专利名称：一种针对水产食品中氟喹诺酮类药物残留的可视化检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水产食品中药物残留的方法，具体地说是涉及一种检测氟喹诺酮 类药物残留的方法。本发明由国家自然科学基金项目(No. 30400336)和青岛市科技项目 (03-1-NSH-2-2)资助完成。
背景技术：
氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones, FQs)是人工合成的新型广谱杀菌性抗菌药物，具 有抗菌谱广，抗菌活性强，毒副作用小及与其他抗生素和抗菌药物之间交叉耐药性小等优 点，因而广泛用于水产及畜禽养殖，已经成为我国目前常用的鱼药和兽药之一。由于大量 和长期使用氟喹诺酮类药物，使得氟喹诺酮类药物在体内蓄积，并造成药物在动物组织内 残留，从而对食品卫生及人类健康具有潜在的危害性。近年来，关于FQs药物临床应用时 所产生的耐药性、残留毒性以及不良反应的报道越来越多，食品中相应残留的检测也愈加 引起人们的重视。目前检测氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、色谱一 质谱联用法(LC-MS)等。微生物法操作简便，但检测的周期长，灵敏度低；仪器检测法虽 然非常灵敏、准确，但耗时长、耗资大，对人员素质要求高，不适合现场快速检测。酶联 免疫吸附法(ELISA)作为一种快速特异和灵敏度较高的免疫检测技术应用于药物残留的 检测体现了其优越性，但最快也要几个小时才能报告检测结果。1. 微生物法微生物法是一种抗菌药物残留检测的筛选方法，其缺点方法的特异性较差，多种因素 都可以显著影响检测结果，而且分析周期长，一般不易于短期内取得结果。0kerman等(1998) 报道了用改进的欧洲四平皿法(Four-PlateTest， FPT)检测市场上零售肉中恩诺沙星和环 丙沙星的残留，四平皿法虽能检测高浓度氟喹诺酮类药物的残留，但该法的检测限高于欧 盟(EC)所规定的最低残留限量(MRL)。2. 液相色谱法(LC法)高效液相色谱法(HPLC)是目前最为常用的色谱方法，目前国内外相关标准中基本采 用该方法为检测氟喹诺酮类药物残留的标准方法。其优点在于灵敏度高，检测限大多低于10ppb，精确度较高(回收率一般大于70%)，稳定性也比较好，但该法需要价格昂贵的色 谱仪器以及相关的实验室条件，操作人员要求具有较高的专业技术水平，仪器的维护保养 也较为繁琐，在目前情况下难以在养殖和加工现场针对大量样品开展快速分析和现场检 测。3. 液相色谱一质谱联用法(LC-MS法)LC-MS法是对液相色谱法的进一步改进提高，其检测灵敏度高，也更为准确精密。如 Turnipseed等(1998)报道了戳鱼肌肉中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和双氟沙星多残 留确证的LC-MS检测。但该法所需的仪器设备更加昂贵，步骤烦琐， 一般仅用于残留的确 认性检测。4. 免疫分析方法目前用于氟喹诺酮类药残检测的免疫分析手段主要是酶联免疫反应(ELISA)。它具有 高度的专一性和灵敏度，但是分析程序较为烦琐，最快也要几个小时才能报告检测结果， 操作人员需要具有较高的专业技能及操作经验；酶对于外界因素的干扰较为敏感，检测结 果的稳定性较差；此外需要酶标仪等仪器设备， 一般需要在实验室中进行，难以进行现场 检测。发明内容针对上述方法存在的问题，本发明提出了一种利用金标记免疫技术对水产食品中不同 氟喹诺酮类药物残留进行可视性现场快速检测的方法。 本发明的检测方法包括以下步骤(1) 首先利用生物免疫技术，以牛血清蛋白(BSA)为载体蛋白，与氟喹诺酮类药物偶连形成完全抗原，分别免疫小鼠和新西兰兔来制备相应的抗体，分别用于胶体金的标记以及硝酸纤维素膜的包被；(2) 制备纳米级的胶体金颗粒，并且将其与小鼠抗体反应，形成胶体金标记的抗体材料；G)自制反应板，在下部依次填充吸水滤纸和硝酸纤维素膜，膜的正面向上并对准 上部小孔后固定；(4) 硝酸纤维素膜预先进行兔源抗体的包被和封闭；(5) 将硝酸纤维素膜裁剪成边长lcm的方形小片，在膜的正面用铅笔画出直径3 — 4mm的圆圈，在圈内点样。点样的顺序为a、取5pL样品液滴加到反应板中央，室 温下反应15min，b、 5pL胶体金标记的鼠源抗体，渗入反应5min; c、 0.01mol/L， pH=7.4 的PBS (含有0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液)漂洗三次；(6)同时以不含待测底物的缓冲液为样品，按照同样次序加入，作为阴性对照；肉 眼观察结果，红色斑点判断为阳性样本，即含有待测药物残留；否则为阴性样本。 与其它测定方法相比较，本方明的主要优点在于(1) 有效缩短了分析时间，操作更为简便快速， 一般可以在半小时内完成检测，明 显优于其它现有方法；(2) 检测为可视化操作，肉眼判断结果，不需要复杂的设备等实验条件；(3) 可以组装成试剂盒，便于携带组装，能够适用于不同场所，实现现场分析或在 线检测，尤其适合现场大量样品的快速筛选处理；(4) 利用抗体的交叉反应性能，可应用于多种氟喹诺酮类药残的分析检测。
图l是本发明用于加标检测鳗鱼肉中三种沙星的结果。其中，O-表示空白；E卜E2 、 E3分别表示浓度为20ng/mL、 50ng/mL、 100ng/mL的恩 诺沙星；Q、 C2 、 C3分别表示浓度为20ng/mL、 50 ng/mL、 100ng/mL的环丙沙星；N!、 N2 、 N3分别表示浓度为50ng/mL、 100ng/mL、 150 ng/mL的诺氟沙星。图2是HPLC加标检测鳗鱼肉中三种沙星的图谱。
具体实施方式
实施例l:鳗鱼中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星残留的快速检测1、抗体的制备首先配制磷酸盐缓冲液(O.OIM， pH7.4，简称PBS):取NaCl 8g， KC1 0.2g， Na2HP04.12H20 2.9g， KH2PO42.0g，加双蒸水至1000mL，过0.22pm膜，室温保存。碳二亚胺法合成程序为取15mgEF， 5.2mgNHS， 9.3mgEDC溶于0.5mL 二甲基甲 酰胺(简称DMF)中，室温振荡1.5h; 3000r/min离心30s，上清加入2mL含25mg载体 蛋白(牛血清白蛋白)的PBS溶液(预先溶有33X的DMF)，恒温振荡过夜(150r/min， 4'C);然后将反应物装入透析带中，先用含33%DMF的PBS溶液透析，逐步减少DMF 的量直至完全用PBS，透析完全后冻干，-S(TC保存。选取6~8周龄的健康BALB/C小鼠，进行免疫试验。免疫前采血作为阴性血清。将 10mg完全抗原(以蛋白浓度计)溶于l.OmL生理盐水中，与等量的弗氏完全佐剂(CFA)
充分混合形成乳浊液后进行腹腔注射，0.3mL/只，间隔两周加强免疫一次，剂量与方法同 初次免疫，只是CFA换成弗氏不完全佐剂(IFA),总共加强免疫三次。最后一次免疫后 7d摘眼球取血，离心取上清液，-80°0贮存备用。选取健康的新西兰雌性大白兔，静养一周后耳动脉取血作为阴性血清。将10mg完全 抗原(以蛋白浓度计)溶于1.0mL生理盐水中，与等量的弗氏完全佐剂(CFA)充分混合 形成乳浊液后进行颈部皮下散点注射(0.1mL/点)，l.OmL/只，间隔两周加强免疫一次， 剂量与方法同初次免疫，只是CFA换成IFA (弗氏不完全佐剂)，重复三次。最后一次不 加佐剂，直接由耳静脉注射抗原，7天后颈动脉取血，离心取上清液，-S(TC贮存备用。 2、抗体的纯化取lmL抗体与lmLPBS混合，按照40%硫酸铵饱和度加入相应的硫酸铵，在冰浴中搅 拌30min使蛋白沉淀出来，4"C下10000转/分离心15min，将上清液移出，沉淀用lmLPBS 溶解，在0.01MPBS中透析48h，每12h更换透析液一次。粗纯后经ELISA筛选到的具有抗体活性的组分，4'C10000r/min离心处理60min，使用 superdexTM75柱分离(1.5mL/min， 280nm测吸光值)，收集各组分采用ELISA进行抗体活 性鉴定，取其中活性最高者为检测材料。3 、金标记抗体的制备取lmU^的氯金酸溶液于100mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，转移至250mL烧杯 中，在磁力搅拌器上加热至沸腾，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H507 H20)水 溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min中内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后用超 纯水恢复到原来体积。即可制成15nm粒径的胶体金。将20mL制备好的胶体金溶液调节至pH8.0，加入纯化好的鼠抗体lmg，混匀，室温下 搅拌反应10min，加入5X的BSA至终浓度为1W，再次反应10min， 4。C下4000r/min离心 20min，弃去沉淀，上清液再次4。C下10000r/min离心60min，小心移去上清液，沉淀重新 溶解于2mL含有lXBSA、 0.02^NaN3的0.01MpH8.0的磷酸缓冲液中，即为10%浓縮的胶 体金标记多抗溶液，4t:下保存备用。4 、硝酸纤维素膜的包被与封闭用pH=9.6碳酸盐缓冲液(CBS)包被恩诺沙星兔多抗，每点20pL， 37。C包被2h， 0.1。/o牛血清白蛋白37'C封闭2h，含0.1%吐温的磷酸缓冲液(PBST， pH=7.4)洗涤3次。 5、样品前处理5. 空白样品用电动匀浆机匀浆，称取5.0g匀浆后的样品，添加不同浓度的沙星标准品，
加入5mL甲醇-PBS (1:1,V/V)混合提取液，于高速均质机处理2min， 4"C下以4000r/min 离心10min，转移上清液；沉淀用同样方法重复处理一次，合并两次上清；上清液再次以 4'C10000r/min离心10min，弃去沉淀；上清液在45'C真空旋转蒸发15min, 4000r/min离 心2min，上清液定容至5mL。取lmL过0.22pm微孔滤膜，备用。 5、样品检测取5^L样品液滴加到硝酸纤维素膜中央，室温下反应15min;滴加5pL金标抗体，待 其渗入后反应5min;用洗涤液反复洗涤三次，肉眼观察结果。同时以不加沙星的提取液 为阴性对照。与对照相比出现肉眼可见的红色斑点则判断为阳性样本，否则为阴性结果。 检测结果如图1所示，三种不同种类和浓度的沙星均呈现阳性。 对照例l:用高效液相色谱法(HPLC)检测恩诺沙星和诺氟沙星样品处理方法同上。色谱条件 色谱柱反相色谱柱ds柱(300mmX4. 6mm)流动相乙腈四丁基溴化铵溶液=5: 95 (V/V)流速1. 5mlVmin激发波长280咖，发射波长450nm柱温40°C 进样量20nL 液相色谱图见图2。 实施例2:本发明检测效果及其与HPLC法的比较表1 HPLC法对加标鳗鱼肉的检测结果(n-3)添加浓度回收率 (%)平均回收率 (%)相对标准偏差 (%)恩诺沙星1069.3/65.9/72.469.22.652073.7/69.8〃8.273.93.435070.1/67.6/78.372.04.57环丙沙星1078.9/70.2/74.774.63.552084.5/80.6〃9.981.72.025086.9/79.3/84.483.53.16诺氟沙星1069.5/73.麵.970.12.852075.6/74,5/68.572.93.125071.9/82.1/75,876.64.20 目前国内外对于食品中氟喹诺酮类药残的要求，根据不同药物品种和不同食品类型存 在差异，但最低检出限一般要求在50ng/kg以上。采用本发明的检测方法，恩诺沙星和环 丙沙星在添加浓度为20ng/mL时，肉眼可以判断为阳性，而诺氟沙星检出限则在50ng/mL; 同一检测重复三次的结果基本一致；前处理方法的加标回收率基本可以保证在70%以上。 这表明，该方法的主要性能，如灵敏度、准确度等完全可以满足实际检测的要求；但检测 时间只需要25-30分钟，明显少于HPLC;操作较为简便，阳性结果肉眼可见，不需要大 型、昂贵的仪器设备，非常适合于现场大量样品的定性快速筛选检测。
权利要求
1.一种针对水产食品中氟喹诺酮类药物残留的可视化检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)首先以牛血清蛋白为载体蛋白，结合氟喹诺酮类药物偶连形成完全抗原来制备两种不同的特异性抗体，分别用于胶体金的标记以及硝酸纤维素膜的包被；(2)以制备的一种特异性抗体与纳米胶体金颗粒结合形成金标记抗体材料；(3)以硝酸纤维素膜为固相载体包被另外一种特异性抗体，并进行封闭；(4)将样品提取液、金标记抗体液以及洗涤液分别点到硝酸纤维素膜上；(5)同时以不含有待测物的提取液代替样品液，以同样次序点膜反应，作为阴性对照；(6)样本膜与对照膜进行比较，以出现肉眼可见的红色斑点判断为阳性样本，即含有待测药物残留；否则为阴性样本。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于未知样中的氟喹诺酮类药物在测定前需 要进行提取纯化。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的氟喹诺酮类药物为恩诺沙星、环 丙沙星或诺氟沙星。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的特异性抗体为鼠源抗 体。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的特异性抗体为兔源抗 体。
全文摘要
本发明公开了一种针对水产食品中氟喹诺酮类药物残留的可视化检测方法，该方法利用生物免疫技术，以牛血清蛋白为载体蛋白，偶联氟喹诺酮类药物制备相应的特异性抗体；将制备的特异性抗体与红色的胶体金颗粒结合形成金标记抗体材料；以硝酸纤维素膜为固相载体，事先以另外来源的抗体进行包被和封闭；依次将样品液、金标抗体和洗液点膜，同时以不含有待测物的提取液制备阴性对照；与阴性对照比较，根据出现肉眼可见的红色斑点的出现与否，判断样本是否为含有待测物的阳性样本。本发明具有较高的灵敏度和准确度，操作简便快速，不需要额外的分析仪器设备，结果肉眼可见，可应用于多种氟喹诺酮类药残的现场快速筛选检测。
文档编号G01N33/543GK101210923SQ20071011607
公开日2008年7月2日 申请日期2007年12月20日 优先权日2007年12月20日
发明者曹立民, 李振兴, 洪 林, 洁 江, 隋建新 申请人:中国海洋大学