专利名称：灯盏花素人体血浆浓度检测方法
技术领域：
本发明通过对灯盏花素在人体中的主要代谢产物异灯盏花乙素血浆浓度的检测建立灯盏花素人体血浆浓度检测方法，对灯盏花素的人体药代动力学进行评价，为灯盏花素制剂的药学研究、质量标准和工业化生产质控指标的制定提供依据。
本发明对灯盏花素在人体中的主要代谢产物异灯盏花乙素结构进行了确证，并采用液相色谱-质谱-质谱联用法检测健康男性志愿者口服灯盏花素后不同时刻血浆中异灯盏花乙素的浓度。
背景技术：
灯盏花素的主要成分是灯盏花乙素，具有活血化瘀、通络止痛之功能，适用于冠心病心绞痛心血瘀阴证。查阅国内外相关文献，未见有灯盏花乙素人体药动学研究报道。
在进行灯盏花素人体药代动力学研究时，发现原形药物灯盏花乙素在人体内血浆中的浓度很低(小于5ng/ml)，且消除较快，血浆药物浓度-时间曲线不规则，无法进行药代动力学评价。
发明目的通过灯盏花素人体中主要代谢产物的研究，建立其血浆浓度检测方法，进行灯盏花素人体药代动力学评价，为灯盏花素制剂的药学研究、质量标准和工业化生产质控指标的制定提供依据。
发明内容
1.灯盏花素在人体中主要代谢产物的确证代谢研究结果表明，灯盏花乙素在人体内主要代谢生成其同分异构体，经结构确证为6-O-葡萄糖苷酸异构体，命名为异灯盏花乙素。
采用液相色谱-离子阱质谱法鉴定了灯盏花乙素在人尿样和血浆中的主要代谢产物。比较受试者服药前后尿样的一级全扫描质谱图，在服药后的尿样中，仅检测到m/z 463的离子，未发现其他相关离子。为提高检测的灵敏度，从总离子流图中选择性筛选(SIM扫描)可能的代谢产物m/z 463(原形药物)，m/z287(苷元)，m/z 301(甲基苷元)，m/z 477(甲基灯盏乙素)，m/z 543(硫酸结合物)，m/z 639(葡萄糖醛酸结合物)。与空白尿样的SIM色谱图比较(图1)，仅在m/z 463通道中，发现三个色谱峰，保留时间分别为10.9，12.8和14.9min，色谱峰II为主要代谢产物(M2)。选择性对m/z 463进行二级全扫描质谱分析(图2)，三个色谱峰具有相同的二级质谱图，主要产物离子均为中性丢失176u得到的m/z 287，提示三个色谱峰对应的分子结构中均含有一分子葡萄糖醛酸，且具有相同的分子量。其中峰I具有与母体药物相似的色谱保留时间和二级全扫描图，可判断色谱峰I即为原形药物，而其他两个色谱峰均为灯盏花乙素苷元的葡萄糖醛酸结合物。在受试者服药后的血浆样品中仅检测到代谢产物M2峰II及少量的原形药物。
为鉴定主要代谢产物M2的结构，采用柱层析和半制备液相色谱从多名受试者服药后的尿样中分离提取该代谢物的对照品。并对其进行质谱和核磁共振光谱分析。代谢物M2与原形药灯盏花乙素的分子量以及多级质谱数据完全一致，只是13C NMR和1H NMR化学位移有一定的差别。与灯盏花乙素NMR谱比较，代谢物M2的A环氢信号和碳信号的化学位移值发生了较大的变化，而B环和C环上的氢信号和碳信号的化学位移值基本一致，说明代谢物M2在A环的结构上发生了变化。通过上述分析，并与文献对比，可以确定代谢物M2的结构是灯盏花乙素苷元-6-O-葡萄糖苷酸[Scutellarein-6-O-glucuronide]。代谢物M2的13CNMR和1H NMR化学位移归属见表1。
为进一步获得代谢产物M2的结构信息，本试验还采用紫外法鉴定M2分子结构中的游离羟基位置。含有5位或邻二酚羟基的黄酮类化合物可与Al3+离子形成复合物，造成紫外吸收光谱的峰带红移，加入酸后，前者紫外吸收光谱无明显变化，而后者发生变化，这是由所形成复合物的稳定性不同造成的。判断M2的过程为配制10μg/ml的M2甲醇溶液，测定紫外吸收图谱(图3A)，谱带I和II分别在323nm和283nm；加入铝盐后，波带分别红移至338nm和293nm(图3B)；再加入酸后，波带无变化(图3C)，说明5位酚羟基游离，且结构中不含邻二酚羟基，因此通过UV吸收光谱，也证明M2的结构为灯盏花乙素苷元-6-O-葡萄糖苷酸。
表1.灯盏花乙素(Scu)及主要代谢物异灯盏花乙素(M2)的13C和1H-NMR数据
2.灯盏花素在人体中主要代谢产物血浆样品分析方法建立检测灯盏花乙素主要代谢产物-异灯盏花乙素人体血浆浓度的液相色谱-质谱-质谱联用(LC/MS/MS)分析方法。
血浆样品处理向500μl血浆中分别加入1％甲酸甲醇溶液100μl，100μl内标溶液(黄芩苷1μg/ml)和200μl水，混匀；加3ml提取溶剂乙酸乙酯，涡流混合1min，往复振荡10min(240次/分)，离心5min(3500rpm)，分取上层有机相于另一试管中，于40℃氮气流下吹干，残留物加入150μl流动相溶解，涡流混合，取20μl进行LC/MS/MS分析。
色谱条件流动相为甲醇-水-甲酸(65∶35∶0.5，v/v/v)，流速为0.50ml/min，柱温25℃。
质谱条件离子源为ESI源；源喷雾电压为4.5kV；加热毛细管温度为320℃；鞘气(N2)压力35Arb；辅助气(N2)流量10Arb；碰撞气(Ar)压力1.2mTorr；碰撞诱导解离(CID)电压均为25eV；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测(SRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z 463→m/z287(异灯盏花乙素)和m/z447→m/z271(黄芩苷)；扫描时间为0.3s。
3.灯盏花素在人体中主要代谢产物血浆样品分析方法确证方法的选择性异灯盏花乙素和内标黄芩苷在ESI离子化方式下，主要生成[M+H]+准分子离子峰，分别为m/z 463和m/z 447。选择性对准分子离子峰[M+H]+进行产物离子扫描，生成的主要碎片离子分别为m/z 287和m/z271，将主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。
分别取6名受试者的空白血浆500μl，除不加内标外，按“血浆样品的处理”依法操作，进行LC/MS/MS分析，获得空白血浆样品的色谱图，如图4-2A；将一定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得色谱图，如图4-2B，其中异灯盏花乙素的保留时间约为5.6min，内标黄苓苷的保留时间约为7.4min；取健康受试者给药后收集的血浆样品，依同法操作，得色谱图，如图4-2C。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰待测物及内标黄芩苷的测定。
标准曲线的制备取空白血浆500μl，加异灯盏花乙素标准系列溶液100μl，配制成相当于异灯盏花乙素血浆浓度为0.50，2.0，8.0，20.0，50.0，100，200和400ng/ml的样品，按“血浆样品处理”依法操作，每一浓度进行双样本分析，进样20μl，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线(例如图5)，根据标准曲线，异灯盏花乙素血浆浓度测定方法的线性范围为0.50～400ng/ml。
取空白血浆500μl，加入异灯盏花乙素2.5ng/ml标准溶液100μl，配制成相当于异灯盏花乙素血浆浓度为0.50ng/ml的样品，该样品在方法确证第一天进行6样本分析，并根据当日标准曲线，求得每一样本的测得浓度，数据见表2。该结果表明LC/MS/MS法测定血浆中异灯盏花乙素的定量下限可达0.50ng/ml。
表2.LC/MS/MS法测定血浆中异灯盏花乙素定量下限时的精密度和准确度
方法的精密度与准确度取空白血浆500μl，按“标准曲线的制备”项下的方法配制异灯盏花乙素低、中、高三个浓度(分别为2.0、20.0和360ng/ml)的质量控制(QC)样品，6样本，连续测定三天，并与标准曲线同时进行，计算QC样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法的准确度与精密度，数据见表3。
表3.LC/MS/MS法测定人血浆中异灯盏花乙素的准确度与精密度
血浆样品提取回收率取空白血浆500μl，按“标准曲线的制备”项下的方法制备异灯盏花乙素低、中、高三个浓度点(2.0，20.0和360ng/ml)的样品，每一浓度进行6样本分析。同时另取空白血浆500μl，除不加标准系列溶液和内标外，按“血浆样品的处理”项下操作，向获得的上清液中加入相应浓度的标准溶液和内标各100μl，涡流混合，40℃空气流下吹干。残留物以150μl流动相溶解，进样分析，获得相应峰面积(三次测定的平均值)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。异灯盏花乙素在2.0，20.0和360ng/ml三个浓度的血浆样品提取回收率分别为45.6％、63.6％和48.5％。结果见表4。
表4.异灯盏花乙素血浆样品提取回收率(％)
稳定性的考察本试验考察了异灯盏花乙素血浆样品经液-液萃取处理后室温放置24h的稳定性，血浆样品室温放置2h的稳定性，血浆样品-20℃放置30天及血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性。稳定性考察时，取空白血浆500μl，按“标准曲线的制备”项下的方法配制异灯盏花乙素低、高两个浓度的血浆样品(异灯盏花乙素浓度分别为2.0和360ng/ml)，每一种浓度水平进行三样本分析，采用LC/MS/MS法测定。数据表明处理后的血浆样品室温放置24h内稳定(RE在±4.3％之内)，血浆样品室温放置2h内稳定(RE在±7.2％之内)，血浆样品-20℃放置30天内稳定(RE在±5.4％之内)，异灯盏花乙素血浆样品经过3次冷冻-解冻循环后稳定(RE在±11.7％之内)，结果见表5-1，5-2，5-3，5-4。
表5-1.预处理后异灯盏花乙素血浆样品室温放置24h的稳定性
表5-2.异灯盏花乙素血浆样品室温放置2h后的稳定性
表5-3.异灯盏花乙素血浆样品-20℃放置30天的稳定性
表5-4.异灯盏花乙素血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性
未知血浆样品测定按“血浆样品的分析方法”项下操作，并以当日的标准曲线计算各时间点样品中异灯盏花乙素的浓度，由QC样品决定当日数据的取舍。浓度低于定量下限的样品，以零值计算；浓度超出定量上限的样品，经稀释后测定。
结果表明，测定血浆中异灯盏花乙素的分析方法符合有关规范要求，可用于药物动力学试验。
4.灯盏花素在人体中主要代谢产物血浆样品分析检测结果20名受试者口服含灯盏乙素80mg的灯盏花素滴丸和灯盏花素片后，血浆中异灯盏花乙素的浓度见表6和表7，血药浓度-时间曲线见图6～图8，图9给出了22名受试者的平均血药浓度-时间曲线。计算得到的主要药动学参数见表8和表9。结果如下
表6.20名受试者口服灯盏花素滴丸后异灯盏花乙素的血药浓度(ng/ml)
＜LLOQ低于定量浓度下限表7.20名受试者口服灯盏花素片后异灯盏花乙素的血药浓度(ng/ml)
＜LLOQ低于定量浓度下限表8.20名受试者口服灯盏花素滴丸异灯盏花乙素的药动学参数
表9.20名受试者口服灯盏花素片异灯盏花乙素的药动学参数
灯盏花素滴丸和灯盏花素片血浆中异灯盏花乙素的Tmax分别为6.25±2.02(平均值±标准差，下同)和6.10±1.68h；Cmax分别为138±107和108±64ng/ml，t1/2分别为3.10±0.87和3.38±1.12h；用梯形法计算，AUC0-t分别为518±360和473±225ng·h/ml，AUC0-∞分别为525±363和480±229ng·h/ml。
说明书
图1受试者尿样的总离子流(TIC)和SIM色谱图。
(A)受试者口服80mg灯盏花乙素0-12h的尿样；(B)空白尿样。
图2从受试者尿样总离子流图中选择离子m/z 463的二级全扫描色谱图及质谱图。
(A)色谱图；(B)色谱峰I的二级质谱图；(C)色谱峰II的二级质谱图；(D)色谱峰III的二级质谱图。
(E)色谱峰II对应的结构图3代谢产物M2的紫外吸收光谱。
(A)M2甲醇溶液；(B)M2甲醇溶液中加入AlCl3溶液；(C)M2甲醇溶液中加入AlCl3和HCl溶液。
图4-1异灯盏花乙素和内标黄芩苷[M+H]+的产物离子全扫描质谱图(A)异灯盏花乙素 (B)黄芩苷图4-2测定血浆中异灯盏花乙素和内标黄芩苷的典型SRM色谱图(A)空白血浆(B)空白血浆加入异灯盏花乙素至50ng/ml和内标黄芩苷至200ng/ml(C)受试者s-1口服含80mg灯盏花乙素的滴丸后5h血浆样品(峰I为黄芩苷，峰II为异灯盏花乙素)图5 LC/MS/MS法测定血浆中异灯盏花乙素浓度标准曲线举例(validation O2)图6 20名受试者口服灯盏花素滴丸80mg后异灯盏花乙素的血药浓度-时间曲线图7 20名受试者口服灯盏花素片80mg后异灯盏花乙素的血药浓度-时间曲线图8 20名受试者口服灯盏花素滴丸和灯盏花素片后异灯盏花乙素的平均药-时曲线
权利要求
1.灯盏花素人体血浆浓度检测方法，其特征在于它是通过检测灯盏花素在人体中主要代谢产物异灯盏花乙素血浆浓度的方法而建立的灯盏花素人体血浆浓度检测方法。
2.权利要求1所述的灯盏花素在人体中的主要代谢产物异灯盏花乙素为灯盏花乙素的同分异构体，经结构确证为6-0-葡萄糖苷酸异构体，其结构式为
3.权利要求1所述的灯盏花素人体中主要代谢产物异灯盏花乙素血浆浓度检测方法，其特征在于它是液相色谱-质谱-质谱联用分析方法。其血浆样品处理方法为向500μl血浆中分别加入1％甲酸甲醇溶液100μl，100μl的浓度为1μg/ml的黄芩苷内标溶液和200μl水，混匀；加3ml提取溶剂乙酸乙酯，涡流混合1min，240次/分往复振荡10min，3500rpm离心5min，分取上层有机相于另一试管中，于40℃氮气流下吹干，残留物加入150μl流动相溶解，涡流混合，取20μl进行液相色谱-质谱-质谱联用分析。其色谱条件为流动相为按容积计65份甲醇-35份水-0.5份甲酸，流速为0.50ml/min，柱温25℃。其质谱条件为离子源为ESI源；源喷雾电压为4.5kV；加热毛细管温度为320℃；N2鞘气压力35Arb；N2辅助气流量10Arb；Ar碰撞气压力1.2mTorr；CID碰撞诱导解离电压均为25eV；正离子方式检测；SRM扫描方式为选择反应监测，用于异灯盏花乙素和黄芩苷定量分析的离子反应分别为m/z 463→m/z 287和m/z447→m/z 271；扫描时间为0.3s。
全文摘要
本发明对灯盏花素在人体中的主要代谢产物异灯盏花乙素结构进行了确证，并通过采用液相色谱－质谱－质谱联用检测健康男性志愿者口服灯盏花素后不同时刻血浆中异灯盏花乙素浓度的方法建立灯盏花素人体血浆浓度检测方法，为灯盏花素人体药代动力学评价、制剂的药学研究、质量标准和工业化生产质控指标的制定提供依据。
文档编号G01N30/00GK1924577SQ20061015193
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月4日 优先权日2006年9月4日
发明者朱丹 申请人:南昌弘益科技有限公司