专利名称：修饰重组的人乳头瘤病毒多肽、衣原体热休克多肽、肿瘤多肽及肿瘤阻抑蛋白多肽的制作方法
技术领域：
本发明是抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性抗体与特异多肽结合反应的一项技术。
该发明技术是通过分离纯化HPV早期蛋白(如E2，E4，E6及E7)和后期外壳蛋白(L1)编码区，肿瘤基因蛋白(H-Ras，K-Ras)肿瘤阻抑制蛋白(PTEN)以及衣原体热休克蛋白60(CHSP60groEL1)相关的多肽序列，用免疫检测方法，以达到检测子宫上皮细胞变异，临床癌变前的普查以及应用于HPV感染相关的子宫颈癌，和癌基因蛋白和肿瘤抑制蛋白突变缺损相关的肿瘤的早期诊断的多肽复合物分子。
背景技术：
在全球范围内，子宫颈癌的发病率占妇女的恶性肿瘤发病的第二位。据国际癌症协会(IARC)报导，全球范围内，在2000年大约有50万子宫颈癌病例。在美国每年约有13万新的子宫颈癌病例产生，而亡率大于4千例。在发展中国家，妇女患子宫颈癌的发病率占全球患子宫颈癌发病率的80％，而且约80-85％的患者往往在后期才被诊断发现，导致相对的死亡率增加。据全球统计比较，大约1千万患者属高度发育异常期，大约3千万患者属于低度发育异变期，而且约三亿妇女患有子宫颈感染HPV，但没出现组织细胞异常。这种疾病是由感染了人乳头瘤病毒(HPV)所致。除外，感染了HPV还可以诱发头颈部、生殖道、尿道和膀胱肿瘤的发生。
根据HPV的致病强度与子宫颈癌相关的程度，可将它们分为三大类即高危险型HPV(例如HPV16、18、31和45)，患这些类型的HPV感染在子宫颈中的5％以上；中度危险型HPV(例如HPV33、35、39、51、52、56、58、59、68)，患这些型感染在子宫颈癌中分别占1-5％；低度危险型的HPV(例如HPV6、11及其它型)，在子宫颈癌患者中极少感染这些HPV型，但是这些低度危险型的HPV感染与女性或男性生殖道尖锐湿疣有密切相关。此外，由于母体感染了这些型的HPV，导致婴儿出生后出现喉头的乳头瘤，全球每年约2万5千的新生儿死于该疾病。这是由于缺乏先进的医疗设备体系进行检测HPV感染的检测所致。应通过世界卫生组织(WHO)机构进行健康卫生的普查，制定出全球性健康教育课程(JHPIEGO)，从而对该疾病的认识。
在中国，子宫颈癌仍然是一种常见疾病。西方国家对中国妇女感染HPV与子宫颈癌发病相互关系较少报导。子宫颈癌现已确认与感染HPV16、18型密切相关，而且与HPV31、33、35、45、51、52、56和58型同样有相关。
经研究证明，在中国四川省，患子宫颈癌的妇女中与感染了HPV16、33型有密切相关。而且异著差异占95％。而且，大多数患子宫颈部的妇女多半是感染了HPV16、33型。而且发明率极高，特别是在山西省的普查发现，大约有10％的发病率，相反在上海的患子宫颈患者大多是感染了HPV52、58型相关。上述的HPV型的感染在欧美国家以及非洲中的子宫颈癌妇女中较少见。
HPV的感染尤其是癌基因型的HPV感染与子宫颈部的发病极为密切。在浸润型子宫颈癌妇女中几乎100％的患者感染了HPV。大多数妇女在早期并无症状，而且往往在子宫内膜涂片及脱落细胞(巴氏染色法)的检查一般是正常，这是增加了子宫颈癌的发生的危险性的重要原因之一。特别是对混合型HPV的感染者危险性更加严重。
热休克蛋白(CHSP60)已被证实是一种衣原体抗原免疫原，流行病调查发现，它与衣原体沙眼的免疫力相关。抗(CHSP60)抗体的产生与子宫鳞状细胞癌的发生密切相关。Cjorma paavonen.，et al；Am J Obst；Gynecol 2003；189，1287-92；Tarja Anttila；etalJAMA，285(1)47-51，2001。
在子宫颈缺损的恶变前发展过程中，肿瘤基因K-Ras发生突变，加上合并HPV的感染对恶变发展起到关键性的作用。(Prokopakis P.Sourvinos G.，etaloncolRep，9(1)129-33，2002)。大约36％感染了HPV患者中，可以检测出HPV的基因组，同时占159的患者出现肿瘤基因的突变(K-Ras)。尤其是感染了HPV18型的患者中有71％的患者的K-Ras基因空变发生，而感染HPV16型患者约有29％的患者出现K-Ras基因突变，而且患合并有中度子宫变异性肿瘤发生。(Stenzel A.，et alPathol Res Pract，9591-603，2001)。
肿瘤基因蛋白(H-Ras)，(K-Ras)以及(N-Ras)分别位于人染色体的第11、12以及1号染色体上。该三种Ras基因为21Kda蛋白(统称为P21)，由189个氨基酸所组成。当感染了HPV时，可以激活这些肿瘤基因，从而导致肿瘤基因的转化过程。现已证明细胞内的Ras基因转化过程与HPV的E6/E7基因是共同起效应的(Ioannis N. Mammas.，etalGynecologic Oncology 92941-948，2004)。
肿瘤阻抑制蛋白(PTEN)是与子宫颈鳞状细胞癌变发生有密切相关。它对内、外遗传的改变过程起到关键性的作用，而且也起到预测性诊断的因子。PTEN位于人染色体的10q23.3位置上。它主要是调控细胞的生长，同时对细胞的周期、阻抑制或调控肿瘤的发生起重要的作有。由于在许多肿瘤患者中，PTEN的突变(基因突变)或缺损使调控功能缺失，同时使PTEN的起动区发生甲基化，使体内产生相应的抗PTEN的免疫抗体，约36％的子宫内膜部患者或子宫内皮细胞癌变期患者均出现PTEN的突变，产生相应的特异抗体。因此，检测特异抗PTEN抗体，是早期诊断子宫内膜部的有效方法。(Tak-Hong Cheung，etalGynocologic Oncology，93；621-627，2004；Takeo Minagch.，etalCancer Letters210；57-62，2004)。
当HPV的癌基因蛋白，肿瘤基因蛋白，肿瘤阻抑制蛋白，以及衣原体热休克蛋白CHSP60经体内降解后的小分子多肽被主要组织相容复合物分子(MHC)受体结合。(MHC)是人类白细胞抗原(HLA)分子。它的生物学功能是与多肽结合，起到免疫学的作用，HLAI型分子对抗病毒和抗肿瘤的免疫作用起重要作用，HLA II型分子对调控抗体的产生以及细胞毒性反应起作用。
MHC的I、II型分子大于90％是由寡聚多肽氨基酸组成(通常是8-11氨基酸组成)，它是病毒基因，肿瘤基因，肿瘤阻抑制基因以及衣原体热休克蛋白基因编码的多肽分子。这些多肽分子来自本身的蛋白，经降解后形成小分子多肽，它的可以对免疫宿主起激活作用。
在中国人群中的HLA可以分为两大类即南方人群和北方人群；逮族、布衣族和锦族属南方人群。常见的等位基因有DPB1 0501，*1301，*0401，以及*020102；DRB1等位基因有DRB1*150201，030101，*090102。占优势的DQB1等位基因有DQB1*030101/0309，*050201和0201/0202。利用HMCPrep应用程序可以预测多肽分子的亲和性，同时还可以分析发现不同种族人群的MHC等位基因多肽的特异性结合的模式。HLA的I型等位基因包括HLA-A*0101，*0102，*0202，*0203，*0206，*0301，6801，6802，3501；HLA的II型等位基因包括HLA-A-DRB1*0101，*0401和*0701。以上的所有等位基因在人类中具有高频显性，而且还有高度的亲和性。
研究证明DQW3(HLAII型基因)与子宫颈癌病变相关，经血清学分类，可将它们分为三类，即DQ7、DQ8和DQ9。根据统计分析表明，拉丁美洲、英国人群中的DRB1*1501-DQB1*0602与浸润性疾病的危险性增加有密切相关。在美国的Portland地区的白种人妇女发现感染HPV16型并有高度鳞状上皮细胞子宫颈缺损的患者的危险性较低，这可能与等位基因DRB1*1501、DQB1*0602相关。(Jin-Hia Lin，et alHuman Immunolog200364，830-834)。
发明内容
本发明的内容包括HPV癌蛋白，K-Ras、H-Ras，肿瘤阻抑制蛋白PTEN以及衣原体热休克蛋白CHSP60的蛋白多肽序列，推论出特异的抗原决定族，并选择出一定比例的疏水、亲水氨基酸的组份。以有助于蛋白多肽的水溶性。
多肽的氨基酸组成与多肽的水溶性密切相关。它们可以是水溶性的或非水溶性的。如果多肽分子中含较多的疏水氨其酸残基(例如亮氨酸、缬氨酸、异白氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)详细见表，它们的水溶性较低或完全不溶于水。所以，设计合成多肽时应控制这些疏水氨基酸少于50％。同时，尽可能在每五个氨基酸残基至少有一个带电荷的氨基酸残基。
在设计时，可以通过延长多肽的序列，选择极性的氨基酸残基，或增加一些极性的氨基酸在设计的多肽中，来增加多肽的极性。另外，也可以缩短多肽的长度，减少疏水氨基酸残基来增加多肽的极性。亲水氨基酸包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸，它们在氨基基因都含有侧链，而且该侧链的完整介质在PH7.4。如果在羧基末端加入一个阴极氨基酸残基(例如天门冬氨酸、谷氨酸和酪氨酸)，可以增加多肽的可溶性。如果在氨基末端不带有阳性的氨基酸残基，可加入极性的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)，使它们的水溶性增加，同时也增加多肽分子吸附在微孔酶标板的强度。
如果在多肽分子中含甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸，难以获得高纯度的多肽，因为他们对氧化和碱化反应非常敏感。甲硫氨酸、胱氨酸均含有二硫键，而且是疏水氨基酸。
胱氨酸与经氨酸相比较，只有一个原子不同。硫醇的硫基在氨化过程被置换，甲硫氨酸、胱氨酸容易被氧化，产生硫氧化过程。
异亮氨酸(NLe)是一种非天然氨基酸，它的亚型线性侧链有疏水性，而且它的结构与甲硫氨酸相似，但不含硫基，所以可以用它来置换甲硫氨酸，这样可以减少含甲硫氨酸的多肽的氧化作用。丝氨酸可以用于替换胱氨酸，也可以替换胱氨酸、甲硫氨酸及色氨酸残基在整个多肽分子的数目。一般不会改变多肽和抗原决定族的生物学及免疫学特性。
本发明更一步内容是修饰后的HPV肿瘤蛋白癌基因蛋白(H-Ras、K-Ras)肿瘤阻抑制蛋白(PTEN)，以及衣原体热休克蛋白(CHSP60)的氨基酸序列通过加入中性氨基酸(作为一个空间连接体)，将两种不同的抗原决定族连接在多肽分子，使组成了一个具有两种高特异性亲和力的抗原决定族的序列并合起来，这些修饰过的多肽分子可以与MHC分子起反应。
免疫细胞介质(CMI)，能够和HPVE2、E4、E6、E7及L1的高亲和性的抗原决定族多肽结合，而且这些重组多肽能够被特异性抗体所识别。
经修饰后的两种不同蛋白多肽分子，仍保留抗原的特性，同时它们的氨基酸组份大于50％的亲水氨基酸，所以在检测中容易溶解，而且可以被病人的血清特异抗体所识别。
甘氨酸属中性的氨基酸，没有中心偏光力构形的氨基酸，可以用于作多肽的并联介质体，左旋的脯氨酸也是中性氨基酸，因此可以把甘氨酸和脯氨酸作为空间连接体(例如GPGPG，GPG，GGPGG序列组成)。
这些中间介质体可以把两种不同抗原决定族并联起来，同时中介体不与两端的抗原决定族多肽序列相互反应，也不影响多肽氨基酸序列的功能。GPGPG和GGPGG，GPG空间连接体的序列可以防止抗体与这些空间连接体的交叉反应，同时也明显地降低了HLA-DR对空间连接体序列的亲合性。
在感染了HPV病人的血清中含有抗E2、E4、E6、E7早期蛋白的抗体，抗体的存在直接与细胞的变异有关。通过采用ELISA方法或快速试纸条方法检测特异性抗体。这些特异抗体均可与高危HPV或低危HPV肿瘤蛋白多肽结合，形成复合物。
该检测技术对感染HPV并有子宫颈浸润型肿瘤疾病的诊断更为有用。
由于该检测方法具有高度敏感特异性而且操作简单，经济的特点，从而明显地扩大了使用的范围。采用子宫内膜脱落细胞染色法(PAD)时，使收集的脱落细胞不足或不正确收集，都会造成漏诊的发生。如用发明的重组的多肽偶联的试纸条，只需微量的检测材料(血清)就可以获得理想的结果。
氨基酸序列表中的30个特异多肽分子长度在10-42个氨基酸残基范围的。这些多肽分子来源于HPV的E2、E4、E6、E7、L1的蛋白编码区，肿瘤阻抑制蛋白(PTEN)，癌基因蛋白(H-Ras，K-Ras)以及衣原体热休克蛋白(CHSP60)的多肽序列。
具体实施例方式
以下的举例会详细地叙述本发明的具体操作。目的是以即便理解以下的操作方法，和制备得过程，以及本发明的HPV6，11，16，18，31，33，45，52，和58型的早期蛋白E2，E4，E6，E7，后期蛋白L1以及其它蛋白新多肽的构建。
氨基酸序列或多肽合成发明的多肽可以用各种不同的方法合成获得，而且不局限于重组性的方法来合成。化学合成方法较为优先考虑的一种方法。改方法较容易合成一定范围的多肽分子。而且，合成的多肽产物可以达到95-99％的纯度。采用9-二苯并伍环-甲氧羰氨基酸(FMOC)来保护左旋氨基酸的侧链功能基团(氨基酸的氨基末端)，利用固相多肽化学合成。所用的树脂支持物(Novabiochem Nottingtam，UK)合成时，多肽合成的量可达到0.25mM，即大约300-400毫克。
树脂预先被放置反应管内，然后用二甲基甲酰胺洗涤至完全干燥为止。加入10毫升20％的吡啶二甲基酰胺溶液在树脂内，摇动5分钟，重复一次，混匀后摇动30分钟，静止后，去掉溶液后，再用二甲基酰胺溶液洗涤四次，最后，用二氯甲醇洗一次。用标准茚三酮检测，树脂经检测时转变成蓝色时，证明树脂制备完成。
被偶联的氨基酸可以通过5％水，5％酚，3％硫醇，3％乙二烯硫醇，3％三异丙胺，81％氟乙酸处理。将偶联在树脂表面的氨基酸分离出来。游离的氨基酸多肽混合物经冷冻的甲丁酯洗两次，最后用氮气干燥沉淀。
根据氨基酸的顺序，按次序将每种的氨基酸偶联溶液加到树脂内，依照重复偶联反应所有的氨基酸延伸长为多肽分子。偶联溶液可以由以下过程处理制备1)1mMFmoc氨基酸，2)(1毫升0.5M苯并三唑一五六-1，1，3，3-四甲基胍一六氟一磷，1mM苯并三唑，348微升的2mM N，N-二异丙乙胺)混合摇动30分钟。去掉反应管中的溶液，保留树脂，然后用二甲基甲酰胺洗涤树脂，重复四次，最后用二氯甲醇洗涤一次，用茚三酮标准液检测氨基酸偶联树脂的状况。
多肽分子可以用激光分解吸收反应分光光度计质谱检测监定，用高压液相层析纯化(C18300A柱)。合成的多肽序列可达99％纯度。在此强调，低于99％的纯度多肽分子仍然可以用于检测。
基酸多肽的贮存经厂家合成的氨基酸的多肽可以存放在-20℃冰箱。使用之前，用磷干酸盐缓冲液PBS PH7.2)悬浮多肽，并且制备成工作溶液，浓度通常为1mg/ml.然后分装贮存在-20℃。
联氨基酸多肽在强吸附力的酶标反应板孔表面。经合成的多肽分子可以偶联在顺丁烯二酸酐活化过的聚乙烯微孔板内(REACTI-BINDTm)，该板由PIERCE公司制备。每种氨基酸多肽分子用偶联吸附缓冲也(50mM碳酸钠缓冲液PH9.0，或者是用碳酸缓冲液(0.1M PBS PH7.2)将多肽稀释成为12.5微克/毫升。每一个微孔加入100微升经稀释后的多肽溶液，经微振动反应，在室温下反应4小时，也可以在4℃下过夜反应。
反应完后，将孔内的多肽溶液去净，并用吸纸将剩余的溶液吸干。用200微升的磷酸缓冲液(PBS PH7.2)洗涤两次，然后加入200微升的封闭缓冲液(4％脱脂奶粉液在PBS PH7.2缓冲液内)入微孔内，在室温下反应一小时，或者每2-3分钟换封闭液一次，重复数次，最后用200微升的PBS PH7.2缓冲液洗涤两次。该酶标反应经处理后可在室温下干燥，封闭后贮存在4℃下，贮存时间可达数月。
收集样品以下的方法是用于收集子宫颈粘液，并用于检测抗HPV多肽分子的特异性抗体(分泌型IgA)。首先，用一对称性吸管(1厘米深度的塞柱)收集，收集大约100-200微升粘液，然后将粘液转移到一个小型离心管内，立即放置在冰上，样品可贮存在-70℃超低温冰箱内。
以下的方法是用于收集子宫颈涂片作为检测HPV的脱氧核糖核酸(DNA)和HPV的基因型检测。用细胞刷工具从内外子宫颈的涂片中获取脱落细胞。收集后的涂片可放含有磷酸缓冲液(PBS PH7.4)的容器内，经离心沉淀，再加PBS PH7.4溶液洗涤沉淀后，沉淀的细胞可悬浮在0.2-0.5毫升的(10mM Tris-HCl PH7.5)缓冲液内，样品被存放在-70℃超低温冰箱内。
在使用聚合酶链反应(PCR)时，只需取10微升的样品，煮沸10分钟后，冷却在冰上。在进行PCR反应前，3000转/分钟离心1分钟后，取上清液进行PCR反应。
以下方法是用于收集血清样品作为检测抗HPV多肽抗体(免疫球蛋白IgG)的存在。
首先，使用静脉取血方法。用一次性无菌抽血管以及21或22号无菌针头收集静脉大约7-9毫升，将全血放置在室温下15-20分钟，使血液凝固。然后在2500g的离心力4℃下离心15分钟，使血清与红血球分离出来。将澄清的血清转移到一个小离心管内。收集后的血清样品可保存在-80℃。
联免疫吸附血清检测方法合成的多肽可以用磷酸缓冲液(0.1M PBS，0.15M氯化钠PH7.4)悬浮，配成1毫克/每毫升。在使用之前，将多肽溶液用上述的磷酸缓冲溶液稀释成12.5微克/每毫升的浓度。
取100微升稀释过的多肽溶液加入到经化学活化过的聚乙烯96孔板的微孔内(每一孔加100微升即是1.25微克的多肽量)。然后将96孔微孔板封盖后，放置室温反应3-4小时，随后放置4℃过液反应。
合成的多肽经被包附在微孔内之后，可以用磷酸缓冲溶液并含有0.1％Tween-20洗涤数次(每次用200微升/每微孔)。然后，用200微升的封闭溶液1)10％小羊血清的磷酸缓冲溶液PH7.4；或4％脱脂奶粉的磷酸缓冲液PH7.4封闭反应一小时。或用SuperBlock溶液(由美国Pierce公司制造)封闭，每3-5分钟换加200微升的SuperBlock溶液，重复2-3次，然后吸附剩余的液体，自然干燥后将96孔酶联反应板，用塑料封闭膜封盖，保存在4℃冰箱。
2)在检测使用反应板之前，先用磷酸缓冲液并含有0.05％的Tween-20(由美国J.TBaker公司制造)PH7.4洗涤微孔数次，或者用自动化酶标反应微孔板洗涤仪器洗涤(每次200微升)之后，即可以进行检测使用。
3)用含10％的SuperBlock，0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PH7.4)将病人和正常人的血清稀释成1∶40。在每一个微孔内加入100微升的稀释过的血清样品。空白对照孔可以用磷酸缓冲液替代，封盖板后在室温下反应一个小时，并且偶尔轻微振动微孔板。去掉微孔内的血清样品，然后用多尖头加样器吸取300微升的磷酸缓冲溶液PH7.4并含有0.01％的Tween-20洗涤每一微孔，每次放置3分钟，重复6次。最后用吸纸将剩余的液体吸干。
4)用含3％小牛血清白蛋白(BSA)和0.5％小牛血清(FCS)的磷酸缓冲溶液(PBSPH7.4)将偶联的过氧化物酶鼠抗人免疫球蛋白(HRP-鼠抗人IgG或IgA)抗体稀释成1∶12000，取100微升经稀释后的HRP-鼠抗人IgG或IgA抗体加入微孔内，空白对照孔也同样加100微升。将酶联免疫吸附微孔板封盖后，在室温下反应一小时，偶尔轻微振动平板。去掉孔内的所有溶液，每一微孔加入300微升的含0.05％Tween-20的磷酸缓冲溶液PH7.4，放置3分钟，重复洗涤6次，每次在洗涤过程中，用吸纸将剩余的液体吸干。
5)加入100微升的底物溶液(四甲基联苯胺，Tubro TMB-ELISA，由美国PIERCE公司制造)到微孔内，空白对照孔也同样加入底物溶液进行显色反应。该底物适用对过氧化物酶的催化反应，在显色过程需避光。
6)反应板可放置室温下显色反应15-30分钟或者直到显出明显的篮绿色为止。篮绿色溶液可以用酶标仪在652nm波长范围内检测读数。此外，可以加入100微升/每微孔的1-2M硫酸溶液终止显色反应，使篮绿色转变成黄色。
完成的酶联免疫吸附反应的现象和解释在加入3底物溶液及终止反应的45分钟内可以用自动酶标板检测仪在450nm波长范围内检测吸收光的读数。OD450(是光波长范围)在450nm的读数大于0.3～1.0可以表明有抗特异性抗体的存在。在450nm的读数时，阴性对照的读数在0.05-0.08范围内。因此，使用不同的阴性对照时，可以显示出不同的OD读数范围。这要取决于所选用的阴性对照。表1是用酶联免疫吸附反应检测(ELISA)及含有发明的多肽检测子宫颈疾病作为子宫颈癌变诊断相关的吸收值。
综合叙述、描述以及实例示范，使到提供特异结构的参考。在本发明的申请中的专业理论在其他特异结构中也能体现出来，这些普通的专业知识应受到正确的评价。本技术中的普通专业技巧。有助于一些没有受过实验训练者的实际操作。对于本发明的范围不仅仅限于上述的特异性实例示范，而是附加注解要求说明。
对本申请要求的解释和相关范围内的任何改变可以考虑仍属本申请要求的构思范围中。
表1代表利用所发明的多肽进行酶联免疫反应方法检测(ELISA)，从子宫颈疾病的血清样品测定所得到的光吸收值.在450nm波长下检测和定所得到的光吸收值，用四舍五入法显示收数1.所发明的多肽是肿瘤蛋白多肽进行酶联免疫反应方法检测(ELISA)。
2.CIN代表子宫颈上皮细胞癌变形成，LSIL代表低度鳞状上皮细胞缺损，I-III代表病变程度.
3.HSIL代表高度鳞状上皮细胞缺损．4.CA＝子宫颈癌。
5.使用酶联免疫吸附检测(ELISA)检测的多肽来自HPV16型的E7/E2癌基因蛋白。
表2代表氨基酸名称和它的缩写以及它的特征符号
氨基酸序列表<210>1<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>20-22<223>多肽来自于HPV 18的E2区和HPV 16/18的L1区<400>1Arg Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln15 10 15Arg Thr Lys Gly Pro Gly Tyr Ile His Ser Nle Asn Ser Thr Ile Leu20 25 30Glu Asp<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>16-18<223>多肽来自于HPV 16的E7区和HPV 16/18的L1区<400>2Lys Leu Leu Nle Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Gly15 10 15Pro Gly Tyr Ile His Ser Nle Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp20 25 30<210>3<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于HPV 16/18的E7区<400>3Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser Gly Pro Gly Ser Glu Glu1 5 10 15Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg20 25 30
Arg Ala Glu Pro Gln Arg Glu35<210>4<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>12-14<223>多肽来自于HPV58的E7区和HPV16/18的L1区<400>4Asp Tyr Ile His Ser Nle Asn Ser Thr Ile Leu Gly Pro Gly Val Arg1 510 15Thr Leu Gln Gln Leu Leu Nle Gly Thr Ser Thr Ile Val Ser Asp20 25 30<210>5<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于HPV58/16的E7区<400>5Lys Ile Gly Leu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Gly Pro Gly Leu Leu Nle1 5 10 15Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Asp20 25<210>6<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>27-29<223>多肽来自于HPV58的E6区别和HPV16E7区<400>6Lys Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Val Phe Ala Asp Leu Arg1 5 10 15
Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Gly Pro Gly Leu Leu Nle20 25 30Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Glu35 40<210>7<211>40<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>27-29<223>多肽来自于HPV58/16的E6区<400>7Glu Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Val Phe Ala Asp Leu Arg1 5 10 15Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Gly Pro Gly Lys Leu Pro20 25 30Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Asp35 40<210>8<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>12-14<223>多肽来自于HPV16的E7区和HPV58 HPVE6区<400>8Arg Glu Leu Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Gly Pro Gly Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser Leu Tyr20 25 30<210>9<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>19-21<223>多肽来自于HPV58的E6区和HPV16 HPVE7区<400>9
Lys Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Asn Tyr Ser15 10 15Leu Tyr Gly Pro Gly Leu Leu Nle Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro20 25 30Ile Ser Ser Glu35<210>10<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>15-17<223>多肽来自于HPV16的E7区和HPV58/16 HPVE7区<400>10Lys Glu Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro1 5 10 15Gly Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Asn Tyr Ser20 25 30Leu Tyr<210>11<211>42<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于HPV16/52的E6区和HPV58 HPVE7区<400>11Lys Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Gly Pro Gly Ile Arg Leu1 5 10 15Gln Ser Val Gln Ser Lys Gly Pro Gly Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu20 25 30Leu Nle Gly Thr Ser Thr Ile Val Ser Asp35 40<210>12<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列
<222>16-18<223>多肽来自于HPV16/58的E7区<400>12Lys Leu Leu Nle Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Gly1 5 10 15Pro Gly Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu Leu Nle Gly Thr Ser Thr Ile20 25 30Val Ser Glu35<210>13<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>12-14<223>多肽来自于HPV16/52的E7区<400>13Lys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Gly Gly Pro Gly Gly Ile1 5 10 15Arg Leu Gln Ser Val Gln Ser Lys Asp20 25<210>14<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于HPV52的E6区和HPV58HPVE7区<400>14Lys Ile Arg Leu Gln Ser Val Gln Ser Lys Gly Pro Gly Val Arg Thr1 5 10 15Leu Gln Gln Leu Leu Nle Gly Thr Ser Thr Ile Val Ser Glu20 25 30<210>15<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列
<222>18-20<223>多肽来自于HPV58/52的E7区<400>15Lys Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu Leu Nle Gly Thr Ser Thr Ile Val1 5 10 15Ser Gly Pro Gly Leu Arg Thr Leu Gln Gln Nle Leu Leu Asn Glu20 25 30<210>16<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>11-13 Gly Pro Gly空间序列<223>多肽来自于HPV16的E6/E2区<400>16Lys Tyr Arg His Tyr Ser Tyr Ser Lue Tyr Gly Pro Gly Thr Lue Gln1 5 10 15Asp Val Ser Lue Glu Val Asp20<210>17<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>11-15<223>多肽来自于HPV16的E7区<400>17His Lue Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Gly Gly Pro Gly Gly Leu1 5 10 15His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Glu20 25<210>18<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>10-14<223>多肽来自于HPV18的E7/E2区
<400>18Lys Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Gly Gly Pro Gly Gly Thr Leu1 5 10 15Ser Glu Arg Leu Ser Ser Val Glu20<210>19<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>11-15<223>多肽来自于H-ras蛋白和HPV16的E4区<400>19Lys Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Gly Gly Pro Gly Gly Lys1 5 10 15Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Ser Arg Glu20 25<210>20<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>13-17<223>多肽来自于H-ras蛋白和HPV33的E4区<400>20Lys Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Ser Leu Gly Gln Gly Gly Pro Gly1 5 10 15Gly Val Leu Gln Leu Thr Ala Gln Thr Ser Glu20 25<210>21<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>11-15<223>多肽来自于H-ras蛋白和HPV16的E4区<400>21
Lys Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Ser Leu Gly Gly Pro Gly Gly Tyr1 5 10 15Leu Ala Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Glu20 25<210>22<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>10-14<223>多肽来自于H-ras蛋白和HPV33的E4区<400>22His Ile Gln Leu Ile Asn His Phe Val Gly Gly Pro Gly Gly Leu Ala1 5 10 15Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Asp20<210>23<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly Pro Gly空间序列<222>11-15<223>多肽来自于PTEN蛋白<400>23Arg Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys Phe Leu Gly Pro Gly Pro Gly Tyr1 5 10 15Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp Ser Glu20 25<210>24<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于PTEN蛋白<400>24
Asp Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr Gly Pro Gly Tyr Val Tyr1 5 10 15Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Glu20<210>25<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于PTEN蛋白<400>25Lys Typ Leu Ser Glu Asp Asp Asn His Val Gly Pro Gly Tyr Arg Pro1 5 10 15Val Ala Leu Leu Arg Asp20<210>26<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>11-15<223>多肽来自于CHSP60蛋白<400>26Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Glu Gly Gly Pro Gly Gly Ile1 5 10 15Arg Ser Ile Pro Tyr Leu Glu Ala Asp20 25<210>27<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>11-13<223>多肽来自于CHSP60蛋白<400>27Lys Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Gly Pro Gly Val Leu Ile1 5 10 15
Tyr Asp Lys Lys Ile Ser Glu20<210>28<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>10-14<223>多肽来自于CHSP60蛋白<400>28Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Gly Gly Pro Gly Gly Leu Ile1 5 10 15Tyr Asp Lys Lys Ile Ser Gly Asp20<210>29<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Gly Pro Gly Gly空间序列<222>10-14<223>多肽来自于CHSP60和HPV16的E7区<400>29Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Gly Gly Pro Gly Gly Leu Leu1 5 10 15Nle Gly Thr Leu Gly Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser Glu20 25<210>30<211>40<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>Gly Pro Gly空间序列<222>10-12<223>多肽来自于CHSP60和HPV16的E6区<400>30Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Gly Pro Gly Lys Nle His Gln1 5 10 15Lys Arg Thr Ala Nle Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu20 25 30
Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Asp35 40
权利要求
1.从人乳头瘤病毒(HPV)的早期蛋白E2，E4，E6，E7编码区和后期蛋白(L1)编码区的分离的水溶性多肽，这些多肽经一种空间序列和其它的多肽联接构成一种具有特殊的结构的重组多肽，这些重组多肽序列由＞50％的亲水性氨基酸所组成，同时保留了被特异性抗体所识别的抗原决定族。
2.按权利要求1所述的多肽，其特征在于它们是从HPV6，11，16，18，31，33，45，52，58型组群中选择出来。
3.按权利要求1所述的多肽，其特征在于这些多肽和空间序列连接，而且空间序列是由中性的编码氨基酸所组成。
4.按权利要求1所述的多肽，其特征在于在氨基的末端附加了一个极性氨基酸残基，这些极性氨基酸残基从赖氨酸，精氨酸，或组氨酸中选择。
5.按权利要求1所述的多肽，其特征在于在羧基的末端附加了一个非极性氨基酸残基，这些非极性氨基酸残基从天门冬氨酸，谷氨酸，或酪氨酸中选择。
6.由HPV分离的多肽，用来检测诊断肿瘤或细胞异常，这些分离的多肽序列从以下多肽序列组中选择氨基酸序列表中的第1号至第18号多肽序列。
7.从肿瘤蛋白H-Ras分离的多肽，其特征在于该多肽可溶于水溶液中，经一种空间序列和HPV的早期蛋白E2，E4或后期蛋白L1构成一种具有特殊结构的重组多肽，这些重组多肽序列由＞50％的亲水性氨基酸所组成，同时保留了被特异性抗体所识别的抗原决定族。
8.按权利要求7所属的多肽，其特征在于这些多肽是从HPV 16，31，33，45，58型组群中选择出来。
9.按权利要求7分离的多肽，其特征在于所述的空间序列是由中性的编码氨基酸所组成。
10.从肿瘤蛋白H-Ras分离的多肽，经空间序列和另一种蛋白序列或多肽联接，用于检测诊断肿瘤或细胞异常，这些多肽从氨基酸序列表中的第19至22号所示的多肽序列中选择。
11.从肿瘤蛋白H-Ras编码区分离的多肽，其特征在于这些多肽具有水溶性，经特殊的空间序列和HPV的E2，E4，E5后期的L1序列连接形成重组多肽，这些重组多肽序列由＞50％的亲水性氨基酸所组成，同时保留了被特异性抗体所识别的抗原决定族。
12.按权利要求11所述的多肽，其特征在于这些多肽来自多HPV16，18型。
13.从要求11分离多肽，其特征在于所述的空间序列是由中性的编码氨基酸所组成。
14.肿瘤阻抑蛋白PTEN编码区分离的多肽，其特征在于这些多肽可溶于水溶液中，经特殊的空间序列和另一种多肽联接形成重组多肽，这些重组多肽序列由＞50％的亲水性氨基酸所组成，可以被特异性抗PTEN抗体所识别。
15.按权利要求14多肽，其特征在于所述的空间序列是由中性的编码氨基酸所组成。
16.从肿瘤阻抑蛋白PTEN编码区分离的多肽，用来检测诊断肿瘤或细胞异常，这些分离的多肽从氨基酸序列表中的第23至25号所示的多肽序列中选择。
17.从沙眼衣原体热休克蛋白CHSP60 groEL1编码区的分离的多肽，其特征在于这些多肽可溶于水溶液中，经特殊的空间序列和HPV的早期蛋白E6，E7编码区的多肽联接形成重组多肽，这些重组多肽序列由＞50％的亲水性氨基酸所组成，可以被特异性抗体所识别。
18.按权利要求17的所述的多肽，其特征在于它们是从HPV 16，18，58型组群中选择出来。
19.按权利要求17所述的多肽，其特征在于所述的空间序列是由中性的编码氨基酸所组成。
20.从沙眼衣原体热休克蛋白CHSP60 groEL1编码区分离的多肽，用来检测诊断肿瘤或细胞异常，这些分离的多肽从氨基酸序列表中的第26至28号所示的多肽序列中选择。
21.沙眼衣原体热休克蛋白CHSP60编码区分离的多肽，经特殊的空间序列和HPV的早期蛋白联接，用来检测诊断肿瘤或细胞异常，这些分离的多肽从氨基酸序列表中的第29、30号所示的多肽序列中选择。
全文摘要
从人乳头瘤病毒(HPV)的早期蛋白E2，E4，E6，E7，后期蛋白L1编码区(L1)和肿瘤相关蛋白分离的蛋白的可溶性多肽经特殊的空间序列将HPV的早期蛋白E2，E4，E6，E7编码区和后期蛋白(L1)分离的蛋白多肽以及肿瘤相关蛋白分离的蛋白多肽序列联接成重组多肽序列结构，这些重组多肽序列由＞50％的亲水性氨基酸所组成，可以被特异性抗体所识别。同样的发明是从肿瘤蛋白K－Ras，H－Ras，编码区分离的蛋白多肽序列，肿瘤阻抑蛋白PTEN编码区的多肽，以及沙眼衣原体热休克蛋白CHSP60 groEL1编码区的多肽序列以及用来检测诊断肿瘤或细胞异常的多肽复合物分子。
文档编号G01N33/53GK1896105SQ20061000254
公开日2007年1月17日 申请日期2006年1月6日 优先权日2005年1月7日
发明者胡耀雄 申请人:胡耀雄