg 2权利要求
1.多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物多核苷酸探针，其包含选自以下(1)到(5)的碱基序列中的序列(1)与SEQ ID NO1或2的碱基序列互补的碱基序列；(2)与编码SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列；(3)与编码在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的序列的碱基序列互补的碱基序列；(4)在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列构成的多核苷酸杂交的碱基序列；(5)包含上述(1)-(4)的序列中至少15个连续的碱基的碱基序列。
2.选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，该方法包括使被认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞样品与权利要求1的多核苷酸探针相接触的步骤。
3.选择多巴胺能神经元系细胞的方法，包括以下步骤采用权利要求2的选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法选择多巴胺能神经元增殖祖细胞；培养在上述(1)中选出的增殖祖细胞；利用分裂停止后的多巴胺能神经元的标志物对上述(2)中培养的细胞进行筛选。
4.采用权利要求2的方法选择出的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
5.分离多巴胺能神经元增殖祖细胞特异性基因及从增殖祖细胞到多巴胺能神经元的各成熟阶段的特异性基因的方法，该方法包括使用权利要求4的增殖祖细胞或者由该增殖祖细胞经分化、诱导或增殖所得的细胞，检测、分离在该细胞中特异性表达的基因的步骤。
6.以成熟为指标筛选调节多巴胺能神经元系细胞的增殖及/或分化的化合物的方法，该方法包括使被检验物质与权利要求4的增殖祖细胞或者由该增殖祖细胞经分化、诱导或增殖而得的细胞相接触的步骤，以及检测由接触所引起的增殖祖细胞或祖细胞的变化的步骤。
7.针对选自以下(1)-(6)的多肽的抗体(1)由SEQ ID NO1或2的碱基序列构成的多核苷酸所编码的多肽；(2)包含SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的多肽；(3)包含在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的氨基酸序列的多肽；(4)包含在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸缺失、插入、替换或添加的氨基酸序列的多肽；(5)由可在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列的互补序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽；(6)作为上述(1)-(5)的多肽的片段，且至少具有8个氨基酸残基的多肽。
8.权利要求7的抗体，其由杂交瘤FERM BP-10315或FERM BP-10316产生。
9.多巴胺能神经元祖细胞标志物抗体，其包含权利要求7或8的抗体。
10.选择多巴胺能神经元祖细胞的方法，该方法包括使被认为含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品与权利要求7-9任一项的抗体接触的步骤。
11.选择多巴胺能神经元系细胞的方法，包括下列步骤采用权利要求10的方法选择多巴胺能神经元祖细胞；培养在上述(1)中选出的祖细胞；使用分裂停止后的多巴胺能神经元的标志物对上述(2)中培养的祖细胞进行筛选。
12.采用权利要求10的方法选择出的多巴胺能神经元祖细胞。
13.分离多巴胺能神经元祖细胞特异性基因及从祖细胞到多巴胺能神经元的各成熟阶段的特异性基因的方法，该方法包括使用权利要求12的祖细胞或者由该祖细胞经分化、诱导或增殖所得的细胞检测、分离在该细胞中特异性表达的基因的步骤。
14.以成熟为指标筛选调节多巴胺能神经元系细胞的增殖及/或分化的化合物的方法，该方法包括使被检验物质与权利要求12的祖细胞或者由该祖细胞经分化、诱导或增殖而得的细胞相接触的步骤、以及检测由接触所引起的祖细胞的分化或增殖的步骤。
15.用于治疗帕金森病的试剂盒，其含有权利要求4的多巴胺能神经元增殖祖细胞或权利要求12的多巴胺能神经元祖细胞。
16.帕金森病的治疗方法，其中向患者脑内移植权利要求4的多巴胺能神经元增殖祖细胞或权利要求12的多巴胺能神经元祖细胞。
17.权利要求4的多巴胺能神经元增殖祖细胞或权利要求12的多巴胺能神经元祖细胞在制造用于治疗帕金森病的试剂盒中的用途。
18.检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，该方法包括使第二多核苷酸与含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞样品相接触的步骤，其中所述第二多核苷酸可在严紧条件下与由以下(1)-(4)任意一项的碱基序列构成的第一多核苷酸杂交(1)SEQ ID NO1或2的碱基序列；(2)由编码由SEQ ID NO3或4的氨基酸序列所构成的多肽的多核苷酸构成的碱基序列；(3)由编码由在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的序列构成的多肽的多核苷酸构成的碱基序列；(4)由可在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸构成的碱基序列。
19.权利要求18的方法，其中第二多核苷酸至少长15个碱基。
20.采用权利要求18或19的方法选择出的多巴胺能神经元增殖祖细胞群体。
21.用于识别多巴胺能增殖祖细胞的试剂，其含有第二多核苷酸作为有效成分，所述第二多核苷酸可在严紧条件下与由以下(1)-(4)任意一项的碱基序列构成的第一多核苷酸杂交(1)SEQ ID NO1或2的碱基序列；(2)由编码由SEQ ID NO3或4的氨基酸序列所构成的多肽的多核苷酸构成的碱基序列；(3)由编码包含在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的序列的多肽的多核苷酸构成的碱基序列；(4)由可在严紧条件下与由序列编号1或2的碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸构成的碱基序列。
22.权利要求21的试剂，其第二多核苷酸的长度至少为15个碱基。
23.生产分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞的方法，该方法包括以下(1)-(3)的步骤(1)采用权利要求18或19的方法选择多巴胺能神经元增殖祖细胞；(2)培养步骤(1)中选择出的细胞；(3)从步骤(2)培养的细胞中选择分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞。
24.产生多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下(1)-(2)的步骤(1)采用权利要求18或19的方法选择多巴胺能神经元增殖祖细胞；(2)培养步骤(1)中选择出的细胞。
25.权利要求24的方法，其还包括从步骤(2)培养的细胞中进一步选择多巴胺能神经元的步骤(3)。
26.检测或选择多巴胺能神经元祖细胞的方法，该方法包括使与由以下(1)-(4)任意一项的氨基酸序列或其部分序列构成的多肽结合的抗体与含有多巴胺能神经元祖细胞的细胞样品相接触的步骤(1)SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸缺失、替换或添加，或者其组合而变异的氨基酸序列；(4)由可在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列的互补序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽构成的氨基酸序列。
27.权利要求26的方法，其中所述由部分序列构成的多肽具有至少6个连续的氨基酸残基。
28.采用权利要求26或27的方法选择出的多巴胺能神经元祖细胞群体。
29.权利要求28的细胞群体，其中在全体细胞中含有不少于40％的多巴胺能神经元祖细胞。
30.用于识别多巴胺能神经元祖细胞的试剂，含有可与由以下(1)-(4)任意一项的氨基酸序列或其部分序列构成的多肽结合的抗体作为有效成分(1)SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜区的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中发生一个或数个氨基酸缺失、替换或添加，或者其组合而变异的氨基酸序列；(4)由多核苷酸编码的多肽构成的氨基酸序列，所述多核苷酸可在严紧条件下与由SEQ ID NO1或2的碱基序列的互补序列构成的多核苷酸杂交。
3 1.权利要求30的试剂，其中由部分序列构成的多肽至少具有连续的6个氨基酸残基。
32.权利要求30的试剂，其中抗体是由杂交瘤FERM BP-10315或FERM BP-10316产生的抗体。
33.由杂交瘤FERM BP-10315或FERM BP-10316产生的抗体。
34.生产多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，该方法包括以下(1)-(2)的步骤(1)采用权利要求26或27的方法选择多巴胺能神经元祖细胞；(2)除去分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞，选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
35.生产分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞的方法，该方法包括以下(1)-(2)的步骤(1)采用权利要求26或27的方法选择多巴胺能神经元祖细胞；(2)培养步骤(1)中选择出的细胞。
36.权利要求35的方法，进一步包括从步骤(2)培养的细胞中选择分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞的步骤(3)。
37.生产多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下(1)-(2)的步骤(1)采用权利要求26或27的方法选择多巴胺能神经元祖细胞；(2)培养步骤(1)中选择出的细胞。
38.权利要求37的方法，进一步包括从步骤(2)培养的细胞中选择多巴胺能神经元的步骤(3)。
39.用于治疗神经变性疾病的试剂盒，其至少含有一种选自下列的细胞(1)权利要求20的多巴胺能神经元增殖祖细胞群体；(2)采用权利要求23的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(3)采用权利要求24的方法生产的多巴胺能神经元；(4)采用权利要求25的方法生产的多巴胺能神经元；(5)权利要求28的多巴胺能神经元祖细胞群体；(6)权利要求29的多巴胺能神经元祖细胞群体；(7)采用权利要求34的方法生产的多巴胺能神经元增殖祖细胞；(8)采用权利要求35的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(9)采用权利要求36的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(10)采用权利要求37的方法生产的多巴胺能神经元；(11)采用权利要求38的方法生产的多巴胺能神经元。
40.权利要求39的试剂盒，其中神经变性疾病为帕金森病。
41.神经变性疾病的治疗方法，其中在患者脑内移植至少一种选自下列的细胞(1)权利要求20的多巴胺能神经元增殖祖细胞群体；(2)采用权利要求23的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(3)采用权利要求24的方法生产的多巴胺能神经元；(4)采用权利要求25的方法生产的多巴胺能神经元；(5)权利要求28的多巴胺能神经元祖细胞群体；(6)权利要求29的多巴胺能神经元祖细胞群体；(7)采用权利要求34的方法生产的多巴胺能神经元增殖祖细胞；(8)采用权利要求35的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(9)采用权利要求36的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(10)采用权利要求37的方法生产的多巴胺能神经元；(11)采用权利要求38的方法生产的多巴胺能神经元。
42.权利要求41的方法，其中神经变性疾病为帕金森病。
43.选自下列的至少一种细胞在生产用于治疗神经变性疾病的试剂盒中的用途(1)权利要求20的多巴胺能神经元增殖祖细胞群体；(2)采用权利要求23的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(3)采用权利要求24的方法生产的多巴胺能神经元；(4)采用权利要求25的方法生产的多巴胺能神经元；(5)权利要求28的多巴胺能神经元祖细胞群体；(6)权利要求29的多巴胺能神经元祖细胞群体；(7)采用权利要求34的方法生产的多巴胺能神经元增殖祖细胞；(8)采用权利要求35的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(9)采用权利要求36的方法生产的分裂停止后的多巴胺能神经元前体细胞；(10)采用权利要求37的方法生产的多巴胺能神经元；(11)采用权利要求38的方法生产的多巴胺能神经元。
44.权利要求43的用途，其中神经变性疾病为帕金森病。
全文摘要
本发明提供用于检测Lrp4/Corin多巴胺能祖细胞标志物的多核苷酸探针和抗体，使用该探针和抗体可高效地分离多巴胺能祖细胞；还涉及使用它们分离祖细胞的方法。使用该Lrp4在细胞中的表达作为指标，可以选择在安全性、生存率和网络形成能力上适用于神经变性疾病包括帕金森病的移植治疗的细胞。
文档编号G01N33/53GK101027390SQ20058003191
公开日2007年8月29日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者坂本佳正, 尾野雄一, 今井俊夫, 中川康子 申请人:卫材株式会社