新一代早期诊断前列腺癌试剂盒及其制备方法和检测方法

专利名称：新一代早期诊断前列腺癌试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明为一种新的定量检测方法，检测前列腺癌病人血清中前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物标记物方法(包括制备方法和检测方法)。
背景技术：
前列腺癌(prostate cancer)在发达国家中发病率很高，死亡率在第二位。以美国为 例，每年有18万以上新病例。而中国是发展中国家，据2005年的统计显示，每年有1500 万50岁以上的男性进行前列腺癌的相关检査。当前国际上普遍使用的普査和诊断前列腺 癌的方法是总前列腺特异抗原检测方法。总前列腺特异抗原包括游离前列腺特异抗原 (Free PSA或fPSA和复合前列腺特异抗原(complexed PSA或cPSA)。人们认为正常成 年男性前列腺器官产生游离前列腺特异抗原PSA (Wang et al. Invest Urol 1979; 17:159-63; Watt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83:3166-70)，此游离前列 腺特异抗原为蛋白酶(Akiyama et al., FEBS Letters 1987; 225:168-72; Christensson et al.， Eur J Biochem 1990; 194:755-763; Lilja et al. J Clin Invest 1985; 76:1899-903)，当游离前列腺特异抗原从病人前列腺中浸润到病人的血液中时，引起炎 症。此时，血液中抑制游离前列腺特异抗原蛋白质(包括ci卜抗糜蛋白酶，al-抗胰蛋 白酶和a2-巨球蛋白)结合到游离前列腺特异抗原上，形成复合物，例如前列腺特异抗 原与a l-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)，前列腺特异抗原与a l-抗胰蛋白酶复合物 (PSA-AT),前列腺特异性抗原与a2-巨球蛋白复合物(PSA-A2M)，以抑制游离前列腺特异 抗原活性反应(Stenman et al. Cancer Res 1991， 51:222-226; Zhou et al. Clin Chem 1993， 39:2483-91; Leinonen et al. Clin Chem 1993,39:2098-2103; Christensson et al. J Urol 1993,150:100-105; Lilja H. Urol Clin North Am 1993， 20(4):681-686; Liljaetal. Clin Chem 1991， 37:1618-1625; Bjork et al. Urology 1994， 43:427-434; Allard et al. Clin Chem 1998， 44:1216-23)。使游离前列腺特异抗原蛋白酶失去抑制 蛋白酶活性作用。此形成的前列腺特异抗原复合物浓度与前列腺病情成正相关。虽然有几种与游离前列腺特异抗原结合的抑制蛋白酶复合物，其中包括l)前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)， 2)前列腺特异抗原与al-抗胰蛋白酶复合物(PSA-AT) 和3)前列腺特异性抗原与ci2-巨球蛋白复合复合物(PSA-A2M)。其中前列腺特异抗原与 al-抗胰蛋白酶复合物含量很少，占1-3%;而前列腺特异性抗原与a2-巨球蛋白复合物 不能为抗体所识别，只有前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物能被抗体所识别。并 且占有很高的浓度(Stenman et al. Cancer Res 1991, 51:222-226; Zhou et al. Clin Chem 1993: 39:2483-91; Allard et al. Clin Chem 1998， 44: 1216-23)。
目前临床上普遍应用的总前列腺特异抗原检测方法，当其敏感性在90%时，其特异 性只有25%左右(10—31%)，尤其是当总前列腺特异抗原浓度水平在4一10纳克/毫升 之间时，这种检测方法难以区别前列腺癌和前列腺增生(Zhou et al. Clin Chem 1993, 39:2483-91; Allard et al. Clin Chem 1998， 44:1216-23)。如此低的特异性检测方法 难以实际应用在诊断和普査前列腺疾病。近年来，临床诊断上也采用了一种按游离前列 腺特异抗原与总前列腺特异抗原比例的分析方法，来改进总前列腺特异抗原的检测特异 性(Mitrunen et al. Clin Chem 1995, 41 (8) : 1115-1120; Catalona et al. JAMA 1995， 274 (15): 1214-1220; Prestigiacomo and St認y. Scan J Clin Lab Invest 1995， 55 Supple 221:32-34)。即凡前列腺病人血清中含大于25%游离前列腺特异抗原被判断为 正常，而含量小于25%游离前列腺特异抗原被判断为前列腺癌病人。但此方法需同时检 测总前列腺特异抗原和游离前列腺特异抗原，加上游离前列腺特异抗原含量很少和技术 上的误差，导致此方法对检测前列腺病人特异性无显著改进(敏感性在90%时，其特异 性在28%左右(10-45%之间)。目前，拜尔公司发明了一种间接检测复合前列腺特异抗原 总前列腺特异抗原包括游离前列腺特异抗原和复合前列腺特异抗原(complexed PSA or cPSA)方法 (Allard et al. Clin. Chem 1998; 44: 1216-23; Allard et al. US Patent No. :5， 840, 501)，被美国FDA于2000年批准用于临床。但此方法是间接检测复合PSA在 血清中的含量，即检测的总前列腺特异抗原含量减去游离前列腺特异抗原含量获得复合 前列腺特异抗原含量。此方法不能保证所有游离前列腺特异抗原被封闭，故此方法的敏 感性在85%时，特异性仅为32%左右，并没有显著提高前列腺癌病人检测的特异性。另外， 其它几种PSA-ACT检测方法，因其抗体缺乏特异性和检测的浓度过高，并没有显著提高 临床前列腺疾病诊断的特异性(Wang et al. Poster presentation at 1994 IS0BM meeting; Chan et al. Clin Chem 1996， 42 (6):S255; Wang et al. Clin Chem 1997, 43 (6):S225)。本发明方法采用免疫酶联双抗体夹心法，其捕获抗体为抗总前列腺特异性抗原单克隆抗 体。选用抗前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白单克隆抗体，检测前列腺病人血清中 主要的和与前列腺癌紧密相关的前列腺特异性抗原与ct l-抗糜蛋白酶复合蛋白标记物(Bjork et al. Urol 1994, 43 (4) :427—434; Allard et al. Clin. Chem 1998; 44: 1216—23; Allard et al. US Patent No. :5,840,501)，是新一代高特异性检测方法。初步临床实验表明，与当 前普遍应用的临床检测方法相比较，本方法显著提高了检测前列腺病人血清中前列腺特异抗 原与al-抗糜蛋白酶复合物的特异性，从25%左右提高到68%左右。新一代检测前列腺特异抗 原与al-抗糜蛋白酶复合物标记物的试剂盒具有高敏感性，高特异性和高准确性，可作为前 列腺病人普査检测用和疗效追踪诊断用。

发明内容
本发明的基本原理
本发明新一代检测前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白方法基本原理(见图l)。 捕获抗体能特异地识别病人血清样品中的游离前列腺特异抗原和前列腺特异抗原与a l-抗糜 蛋白酶复合蛋白。当加入被酶标记上的抗前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白检测抗 体时，只有血清样品中前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白分子才能被本发明的新一 代免疫酶联双抗体夹心法检测到。而前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白的高含量被 认为与前列腺癌病人密切相关。这是新一代检测方法的核心成分。
本发明的技术方案 l.'本发明试剂盒组分
本发明免疫酶联双抗体夹心法试剂盒用于定量检测前列腺病人血清中前列腺特异抗 原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白质标记物，其组分包括如下
A. 捕获抗体。捕获抗体为免疫球蛋白G单克隆抗体(IgGl)，能特异地识别血清样品中 的游离前列腺特异抗原和前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白，此捕获抗体包 被到酶联板上，完成捕获抗体包被的制备。
B. 检测标记抗体。其抗体亦为免疫球蛋白G单克隆抗体(IgGl)，能特异地识别血清样品
中的前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白，不能单独识别前列腺特异抗原或a
1-抗糜蛋白酶。此单抗可用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase或AP)或者辣根过
氧化物酶(Horseradish Peroxidase或HRP)藕联形成酶联单抗结合物。用其识别样本中的前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物，释放信号。其释放信号能被转换成 被检测分子浓度，用于定量分析。C. 前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白质(Chen et al. Clin Chem 1995， 41 (9) :1273-82)。将前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白质用作制备定量分析 的标准曲线。其前列腺待异抗原与al-抗糜蛋白酶复合抗原浓度梯度为0， 3.125， 6.25， 12.50, 31.25， 78.125， 156.25，和312.50纳克/毫升(前列腺特异抗原浓度梯度 为0， 2, 4， 10， 25， 50和100纳克/毫升)，前列腺特异抗原与甲种糜蛋白酶复合物 保存在10毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠缓冲液中，pH 5.6。可用PBS磷酸盐缓冲 液 (100毫摩尔磷酸/150毫摩尔氯化钠，pH7.2， Pierce, Rockford， IL)和正常 女性血清稀释前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)，正常女性血清不 含前列腺特异原与a 1-抗糜蛋白酶复合物。用其标准曲线计算出样本中前列腺特异抗 原与a 1-抗糜蛋白酶复合物浓度。D. 含有0. 05%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤液.E. 含有2%小牛血清白蛋白的阻断剂，阻止非特异性干扰分子与前列腺特异抗原和al-抗 糜蛋白酶复合物的结合反应。F. 用PBS磷酸盐缓冲液稀释样本。G. 阴性对照，为正常女性血清，不含有任何前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物及 其相似物。H. 阳性对照，为前列腺癌症病人血清含有一定量的前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复 合蛋白质。2.本发明试剂盒的制备方法本发明用于检测前列腺病人血清中的前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白含量，其 试剂盒的制备方法具体描述如下A. 捕获总前列腺特异抗原单克隆抗体包被的酶联板制备:将捕获抗体加至磷酸盐缓冲液 中均匀，加至酶联板孔内，每孔100微升(下同)。室温下孵育二小时后弃去孔内液体， 用含有0.05%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤三次，酶联板拍干后再加入溶于TRIS中的2M 小牛血清白蛋白溶液(250微升/孔)，以排除非特异性反应。在室温下孵育一小时后， 弃去板孔内的液体，洗涤三次，用不干胶片贴于酶联板上，放入4度冰箱中保存待用。B. 前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白抗原标准曲线的制备:将游离前列腺特异 抗原藕联到甲种糜蛋白酶分子上，形成前列腺特异抗原与a卜抗糜蛋白酶复合蛋白(Chen et al. Clin Chem 1995， 41 (9): 1273-82)。将其纯化后获得的前列腺特异性 抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白保存在10毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠缓冲液 (pH 5.6)中备用。C. 酶联检测抗体结合物的制备 将碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶结合到抗前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物抗 体上，将其纯化后获得的酶联检测抗体结合物保存在PBS磷酸缓盐冲液中(RA Biosources， Belmont, CA)。D. 试剂盒其它组分的制备a. 洗涤液为含有0. 05%吐温的磷酸盐洗涤液，b. 显色用的酶底物(蓝磷，Blue Phos)为碱性磷酸酶的底物；ABTS为辣根过氧化物 酶底物，c. 颜色反应终止液为2当量的硫酸溶液，d. 阴性对照为正常女性血清，不含有前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物血清 样本，e. 阳性对照为含有前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合物的前列腺病人血清样 本。3.本发明方法的测定步骤本发明用于检测前列腺病人血清中的前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白标记物 的浓度，其测定步骤如下A. 点样每孔加入100微升血清样品、前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白抗原 样品以及标准对照样品(包括阳性、阴性对照和空白对照)到含有捕获抗体包被的酶 联板孔内。用PBS磷酸盐缓冲液稀释血清样品和标准曲线样品，每个样品双份重复。 在室温下孵育二小时后，弃去孔内液体，洗涤三次，拍干。B. 加入酶联检测抗体结合物。空白对照孔除外，每孔加入100微升2毫微克/毫升碱性磷 酸酶或辣根过氧化物酶藕联的抗前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白结合物， 室温下孵育二小时后，弃去板孔液体，洗涤三次，拍干，用不干胶片贴于酶联板。C. 显色反应。每孔加入100微升酶底物(蓝磷或ABTS底物)溶液，放置室温下观察显色反 应程度。D. 终止显色反应。每孔加入100微升等量的2当量硫酸终止液(用水稀释硫酸液)，与显色液为1:1比例(最终为1当量的硫酸液)。E. 光吸收OD值测定。用酶标仪测定样品显色终止反应后的OD值，如果用了蓝磷底物与 碱性磷酸酶抗体结合物反应，用595-650rrni波长测定其终止OD值；如果用ABTS底物 与辣根过氧化物酶抗体结合物反应的终止产物，用405nm波长测定其终止OD值。F. 数据分析。主要包括一般生物统计学分析测定样品中前列腺特异抗原与甲种糜蛋白酶 复合物的浓度，偏差，相关系数等。G. ROC分析判断病人血清样品中群体临床敏感性和特异性。实验结果本发明采用免疫酶联双抗体夹心法定量测定前列腺病人血清中的前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白标记物。其一，采用的捕获单抗能特异地捕获总前列腺特异抗原分子，包括游离前列腺特异抗原和复合前列腺特异抗原分子；其二采用能特异地识别前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白的检测单克隆抗体，此单抗不能单一识别前列腺特异抗原分子， al-抗糜蛋白酶，al-抗胰蛋白酶和a2-巨球蛋白等或非特异性蛋白分子结合物。其前列腺 特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物是总前列腺特异抗原中主要被检测到的成分。本发明方法的临床实验结果与常用检测前列腺特异抗原方法相比，本发明方法在检测前列腺癌病人血清中的前列腺 特异抗原与甲-l抗糜蛋白酶复合物时敏感度较高， 一般在70-95%之间。而在2.5-10纳克/ 毫升的总前列腺特异抗原灰色区，显著提高了区别前列腺癌和非前列腺癌之间的特异性(当 敏感度达到88%时，本方法的特异性达到68%)。本发明方法在测定前列腺病人血清样本中 前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物达到>10纳克/毫升时，其敏感度接近100%。1.测定前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白含量用的标记曲线(见图2)用高纯度的(〉98%纯度)前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白质在IO毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠的缓冲液(pH 5.6)中保存，用PBS磷酸盐缓冲液或者正常女性血清稀释前列腺特异抗原与a1-抗糜蛋白酶复合蛋白质成不同浓度的样品。其浓度为0，3.125， 6.25, 12.5, 31.25, 78.125， 156， 312.50纳克/毫升，对应于0， 1, 2， 4， 10,25， 50， 100纳克/毫升游离前列腺特异抗原浓度。游离前列腺特异抗原分子量为32千道尔顿，a 1-抗糜蛋白酶复合物分子量为68千道尔顿，前列腺特异性抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物分子量为100千道尔顿，游离前列腺特异抗原与前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物的比例为3. 125(32/100 = 3. 125)。捕获抗体包被酶联板的浓度为2微克/毫升，碱性磷酸酶藕联的检测抗体浓度为2.5纳克/毫升。用蓝磷作为底物反应时，检测 波长为595-650nm;如用ABTS底物与辣根过氧化物酶抗体结合物反应的产物，用405nm 波长测定其OD值。2. ROC分析本发明方法的敏感性和特异性(见图3)60份前列腺病人血清样本，包括35个前列腺癌病人、25个前列腺增生病人。实心 钻石符号表示前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物样本分布曲线，正方形空心符 号表示总前列腺特异抗原样本分布曲线。所有临床前列腺病人均经过活检证实，样本从 纽约罗切斯特大学医学院获得，双盲随机取样。图三表明，纵坐标表示敏感度百分率；横 坐标表示特异性百分率(1一特异性小数再乘以100)。例如，(1-0.3)乘以100%=70% 特异性。如图三表明，当被检测样品达到88.2%的敏感度时，其特异性达到68.2%;而 当其敏感度达到86%时，其特异性达到80%左右。3. 前列腺癌病人与非前列腺癌病人的检测结果分布(见图4)共检测了 IOO个前列腺癌症病人和非前列腺癌症病人血清样本，包括30个前列腺癌 症病人、30个前列腺增生病人以及40个正常男性(50岁以上)对照血清样本。所有前 列腺癌症病人和非前列腺癌症病人血清样本均经活检证实，样本从纽约罗切斯特大学医 学院获得，双盲随机取样。前列腺癌症病人样本总前列腺特异抗原含量均在10纳克/毫 升以上(前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物含量在30纳克/毫升以上)。实心三角 符号表示为前列腺癌症病人样本，空实心方形表示前列腺增生病人样本，空心正方形符 号为正常男性样本。图四梯度纵坐标为所有前列腺癌症病人和非前列腺癌症病人血清样 本总前列腺特异抗原含量，以纳克/毫升为单位，以指数标数。图四表明，前列腺特异抗 原与a卜抗糜蛋白酶复合物含量在10纳克/毫升时(指前列腺特异抗原含量，其区分前列 腺癌症病人和非前列腺癌症病人的临界标准)，本发明方法其敏感度接近100%，特异性 达到95%左右。


图1: 新一代检测前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白(PSA-ACT)免疫酶联双抗 体夹心法基本原理定量检测PSA-ACT复合蛋白质的酶联双抗体夹心法原理示意图PSA为前列腺特异抗原；ACT为a 1-抗糜蛋白酶；HRP or AP为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶藕联到抗前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白抗体分子上，形成前列腺特异抗原与a1-抗种糜蛋白酶复合蛋白结合物，作检测用。图2:测定前列腺特异抗原与ci 1-抗糜蛋白酶复合物含量的标记曲线图3: ROC分析本发明方法的敏感性和特异性图4:前列腺癌病人与非癌症病人血清样本的检测结果分布具体实施方式
1.本发明为免疫酶联双抗体夹心法，定量检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物含量，其试剂盒组分实施例A. 捕获抗体。捕获抗体为免疫球蛋白G单克隆抗体(IgGl)，能特异地识别血清样品中 游离前列腺特异抗原和前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白。用PBS磷酸盐缓 冲液稀释样本，把捕获抗体包被到免疫酶联板孔内(NUNC EIA 96-孔酶联板，96F Maxisorp, Nalge隨C' Rochester, NY),经湿盒孵育二小时后，弃去酶联板孔内的 液体，洗涤三次，加入2%小牛血清白蛋白(2%BSA)。湿盒经孵育l小时后，弃去板 孔内液体，洗涤三次，用不干胶片封盖酶联板，完成捕获抗体包被的制备。B. 检测标记抗体。其抗体亦为免疫球蛋白G单克隆抗体(IgGl)，只能特异地识别血清 样品中的前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白，不能单独识别前列腺特异抗原 或a 1-抗糜蛋白酶。此单抗可用碱性磷酸酶(AP)或者辣根过氧化物酶(服P)藕联形 成酶联单抗结合物。用其藕联形成酶联单抗结合物识别样本中的前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合物。其释放信号能被转换成被检测分子浓度，用于定量分析。C. 前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白质(Chen et al. Clin Chem. 41 (9): 1273-82)。将前列腺特异抗原与a卜抗糜蛋白酶复合蛋白质用作制备定量分析的标准 曲线样本。其前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白质浓度为O， 3.125， 6.25， 12.50， 31.25， 78.125， 156.25，和312.50纳克/毫升，被转换成前列腺特异抗原 浓度为0， 2, 4, 10， 25, 50和100纳克/毫升。前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶 复合物保存在10毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠缓冲液中(pH 5. 6)。前列腺特异抗 原与a 1-抗糜蛋白酶复合物可用PBS磷酸盐缓冲液或正常女性血清稀释。前列腺特异 抗原与al-抗糜蛋白酶复合物经稀释后作标准曲线用。用其标准曲线计算出检测样本 中前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物的浓度。D. 含有0.05%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤液。E. 用2%小牛血清白蛋白的阻断剂阻断非特异性干扰分子与前列腺特异抗原与a 1-抗糜 蛋白酶复合物的结合反应，用PBS磷酸盐缓冲液溶解和稀释。F. PBS磷酸盐缓冲液用于稀释样本(PBS:O. 0078M Na2HP04 *7&0， 0. 0022M KH2P04， 0. 137MNaCl, 0.002MKC1， 0. 05%Tween-20/1% BSA， 0. 02% azide)。G. 阴性对照，为正常女性血清，不含有任何前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物及 其相似物。H. 阳性对照为前列腺癌症病人血清含有一定量的前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复 合蛋白质。2.本发明试剂盒制备的具体方法本发明试剂盒用于检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋 白含量，其试剂盒制备方法如下A. 捕获总前列腺特异性抗原单克隆抗体包被的酶联板制备将捕获抗体加至磷酸盐缓冲液中均匀，加至酶联板孔内每孔100微升2毫微克/ 毫升。室温下孵育二小时后。弃去孔内液体，用含有0. 05%吐温-20磷酸盐缓冲液洗 涤三次，酶联板拍干后再加入溶于TRIS中的2%小牛血清白蛋白溶液，用于阻止非 特异性反应。在室温下孵育一小时后，弃去板孔内的液体，洗涤三次，用不干胶片贴 于酶联板上，放入2-8度冰箱中保存待用。B. 前列腺特异抗原与ci l-抗糜蛋白酶复合蛋白抗原标准曲线的制备将游离前列腺特异抗原藕联到a 1-抗糜蛋白酶分子上，形成前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白。将其纯化后获得的前列腺特异性抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合 蛋白保存在IO毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠缓冲液(pH 5.6)中备用。C. 氧化辣根过氧化物酶(HRP)—检测抗体结合物的制备(RABiosources, Inc., Belmont，CA)D. 试剂盒其它组分的制备a. 洗涤液为含有0.1°/。吐温的磷酸盐洗涤液(IO mM Trizma/0.139M NaC1/2. 0 mM KC1/0. 05% Tween-20， pH 7. 2 - 7. 4 with 0. 02% azide);b. 显色用酶底物是蓝磷(Blue Phos)为碱性磷酸酶底物Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System含有2个组分(A， B).组分A为可溶性lg/L BCIP (5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate)， 组分B为tetrazolium， KPL， Gaithersburg， MD); ABTS为辣根过氧化物酶底ABST Peroxidase Substrate System含有2个组分(A,B).组分A为O. 3g/L 2,2' -azino-di-3 ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)甘油/柠檬酸缓冲液，组分B为0. 02% H202， KPL， Gaithersburg, MD);c. 颜色反应终止液为2当量的硫酸溶液；d. 阴性对照为正常女性血清，不含有前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物血清样 本；e. 阳性对照为含有前列腺特异抗原与ci 1-抗糜蛋白酶复合物的前列腺病人血清样本。3.本发明方法定量检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物浓度具 体方法及步骤A. 点样每孔加入100微升血清样品和前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白抗原 样品以及标准对照样品(包括阳性、阴性对照和空白对照)到含有捕获抗体包被的酶 联板孔内。其前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合抗原浓度为0， 3.125， 6.25， 12.50, 31.25， 78.125， 156.25，和312.50纳克/毫升，被转换成前列腺特异抗原 浓度为0， 2, 4， 10, 25, 50和100纳克/毫升。前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶 复合物保存在10毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠缓冲液中(pH5.6)。用PBS磷酸 盐缓冲液稀释血清样品和标准曲线样品，每个样品双份重复。在室温下孵育二小时后， 弃去孔内液体，洗涤三次，拍干。B. 加入酶联检测抗体结合物。空白对照孔除外，每孔加入100微升2. 5毫微克/毫升过 氧化物酶藕联的抗前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合蛋白结合物，室温下孵育二 小时后，弃去板孔液体，洗涤三次，拍干，用不干胶片贴于酶联板。C. 显色反应。每孔加入IOO微升酶底物(蓝磷或ABTS)溶液，放置室温下观察显色反应 程度。D. 终止显色反应。每孔加入100微升等量的2当量硫酸终止液(用水稀释硫酸液)，与显 色液为1:1比例(最终为1当量的硫酸液)。E. 光吸收OD值测定。用酶标仪测定样品显色终止反应后的OD值,用405nm波长测定其 ABTS底物与辣根过氧化物酶抗体结合物反应的终止产物OD值。酶标仪为ELISA Microplate Reader, Model:VERS max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)F. 数据分析。生物统计学分析方法，主要包括测定样品中前列腺特异抗原与al-抗糜蛋 白酶复合物的浓度，偏差，相关系数,分析方法等。G. 临床敏感性和特异性分析模型(ROC)分析判断病人血清样品中群体临床敏感度和特异 性。 '
权利要求
1.一种用于定量检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合蛋白标记物的免疫酶联双抗体夹心法试剂盒，其组分包括1)抗总前列腺特异抗原(抗原包括游离前列腺特异抗原和复合前列腺特异抗原)的单克隆抗体，作为免疫酶联双抗体夹心法试剂盒捕获抗体；2)溶于磷酸缓冲液中的小牛血清白蛋白(2％)，以排除非特异性反应；3)前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)做标准曲线，用于定量分析；4)抗前列腺特异性抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物抗体和碱性磷酸酶或辣根过化物酶藕联结合物，用于标记检测前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合蛋白；5)含有吐温(0.05％TWEEN-20)的磷酸洗涤液；6)稀释样品的磷酸盐缓冲液；7)阴性对照，为正常女性血清样品(不含前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物存在)；8)阳性对照，含有前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物的前列腺病人血清样品。
2. 权利要求二一种新的定量检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物试剂盒的 制备方法，其特征如下1) 捕获总PSA单克隆抗体包被的酶联板制备 将捕获抗体加至PBS磷酸盐缓冲液中均匀，加至酶联板孔内(100微升/孔)，室温下孵育 二小时后，弃去孔内液体。用含有0. 05%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤三次，将酶联板拍千， 再加入溶于TRIS中的2%小牛血清白蛋白溶液(250微升/ L)。在室温下孵育一小时后， 弃去板孔内的液体，洗涤三次，用不干胶片贴于酶联板上，放入2-8度冰箱中保存待用。2) 制备前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合蛋白，用其作为于标准曲线将游离前列腺特异抗原藕联到a 1-抗糜蛋白酶分子上，形成前列腺特异抗原与a 1-抗糜 蛋白酶复合蛋白(PSA-ACT)。将经纯化获得的前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物 (PSA-ACT)标记物保存在10毫摩尔醋酸钠/150毫摩尔氯化钠缓冲液/O. 05% sodium azide (w/v), pH 5. 6中备用。3) 酶联检测抗体结合物的制备 将碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶结合到抗前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物抗体 上，获得高纯度的酶联检测抗体结合物待用。4) 其它试剂盒组分的制备A. 洗涤液为含有0. 05%吐温的磷酸盐洗涤液；B. 显色用的酶底物(蓝磷，Blue Phos)为碱性磷酸酶的底物；ABTS为辣根过氧化物酶底 物；C. 颜色反应终止液为2当量的硫酸溶液；D. 阴性对照为正常女性血清，不含有前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合物血清样 本；E. 阳性对照为含有前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合物的前列腺病人血清样本。
3.权利要求三一种新的用于定量检测血清样品中前列腺特异抗原与a l-抗糜蛋白酶复合物的检测 方法，其步骤如下A. 点样血清样品、前列腺特异抗原与a1-抗糜蛋白酶复合蛋白样品以及对照标准样品(包括阳性、阴性对照和空白对照)加入到有捕获抗体包被的酶联板内。用磷酸盐缓 冲液稀释血清样品和标准曲线样品，每个样品双份重复。在室温下孵育二小时后，弃 去孔内液体，洗涤三次，拍干。B. 加入酶联检测抗体结合物(100微升/孔)。除空白对照外，每孔加入碱性磷酸酶或辣根 过氧化物酶藕联的抗前列腺特异抗原与a 1-抗糜蛋白酶复合蛋白抗体结合物，在室温 下孵育二小时后，弃去酶联板孔液体，洗涤三次，拍干，用不干胶片贴于酶联板。C. 显色反应。每孔加入100微升酶底物溶液，放置室温下观察显色反应。D. 终止显色反应。每孔加入等量的终止液(2当量的硫酸液)E. 光吸收OD值测定。用酶标仪测定样品显色终止反应后的终止OD值，如果用蓝磷作为 碱性磷酸酶底物，值用595-650nm波长来测定与碱性磷酸酶抗体结合物反应后的终止 OD值；如果用ABTS作为辣根过氧化物酶底物，用405nm波长来测定与辣根过氧化物 酶抗体结合物反应后OD值。F. 数据分析。主要包括一般生物统计学分析测定样品前列腺特异抗原与al-抗糜蛋白酶复合物的浓度，偏差，相关系数等。G. 临床敏感性和特异性分析模型(ROC， Receiver Operator Characteristic)分析判断 前列腺病人血清样品中的群体敏感性和特异性。
全文摘要
本发明是新一代早期诊断前列腺癌试剂盒及其制备方法和检测方法，是一种新的定量检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与α₁-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)的方法，包括制备和检测方法。本发明应用免疫酶联双抗体夹心法测定与前列腺癌紧密相关的肿瘤标记物——前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物。其双抗体包括捕获总前列腺特异抗原(total PSA)(游离前列腺特异抗原(Free PSA)和复合前列腺特异抗原(Complexed PSA)的单克隆抗体和特异地结合到前列腺特异抗原与α₁-抗糜蛋白酶复合蛋白质上的检测单克隆抗体。本发明试剂盒用于检测前列腺病人血清中前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合蛋白，具有高敏感性、高特异性和高准确性。本方法可广泛用于前列腺病人的普查、临床诊断和疗效跟踪观察。
文档编号G01N33/577GK101329343SQ20071005766
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者吴澄宇, 周泽奇 申请人:天津迪爱盟生物技术有限公司