专利名称：检测食品中过氧化氢快速测试条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物检测技术领域的测试条，具体是一种检测食品中过氧化 氢快速测试条。
技术背景目前，为了杀灭食品中的微生物及增加食品的色悦感，食品生产企业超量或 非法添加氧化剂或漂白剂的现象普遍存在。国内食品质量检验报告显示，部分豆 类加工制品、面制品、鱼丸、盐水鸭、盐水鸡等中均有超量的过氧化氢(双氧水) 残留。香港特区的鱼翅中也检测到了高达1.5%的过氧化氢，《中国食品卫生法》规定，食品及保健品中不得有过氧化氢残留。过氢化氢具有致癌、加速衰老或诱 发心血管疾病等毒性作用。当前检测食品及保健品中过氧化氢的国家标准方法是化学滴定法(GB1616-88高锰酸钾法或碘量法)，该方法的样品前处理过程复杂， 检测时间长，滴定终点难掌握，并且常因食品中有还原性物质(如维生素C等) 的存在导致检测结果偏高，并且检测限一般为100ppm左右，达不到许多微量或 痕量要求。也有研究采用HPLC法检测食品中过氧化氢，此方法需要采用大型精 密仪器，而且样品的前处理过程复杂，检测时间长。运用电化学方法检测过氧化 氧，具有很高的灵敏度，但由于酶电极的修饰和检测条件限制，会导致电极的稳 定性差，不易保存。我国目前还没有建立相应的过氧化氢快速检测国家标准。经对现有技术文献的检索发现，中国专利申请(专利)号为03132054.6， 名称为"一种制备二氧化钛凝胶膜电化学生物传感器的方法"，该专利的关键技 术是采用二氧化钛凝胶膜对电极进行修饰，然后采用电化学的方法来检测过氧化 氢。该方法制备修饰电极的过程相当复杂，而且进行修饰的过程中形成二氧化钛 凝胶膜的厚度和吸附的酶量无法进行有效的控制，导致制备出的修饰电极稳定性 差，而且凝胶膜不利于保存酶的生物活性，导致修饰电极的寿命不超过14天， 因而不能大范围推广过氧化氢的现场快速检测
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测食品中过氧化氢快速 测试条，使其提高生产效率，降低生产成本，并且大大縮短样品处理和检测时间， 实现样品的现场快速检测，用此试条检测过氧化氢，样品前处理简单，检测时间 短， 一般低于90秒；检测限达到0.5ppm，重复性好，试条有效保存期为一年，能够实现食品中过氧化氢的现场快速检测。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所述测试条，是一种光电型生物 传感器，包括绝缘防水基片、反应底物膜片、过滤层、隔离片和盖片，绝缘防水 基片为基底，在绝缘防水基片上设有一个圆孔，在圆孔上方按照反应底物膜片、 过滤层的顺序依次覆盖组装成测试条的反应区域，在反应区域两端覆盖上隔离 片，盖片设置在反应底物膜片、过滤层以及隔离片之上，盖片上设有一个圆孔， 该圆孔与绝缘防水基片上圆孔对齐。所述反应底物膜片、过滤层宽度为5mm，长度与绝缘防水基片宽度相同，盖 片与绝缘防水基片尺寸一致。所述反应底物膜片，是由反应底物膜层和透明的底物膜载片组成，反应底物 膜层均匀的粘附在透明的底物膜载片上。所述反应底物膜层，厚度为200 240nm，其上有过氧化物酶。所述绝缘防水基片和盖片，其厚度为0. 3 0. 5mm，是聚酯片、聚碳酸酯片、 聚苯乙烯片、聚酰亚胺片、聚氯乙烯片、聚乙烯片或聚乙烯对苯二甲酸盐片，优 选聚乙烯对苯二甲酸盐片，该聚合物为片材或巻材。所述绝缘防水基片和盖片上所开圆孔，是以冲压的方式制成，圆孔直径为 0.3 0.4ram，孔壁光滑，无毛刺，其大小应与检测设备接口相一致。所述底物膜载片，为透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、 聚酰亚胺片、聚乙烯片或聚乙烯对苯二甲酸盐片，优选是聚氯乙烯片，最佳厚度 为80 200nm。所述隔离片，其双面带胶贴片，厚度均一，其厚度为0.6mm，是聚酯片、聚 碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰亚胺片、聚氯乙烯片、聚乙烯片或聚乙烯对苯二甲 酸盐片，优选聚氯乙烯片，该聚合物为片材或巻材。所述过滤层是由不吸水、吸附力弱的玻璃纤维片组成，厚度0.5mm。
与现有检测过氧化氢的技术相比，本发明的优点在于，利用生物酶的选择催 化特性在适当的试剂环境下保留良好的生物活性，并进行机械涂膜制作出厚度均 一，检测反应速度快的底物膜片，能够使整个试条的生产进一步简化，提高生产 效率，降低生产成本，并且大大縮短样品处理时间，平均每个样品检测时间为 45秒，检测范围为0.5mg/L -20mg/L，重复样品检测相对标准差(RSD) 8.2%， 检测结果准确率达到98%，能够达到样品的现场快速检测的要求。
图l为本发明快速检测过氧化氢试条的使用检测原理示意图 图2为本发明快速检测过氧化氢试条的结构分解示意图 图3为本发明快速检测过氧化氢试条的横向剖面示意图具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护 范围不限于下述的实施例。实施例1图l为本发明快速检测过氧化氢试条的使用检测原理示意图，从图l看出光信 号变化来源于试条的反应底物膜片颜色的变化。从图2中可以看出本发明快速检 测过氧化氢试条的包括绝缘防水基片l、反应底物膜片2、过滤层3、隔离片4和盖 片5组成。绝缘防水基片1和盖片5叠合后采用机械冲压打孔法打孔，孔径0.3 0.4mm，孔壁距离基片边缘2mm，要求孔壁光滑，无毛刺，这样能降低加样时孔壁 的吸附效应，使样品在加样孔均匀分布，打孔位置要与检测设备接口相配，盖片 5上圆孔为加样孔，基片l上圆孔为测试孔。绝缘防水基片l采用聚酯、聚碳酸酯、 聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸盐组成中任选一种 聚合物制成，优选聚乙烯对苯二甲酸盐。反应底物膜片2包括反应底物膜层和底物膜载片，底物膜载片要求有优良的 光线透射和反射功能，建议采用透明的聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯 乙烯片、聚酰亚胺片、聚乙烯片、聚乙烯对苯二甲酸盐片中一种，优选是聚氯乙 烯片，最佳厚度为80 200nm。反应底物膜层包括显色剂、显色剂保护剂、水溶性高分子、过氧化物酶及酶保活剂，采用涂布成膜法制成。所述显色剂为苯胺、盐酸邻联甲苯胺、四甲基盐 酸邻联甲苯胺等中的一种，其中，优选是盐酸邻联甲苯胺。制作时，称取盐酸邻 联甲苯胺0.285g，加入无水乙醇2mL，然后再加入二氧六环2mL，最后用pH5. 0 的柠檬酸缓冲液定容为100mL，然后加入水溶性壳聚糖4. 5g，脱脂奶粉lg，蔗 糖5g溶于上述溶液中，4'C静置12h，形成凝胶。然后加入柠檬黄50g， lmg/mL 辣根过氧化物酶lmL搅拌均匀，然后在真空干燥器中抽真空30min，再将其放入 4'C静置12h.最后在底物膜承载片上进行涂布成膜，真空冷冻干燥后，进行第二 次涂膜，真空冷冻干燥。过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化作用下能与很多底物反应显色，根据底物 自身稳定性和显色稳定性及试剂综合形成的试剂环境，建议采用苯胺、盐酸邻联 甲苯胺、四甲基盐酸邻联甲苯胺中任意一种。为了提高颜色变化的对比度，向反 应底物层中添加柠檬黄作为底物膜的底色，过氧化氢与显色剂反应显蓝色，蓝色 与黄色底色叠合成具有更明显区分度的绿色，有利于提高传感器的精密度。亲水 高分子物质可以使样品液体快速地进入酶反应层进行反应，并且能阻止疏水性物 质进入酶反应层，降低干扰，还能让底物膜牢牢吸附在底物膜承载片上。所述水 溶性高分子是羧甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素，甲基纤维素和 乙基纤维素，氨基甲基乙基纤维素，明胶，琼脂糖，水溶性壳聚糖中的一种，其 中，优选为水溶性壳聚糖。为了有效延长试条的寿命，向底物中加入适当的显色 剂保护剂和酶保护剂。由于试条是采用光电传感器检测，反应底物膜片2的厚度 及均匀性决定其光线透射和反射功能，采用机械涂布法，制出的膜厚度均一，这 样能够将制作出的一次性试条的差异降到最低。反应底物膜层是称取盐酸邻联甲苯胺0.285g，加入无水乙醇2mL，然后再加 入二氧六环2mL，最后用pH5.0的柠檬酸缓冲液定容为100mL，然后加入水溶性壳 聚糖4.5g，脱脂奶粉lg，蔗糖5g溶于上述溶液中，4。C静置12h，形成凝胶。然后 加入柠檬黄50g， lmg/mL辣根过氧化物酶lniL搅拌均匀，然后在真空干燥器中抽真 空30min，再将其放入4°0静置1211.最后在底物膜承载片上进行涂布成膜，真空冷 冻干燥后，进行第二次涂膜，真空冷冻干燥。然后机械裁剪成比基片小孔略大的 小片，覆盖在基片l的小孔上。过滤层3主要是为了过滤样品中的固体颗粒，防止有色固体颗粒对酶反应层的阻塞和显色干扰，因此选用无色的不吸水、吸附力弱的玻璃纤维片作为过滤层， 尺寸与底物膜片相同，叠合覆盖于反应底物膜片2上。隔离层4既有隔离功能有具 有固定功能，双面带胶贴片，厚度均一，两片隔离片4粘连在绝缘防水基片1上， 将反应底物膜片2和过滤层3卡牢，然后盖上盖片5，将绝缘防水基片1和盖片5粘 连起来，盖片5小孔应与绝缘防水基片1小孔完全重合。隔离片4厚度根据底物层 和过滤层的厚度而定。隔离片4由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚 乙烯对苯二甲酸盐组成中任选一种聚合物制成，优选聚氯乙烯。当试条插入检测设备端口，向盖片的加样孔中加入20微升含有过氧化氢的样 品溶液，溶液透过过滤层，与反应底物膜层中试剂发生显色反应，显色深浅与过 氧化氢的浓度有关，颜色变化通过光电传感器转换为电信号，电信号经过微处理 器处理，通过显示器显示过氧化氢的浓度。以下结合实际操作来介绍过氧化氢测试条的使用。样品处理(l)液体样品用lmL移液器准确移取样品0.9mL，加入过氧化氢 试剂(一)，搅拌均匀，静置5分钟，然后离心，取上清夜，加入过氧化氢试剂(二)， 搅拌均匀后作为待测溶液。(2)固体样品用电子天平称取样品l. OOg，然后加入蒸馏水2mL搅拌l分钟， 然后加入过氧化氢试剂(一)，搅拌均匀，静置5分钟，然后离心，取上清夜，加 入过氧化氢试剂(二)，搅拌均匀后作为待测溶液。将30%的过氧化氢溶液采用高锰酸钾滴定法滴定，然后分别稀释成以下浓 度0. Omg/L、 0. 5mg/L、 lmg/L、 2mg/L、 3mg/L、 4mg/L、 6mg/L、 8mg/L、 12mg/L、 16mg/L、 20mg/L作为标准液。采用含有显色剂O. 01mol/L，辣根过氧化物酶O. 01mg/L配方制作出测试条， 进行测试。将过氧化氢标准液滴在以上述方法制成的过氧化氢测试条的加样孔 中，测定试条在30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒、135秒、150秒后的反射率(加样后试条反射光强/加样前试条反射光强)，每一个过氧化氢浓 度平行测定四次，过氧化氢浓度与传感器测的反射率在加样后75秒时成良好正比例关系。 测试条由绝缘防水基片l、反应底物膜片2、过滤层3、隔离片4和盖片5组成， 绝缘防水基片l为基底，在绝缘防水基片1上设有一个圆？L，在圆孔上方按照反应 底物膜片2、过滤层3的顺序依次覆盖组装成测试条的反应区域，在反应区域两端 覆盖上隔离片4，盖片5设置在反应底物膜片2、过滤层3以及隔离片4之上，盖片5 上设有一个圆孔，该圆孔与绝缘防水基片l上圆孔对齐。测试条的绝缘防水基片l、过滤层3、隔离片4和盖片5所用材料同实施例1， 具体制作过程如下1. 绝缘防水基片1和盖片5打孔。打孔方法、孔径及要求同实施例l。2. 反应底物膜层的制作。试剂配方采用显色剂0.143g，辣根过氧化物酶 0.01mg/L，其他试剂用量及制作方法同实施例l。然后将制备的反应底物膜层机 械裁剪成比基片圆孔略大的小片，覆盖在绝缘防水基片l的小孔上。3. 将玻璃纤维片切割成尺寸与反应底物膜片2相同的小片，叠合覆盖于反应 底物膜片2上，形成过滤层3。4. 粘贴隔离片4，将反应底物膜片2和过滤层3卡牢。5. 盖上盖片5，确保盖片圆孔应与基片圆孔完全重合。 按上述方法制出试条后，样品处理及过氧化氢标准溶液的配置同实施例1 ，然后进行测试。将过氧化氢标准液20微升滴在以上述方法制作的过氧化氢测试条 的加样孔中，测定试条在30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒后的反 射率(加样后试条反射光强/加样前试条反射光强)，每一个过氧化氢浓度平行测 定四次，过氧化氢浓度与传感器测的反射率在加样后45秒时成良好正比例关系。实施例3测试条的绝缘防水基片、过滤层、隔离片和盖片所用材料同实施例l，具体 制作过程如下1. 绝缘防水基片和盖片打孔。打孔方法、孔径及要求同实施例l。2. 反应底物膜层2的制作。试剂配方采用显色剂0.285g，辣根过氧化物酶 0.001mg/L，其他试剂用量及制作方法同实施例l。然后将制备的反应底物膜层机 械裁剪成比基片圆孔略大的小片，覆盖在绝缘防水基片l的小孔上。
3. 将玻璃纤维片切割成尺寸与反应底物膜片2相同的小片，叠合覆盖于反应 底物膜片2上，形成过滤层3。4. 粘贴隔离片4，将反应底物膜片2和过滤层3卡牢。5. 盖上盖片5，确保盖片5圆孔应与绝缘防水基片1圆孔完全重合。 按上述方法制出试条后，样品处理及过氧化氢标准溶液的配置同实施例l，然后进行测试。将过氧化氢标准液20微升滴在以上述方法制成的过氧化氢测试条 的加样孔中，测定试条在30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒后的反 射率(加样后试条反射光强/加样前试条反射光强)，每一个过氧化氢浓度平行测 定四次，过氧化氢浓度与传感器测的反射率在加样后150秒时成良好正比例关系。 根据显色程度和待检样品中的过氧化氢浓度呈线性关系以及检测时间、成本 考虑，采用含有显色剂O. 005mol/L，辣根过氧化物酶0.01mg/L配方制作出测试条 为最优方案，将测试条插入微型光电式传感仪，然后加入样品，45秒后直接读数 便可知样品中过氧化氢的浓度，由此可见采用本发明快速检测过氧化氢试条检测 食品中过氧化氢的含量，样品前处理方法简单，操作方便，检测时间为45秒，检 测范围为0.5mg/L-20mg/L，重复样品检测相对标准差(RSD)8.2%，检测结果准 确率达到98%，可以实现过氧化氢的现场快速检测。
权利要求
1、 一种检测食品中过氧化氢快速测试条，包括绝缘防水基片、反应底物膜 片、过滤层、隔离片和盖片，其特征在于，绝缘防水基片为基底，在绝缘防水基片上设有一个圆？L，在圆孔上方按照反应底物膜片、过滤层的顺序依次覆盖组装成测试条的反应区域，在反应区域两端覆盖上隔离片，盖片设置在反应底物膜片、过滤层以及隔离片之上，盖片上设有一个圆？L，该圆孔与绝缘防水基片上圆孔对 齐。
2、 根据权利要求l所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述反应底物膜片和过滤层，宽度均为5mm，长度均与绝缘防水基片宽度相同，盖 片与绝缘防水基片尺寸相同。
3、 根据权利要求l所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述反应底物膜片，是由反应底物膜层和透明的底物膜载片组成，反应底物膜层均 匀的粘附在透明的底物膜载片上。
4、 根据权利要求3所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述反应底物膜层，厚度为200 240nm，其上有过氧化物酶。
5、 根据权利要求3所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述底物膜载片，为透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰亚 胺片、聚乙烯片或聚乙烯对苯二甲酸盐片。
6、 根据权利要求3或5所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是， 所述底物膜载片，是聚氯乙烯片，厚度为80 200nm。
7、 根据权利要求l所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述绝缘防水基片和盖片，其厚度为0.3 0.5mm，为聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯 乙烯片、聚酰亚胺片、聚氯乙烯片、聚乙烯片或聚乙烯对苯二甲酸盐片。
8、 根据权利要求1或7所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是， 所述绝缘防水基片和盖片，其圆孔直径为0. 3~0. 4mm,孔壁光滑。
9、 根据权利要求1所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述隔离片，其双面带胶贴片，厚度为0.6mm，为聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯 片、聚酰亚胺片、聚氯乙烯片、聚乙烯片或聚乙烯对苯二甲酸盐片。
10、根据权利要求l所述的检测食品中过氧化氢快速测试条，其特征是，所 述过滤层是由玻璃纤维片组成，厚度为0.5mm。
全文摘要
一种生物检测技术领域的检测食品中过氧化氢快速测试条。本发明包括绝缘防水基片、反应底物膜片、过滤层、隔离片和盖片，绝缘防水基片为基底，在绝缘防水基片上设有一个圆孔，在圆孔上方按照反应底物膜片、过滤层的顺序依次覆盖组装成测试条的反应区域，在反应区域两端覆盖上隔离片，盖片设置在反应底物膜片、过滤层以及隔离片之上，盖片上设有一个圆孔，该圆孔与绝缘防水基片上圆孔对齐。用此试条检测过氧化氢，样品前处理简单，检测时间短，一般低于90秒；检测限达到0.5ppm，重复性好，试条有效保存期为一年，能够实现食品中过氧化氢的现场快速检测。
文档编号G01N21/77GK101144782SQ20071004715
公开日2008年3月19日 申请日期2007年10月18日 优先权日2007年10月18日
发明者刘国艳, 刘海峰, 柴春彦 申请人:上海交通大学