专利名称：反式激活蛋白检测对于乙型肝炎抗病毒治疗疾病反弹预测的临床诊断用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种检测乙肝病毒反式激活蛋白的临床检测用途，由于该蛋白具有反式激活病毒复制能力，因此检测该蛋白可以快速、准确地了解临床乙肝抗病毒治疗的效果，特别是在抗病毒治疗DNA阴性(拷贝数＜103)后可以用于预示肝内乙型肝炎病毒的复制情况、疾病反弹情况。可以作为乙肝抗病毒治疗实验终点指标。
背景技术：
HBV感染呈世界性流行，全球发病人数约3.5-4亿人。我国是高流行地区，根据1992-1995年的全国血清流行病学调查，HBsAg阳性流行率为9.75％，约1.2亿人携带HBsAg；慢性乙型肝炎病人约为2000-3000万例，其中约10％～20％可发展为肝硬化；肝硬化病人中，每年约有1％～4％发生肝细胞癌；慢性乙型肝炎是我国肝硬化和肝细胞癌的主要病因。每年约25～30万人死于乙型肝炎相关性疾病。而且，还可通过母婴传播传给婴幼儿，使其成为慢性HBV感染者，常成为终身感染，严重危害下一代人的健康。因此，HBV感染是极为重要的公共卫生问题。2005年由国家确定，将慢性乙型肝炎与艾滋病、结核病和血吸血病一起列为我国四大重点防治的传染病。
目前临床使用的乙肝抗病毒治疗药物主要有干扰素、核苷类似物等，从血清学水平检测乙肝病毒是临床诊疗的重要手段，对病毒感染的动态监测也能为乙肝的发展、预后、治疗效果等提供重要信息。目前的应用手段是血清学指标(两对半指标)，其中直接检测病毒成分的是HbsAg和eAg指标。基因指标是乙肝病毒PCR，临床抗病毒治疗疗效指标主要依赖HBV DNA和HBeAg。
过去人们认为在慢性乙肝病毒感染中，HBeAg的阴转标志着乙肝病毒复制的降低，肝内炎症活动趋于缓解、静止。随着研究的深入，学者们发现有相当部分病人在血清转换后仍表现为持续的病毒高复制，肝内炎症活动，最终导致肝纤维化、肝癌发生。研究表明50-60％的HBeAg阴性乙肝患者检测HBV DNA呈阳性。因此由于病毒变异等的原因，HBeAg的阴转已经不能做为评估抗病毒治疗的有效指标；另外一个指标是HBV DNA拷贝数，目前成为评估疗效的主要指标，但是目前的抗病毒药物主要是针对阻止DNA的复制达到治疗的目的，既抗病毒治疗(如核苷类)只能抑制cccDNA复制，并不能清除cccDNA以及体内已经存在的病毒蛋白。因此血液中DNA阴转并不意味着肝内cccDNA的消失，因此抗病毒治疗检测血液中DNA阴转后马上停药绝大部分预后反弹，因此目前临床医生对于抗病毒治疗血液中DNA阴转后没有实验室指标可以依据，因此临床对于停药时间判定没有统一标准。
表面抗原HBsAg(小分子表面蛋白)非常难以阴转，因此在界于DNA阴转和表面抗原HBsAg阴转二者之间没有血清学指标可以判定，给乙型肝炎的抗病毒治疗终点的确定带来很大困难。
反式激活(transactivation)，既某一基因的编码蛋白转而激活同一基因的远离部位，或另一基因的转录和表达。研究发现乙肝病毒的一些组成蛋白具有反式激活作用。
研究已经表明以乙肝病毒大蛋白(LHBs，HBV-LP)为首的一系列病毒蛋白能激活病毒复制系列启动子元件。大蛋白不仅存在于含病毒DNA的Dane颗粒，还存在于不含病毒DNA的管状颗粒上。在抗病毒治疗的消退上晚于DNA消退，而早于表面抗原消失，大蛋白(LHBs，HBV-LP)的拓扑结构前S区具有反式激活作用，LHBs能PKC-依赖地活化AP-1和NF-κB。PKC下游的c-Raf-1激酶的功能是AP-1和NF-κB依赖LHBs活化的先决条件，因为对c-Raf-1激酶的抑制能消除AP-1和NF-κB的LHBs-依赖的转录水平的活化。
同时也发现截短型前S2区蛋白也能够激活多种启动子元件，具有同样的转录激活功能。
与HBV表面抗原大蛋白一样，乙肝病毒X蛋白是一个强的反式激活因子，该蛋白反式激活作用不仅作用于病毒蛋白启动子，更可以通过与癌基因的相互作用而调控细胞的分化。
以鸭乙型肝炎为模型，研究发现亚病毒颗粒(不含病毒基因)能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达。该效应对感染滴度、病毒粒子与亚病毒颗粒的比例以及亚病毒颗粒加入的时间具有依赖性。更重要的是，在细胞编码的病毒受体蛋白的结合区域存在时，亚病毒颗粒的pre-S蛋白能触发该增强效应。这些数据表明这种增强作用由pre-S蛋白的反式激活功能或亚病毒颗粒与细胞受体的结合所活化的信号途径所引发。
本发明的目的正是阐述临床医院检测反式激活蛋白对于乙肝抗病毒治疗具有的临床诊断用途，特别是在血液中DNA阴性后，检测血液中反式激活蛋白对于判定治疗终点有临床意义。
通过检测以乙肝大蛋白为代表的一类型具有反式激活病毒复制作用的病毒蛋白，依据其蛋白含量变化、消退变化来对疾病治疗终点、预后反弹做一个判定，可以应用这些指标从蛋白水平上观察病毒复制水平、预测病毒反弹复制情况，能尽早采取有效的综合治疗方案，起到节约用药、合理用药的作用。
发明内容
本发明提供了一种使用新的乙肝诊断指标来判定慢性乙肝疾病反复、治疗后病情反弹的临床应用途径，这种临床用途是通过检测血液中具有反式激活病毒复制作用的乙肝病毒蛋白，这些蛋白包括乙肝大蛋白、截短型的前S2蛋白、X蛋白，由于截短型前S2蛋白只存在于禽类上，X蛋白抗原性很弱并且很不稳定，因此我们的发明以乙肝病毒大蛋白的反式激活作用为研究对象。由于这些蛋白具有反式激活作用，因此在抗病毒治疗血液中检测这些蛋白，不仅可以作为治疗效果的观察指标，还可以作为疾病反弹的一个预示检测方法。特别是在血液中DNA阴性后，如果可以从血液中检测到这种反式激活蛋白，可以预示肝内病毒可能在反式激活蛋白调控下增强复制能力，导致病情反复和反弹。而如果血液中DNA阴性后，如果血液中也检测不到这种反式激活蛋白，可以预示肝内病毒复制能力低水平，此时停药较为彻底。因此检测这种反式激活蛋白可以预示乙型肝炎病毒的预后诊断，可以作为乙肝抗病毒治疗实验室终点指标的判断。为临床医生判定治疗停药时间提供参考依据。
一方面，本发明阐述了检测上述的反式激活蛋白的临床应用用途。
另一方面，本发明还提供了如何通过检测这些反式激活病毒蛋白来判定其临床意义的判定方法。
具体来说1)抗病毒治疗，在血液中DNA消退后，如果反式激活蛋白也随着消退，则显示病毒复制水平降低，而且反式激活蛋白不能促进病毒增强复制，此时显示治疗较为彻底。大蛋白完全消退，是治疗后血清学实验室检测终点指标。
2)抗病毒治疗，此时如果血液中病毒DNA阳性，反式激活蛋白也保持阳性，则显示治疗无效；3)抗病毒治疗，如果血液中病毒DNA已经阴性，反式激活蛋白仍旧保持阳性，则预示病情反复、反弹，此时显示治疗不能停药。
具体实施例方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1检测血液中大蛋白消退是治疗效果良好的标志材料乙肝大蛋白前S区抗原定量检测试剂检测拉米夫定抗病毒治疗系列标本，所有患者均是经过拉米夫定抗乙肝治疗，在不同的时间设立检测时间点检测HBV DNA、HBV-LP以及转氨酶指标，检测时间点分别为用药前、用药3个月、6个月、9个月、12个月至36个月。
结果显示抗病毒治疗后血液中DNA在第6个月时消退，而大蛋白在第9个月消退，在大蛋白消退后，病情治疗应答良好，36个月内未出现反弹。
实施例2检测血液中大蛋白持续阳性是治疗效果不佳、预后不良的的标志材料乙肝大蛋白前S区抗原定量检测试剂检测拉米夫定抗病毒治疗系列标本，所有患者均是经过拉米夫定抗乙肝治疗，在不同的时间设立检测时间点检测HBV DNA、HBV-LP以及转氨酶指标，检测时间点分别为用药前、用药3个月、6个月、9个月、12个月至36个月。
结果显示抗病毒治疗后血液中eAg已经阴转，也就是已经转化成小三阳，但是大蛋白持续阳性，预示治疗无效果，该患者抗病毒治疗结果无效。。
实施案例3在血液中DNA阴性后，检测大蛋白持续阳性是疾病反弹的标志材料乙肝大蛋白前S区抗原定量检测试剂检测拉米夫定抗病毒治疗系列标本，所有患者均是经过拉米夫定抗乙肝治疗，在不同的时间设立检测时间点检测HBV DNA、HBV-LP以及转氨酶指标，检测时间点分别为用药前、用药3个月、6个月、9个月、12个月至36个月。
结果显示抗病毒治疗后，从第3个月开始血液中检测病毒DNA＜103，但是大蛋白持续阳性，由于大蛋白pre-S区的反式激活作用，该蛋白的存在预示病毒重新高水平复制的可能。该患者在治疗后维持相当长时间血液中DNA阴性，而且也顺利实现eAg阴转。但是在第18个月疾病反弹。
实施例4乙肝抗病毒阿德福韦治疗后检测血液中大蛋白预测疾病反弹在对43例抗病毒药物阿德福韦治疗患者系列标本(时间跨度为1年左右，约每3个月收集一次血清，每个治疗系列收集4个血样)进行检测的研究中，在显效组、微效组、无效组以及波动组中LHBs含量的变化趋势与HBV DNA变化趋势一致，准确的反应出了乙肝患者抗病毒药物治疗的疗效，通过检测体内LHBs的含量变化来反应出患者体内用药后病毒复制的水平，联合使用HBV DNA和LHBs的检测可以更科学、更准确、更有效的指导乙肝患者的药物治疗过程。并且在多例大蛋白持续高滴度而DNA暂时阴性患者后续观察都发现反弹，这意味着大蛋白的持续阳性是乙肝治疗后反弹的重要临床检测指标。
权利要求
1.一种检测乙型肝炎病毒反式激活蛋白可以用于预测抗病毒治疗后疾病反复、反弹的用途。
2.一种如何通过检测乙型肝炎病毒反式激活蛋白的含量、有无而预测抗病毒治疗后病情反弹的方法。
3.一种将乙肝病毒反式激活蛋白作为抗病毒治疗实验室血清学终点指标的用途。
全文摘要
本发明提供了一种使用新的乙肝诊断指标来判定慢性乙肝疾病反复、治疗后病情反弹的临床应用途径，这种临床用途是通过检测血液中具有反式激活(transactivation)病毒复制作用的乙肝病毒蛋白，由于这些蛋白具有反式激活作用，因此在抗病毒治疗血液中检测这些蛋白，不仅可以作为治疗效果的观察指标，还可以作为疾病反弹的一个预示检测方法。依据这种反式激活蛋白的检测可以作为乙肝抗病毒治疗实验室终点的判断指标。为临床医生判定治疗时间长短提供参考依据。
文档编号G01N33/68GK1811455SQ200610002989
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月6日 优先权日2006年2月6日
发明者林长青 申请人:北京热景生物技术有限公司