专利名称：检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于食品安全中食源性致病微生物检测领域，具体涉及一种定性和定量快速 地检测样品中食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
在全球人口流动日益频繁、食品贸易日趋强劲的当今时代，食源性微生物中毒j乍为 威胁人体健康的一个重要因素，日益引起世界各国科技界的重视。大量的统计数据和文 献资料表明，大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、 志贺氏菌、肉毒杆菌、副溶血弧菌、变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、粪 链球菌、致病性大肠杆菌以及隐孢子虫等微生物是严重危害人类健康的致病性微生物。 这些强致病微生物通过食物链侵入人体，在人类中引起疾病的发生和传播。因此，建立 一整套预防、监督、评估的预警体系，是有效控制致病微生物进入人类食物链的重要途 径，而作为这套体系的核心部分之一，是建立准确、快速、便捷的微生物检测技术。
食品样本中致病微生物的数量往往差异很大，大多数污染的食物样本中致病微生物
的数量是很少的，检测前一般都需要经过增菌的步骤。即根据不同致病微生物增菌条件 的不同，利用选择性富集培养基或者采用免疫纳米磁珠进行富集和分离。富集之后主要 采用传统方法(如培养法)、分子生物学方法(如聚合酶链式反应PCR法)、免疫学方 法(如酶联免疫吸附ELISA法和免疫层析技术)，实现定性和定量检测。在食品安全检 测中，为了达到快捷的目的，往往采用免疫学方法，例如先用ELISA进行初筛后，再 对阳性样本用培养法进行确证。但是这些广泛适用的检测方法都存在不同的弊端，例如 先将菌体富集再进行培养的方法，需要经过培养的歩骤，从而花费了大量的时间；而 ELISA方法则普遍存在假阳性的问题，增加了检验的复杂性。另外，htl于以上方法均需 借助昂贵而复杂的仪器和设备，成本高，同时对操作人员需要特殊培训，实验结果无法 立即显示。因此不适合于商检、防疫、食品生产者快速在线检测和监控。
免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤 维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测 物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层 析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如显示出不同的颜色)。而 游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示 踪标记粒子有胶体金，乳胶，胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。 但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷
(1) 胶体金标记过程是静电吸附过程，是一种物理吸附，故在液相中稳定性较差， 往往造成己标记上的蛋白分子又再次脱落。
(2) 检测结果通过显示单一的紫红色条带来判断，颜色单一，难以实现多检和联检。
(3) 只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条 带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。
(4) 不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。
(5) 检测灵敏度较低。
(6) 无法实现定量检测。
目前也出现了利用彩色乳胶等标记快速免疫层析试纸条的检测方法，但是这些方法 并不能完全实现对检测物的定量检测。
发明内容
本发明的一个目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高，操作简便的定 性和定量检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条；本发明的另一个目的是提 供上述试纸条的制备方法。
为了实现上述目的本发明采取的一个技术方案是
提供一种检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条，它包括底板，以及在 底板上依次搭接地粘贴的滤纸，样本垫，玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜和吸水纸，其中所 述的玻璃纤维膜上喷涂有荧光微球标记的食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体， 所述的硝酸纤维素膜上包被有食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体作为检测区 和包被有抗鼠抗体作为质控区。
所述荧光微球是用聚合材料或二氧化硅包裹荧光物质所制成的微球，其表面连接有 活性基团，或与链霉亲和素偶联，该微球的直径为0.01 10 所述聚合材料为聚苯 乙烯，所述荧光物质包括有机的或无机的荧光物质或由多种荧光物质组成的惨杂物以及 量子点。
所述的活性基团为一CHO、 -COOH、 -OH、 -NH2或-SH;所述荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯、香豆素或其
掺杂物或量子点。
本发明采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测食源性致病微生物的荧光
微球免疫层析试纸条的方法，它包括如下的歩骤 1.硝酸纤维素膜的制备； 检测区和质控区的制备
分别将食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素
膜上，制成检测区和质控区。用0.01 0.1MpH7.2的PBS (磷酸盐缓冲溶液)分别调 节包被物浓度为0.5 8.0 mg/mL，喷膜量为0.74 ^L/cm，检测区喷涂食源性致病微生物 多克隆抗体或单克隆抗体，质控区喷涂抗鼠抗体，两区相隔5mm。在多检情况下；用 多种食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体在检测区包被多条检测区，无质控区， 各检测线间相隔5 mm。制备好的硝酸纤维素膜在37 'C烘干处理过夜后，室温干燥的 环境下保存备用。
2.荧光微球垫的制备；
(1) 荧光微球的制备常规方法制备包裹不同荧光物质的荧光微球。
(2) 用荧光微球标记食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体，并将其喷涂在玻璃 纤维膜上。 .
用荧光微球通过共价偶联的方式标记食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体取
微球在1000Xg离心10 15min，离心后收集沉淀，用0.01 MpH 4.8的硼酸盐缓冲液调节 微球浓度为OD450=0.2，然后分别加入20 100mg/mLEDC (乙基-N， N-二甲基丙基碳二 亚胺)，和2 20 mg/mL NHS (氮羟基琥珀酰亚胺)，振荡混匀，室温下孵育10 30 min 后，1000Xg离心5 15 min，沉淀用0.01 M pH 4.8的硼酸盐缓冲液溶解，调节微球浓度 为0045()为0.2 1.0。 1 mL荧光微球中加入0.1 100吗的食源性致病微生物单克隆抗体 或多克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应l 4h，超纯水离心洗涤2 5次，沉淀用O.Ol M pH 7.2的PBS复溶沉淀至起始体积后，用BIODOT Dispensing System (BIODOT操作平 台)喷涂至玻璃纤维膜上，25'C真空干燥l 2h，放于室温干燥的环境下备用。 所述的荧光微球标记的食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体选自-抗原识别位点为微生物表面特异性蛋白、糖蛋白或者脂多糖，鞭毛蛋白等，包括单 核细胞增生李斯特菌表面蛋白IntemalinA,大肠杆菌表面脂多糖、大肠杆菌表面部分O
多糖等的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。3.组装试纸条；
在底板上依次搭接地粘贴下述材料
(1)滤纸；(2)样本垫；(3)荧光微球垫；(4)有食源性致病微生物多克隆抗体或单 克隆抗体作为检测区和有抗鼠抗体作为质控区的硝酸纤维素膜；(5)吸水纸，即组装成本 发明的荧光微球免疫层析试纸条。
用上述的荧光微球免疫层析试纸条定性检测样本中食源性致病微生物的方法，包括如 下的歩骤
(1) 按常规方法处理样本，使之成为液状样品，必要时要经过增菌富集歩骤；
(2) 在试纸条的样本垫上加入样本，反应10min后，将检测试纸条放入检测窗口；
(3) 荧光微球在灯源激发下，发出强烈的荧光；
(4) 当样本中不含有被检测微生物时，检测区不出现条带，而质控区出现一条k光
条带，即检测样本为阴性；当样本中含有过量被检测物质时，检测区和质控区均出现 一条荧光条带，检测样本即为阳性。
用上述的荧光微球免疫层析试纸条定量检测食源性致病微生物的方法，包括如下的步 骤、
(1) 按常规方法处理样本，使之成为液状样品，必要时经过增菌富集歩骤；
(2) 在试纸条的样本垫上加入样本，反应10min后，将检测试纸条放入检测窗口；
(3) 截留在检测区和质控区的荧光微球在灯源激发下，发出强烈的荧光条带；
(4) 发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管，送入光电倍增管，光 信号得到增强，再经过信号转换元件，经过软件处理后，荧光的强弱以数值的高低在 显示器上显示；以不同已知浓度的被检测食源性致病微生物的标准物作检测，获得一 系列数值后，绘制被检测食源性致病微生物浓度与荧光强弱数值关系的标准曲线。
(5) 根据检测样本的显示数值，即可根据上述的标准曲线得出检测样本中食源性致 病微生物的浓度。
本发明的有益效果是 1.灵敏度高荧光物质由于发射光谱比激发光谱长，而且荧光光谱是发射光谱，可以 在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大 高于紫外-可见吸收光谱，其灵敏度是用传统的染料和有色标记物质检测方法的10 1000 倍，达到10"CFU/mL。而荧光标记检测方法与这两种方法相比，还具有易于操作，检测快 速，价格低廉等优点。由于荧光物质发光强度大，从而有利子大大地提高检测灵敏度，扩
8大可检测物的范围和种类。
2. 微球表面携带活性化学基团，抗体标记使用的是化学偶联方法，形成抗体与微球的 稳固结合。
3. 不同粒径和种类的量子点在相同的激发光谱下，能够发出多种颜色的条带；不同无 机或者有机荧光染料按照不同比例掺混时能够发射不同的颜色，从而实现多检和联检。
4. 通过CCD扫描技术把过滤后的发射光谱收集后，再发送到荧光分析检测仪以及经过 软件处理，把荧光信号数值化，从而实现定量检测。
5. 荧光微球表面往往包裹了聚合物或者二氧化硅，实现对荧光物质的保护，减少外界 环境的干扰，增加荧光微球稳定性以及荧光寿命。
6. 本发明能够快速准确地对食源性致病微生物实现定性和定量检测。
图1是检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的结构图2是定性和定量检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的检测原理图3是一种简易荧光检测仪的检测原理及其结构示意图。
如图1所示，该荧光微球免疫层析试纸条的构成为在粘性底板18上，依次搭接地 粘贴滤纸11、样本垫12、喷涂有荧光微球标记的食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗 体的玻璃纤维膜13、包被有食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体的检测区15和包 被有抗鼠抗体的质控区16的硝酸纤维素膜14和吸水纸17。质控区距吸水纸2 mm，质控 区和检测区间隔5mm。
如图1和2所示，检测原理如下在样本垫12上滴加样品，检测试纸条放入检测窗 口41;当检测样本中不包含待检测食源性致病微生物时，荧光微球标记的食源性致病微生 物单克隆抗体或多克隆抗体不会直接与检测区15上包被的食源性致病微生物多克隆抗体 或单克隆抗体结合，而只与质控区'16上的抗鼠抗体特异性结合，待检样本43在光源42 激发下，发射的荧光44通过单色光滤光片35过滤后，通过观察窗口 36在质控区16能够 观察到一条清晰的荧光条带检测区15无荧光条带。当待检样本43中含待检测食源性致病 微生物且含量超过检测限时，样本中的食源性致病微生物会特异性地与荧光微球标记的食 源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体结合，然后被检测区15的食源性致病微生物多 克隆抗体或单克隆抗体捕获，多余的荧光标记食源性致病菌微生物单克隆抗体或多克隆抗 体与质控区的抗鼠抗体结合，所以在简易荧光检测仪上观察到，检测区和质控区都能看到 一条清晰的荧光条带。如图3所示，用荧光微球免疫层析试纸条定性检测食源性致病微生物的检测步骤如下: [1]在试纸条上加入样本，反应10min后，将检测试纸条放入检测窗口 41; [2]荧光微球43在灯源42激发下，发出强烈的荧光； —_当样本中不含有待检测食源性致病微生物时，检测区不出现荧光条带，而质控 区出现一条荧光条带，即检测样本为阴性；当样本中含有过量的待检测食源性致病 菌时，检测区和质控区均有荧光条带，检测样本即为阳性。
如图3所示，用荧光微球免疫层析试纸条定暈检测食源性致病微生物的检测步骤如下
(1) 在样本垫上滴加样品，反应10min后，检测试纸条放入检测窗口 41;
(2) 检测区或质控区被截留的荧光微球43在光源42激发下，发出强烈的荧光条带；
(3) 发射的荧光44经CCD扫描系统45汇聚后，经过光电聚集管46，送入光电倍增 管47，光信号得到增强，再经过信号转换元件48，经过软件处理49后，荧光 的强弱以数值的高低在数据输出410的显示器上显示出来； .-
(4) 检测过程中，以不同已知浓度的被检测食源性致病微生物作检测，获得一系列 数值后，绘制被检测食源性致病微生物浓度与荧光强弱数值关系的标准曲线。 最后根据检测样本的数据输出410的数值，查标准曲线图得出检测样本中食源性 致病微生物的浓度。
具体实施例方式
实施例一检测农贸菜市场牛肉馅样本中单核细胞增生李斯特菌的荧光微球免疫层析 试纸条的制备
一、层析试纸条的制备
1. 硝酸纤维素膜的制备； _
检测区和质控区的制备 ' 单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上用0.1 M pH 7.2的PBS (磷酸盐缓冲液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐温-20 (Tween-20))调节单核 细胞增生李斯特菌多克隆抗体的浓度为0.5 mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测区， 用0.01 MpH 7.2的PBS (其中包含5%蔗糖和0.05 %吐温-20 (Tween-20))调节抗鼠抗 体的浓度为0.5 mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控区，两区的喷膜量均为0.74 ^L/cm， 两区相隔5mm，质控区距硝酸纤维素膜一端2mm， 37"烘干处理过夜后，于室温干燥的 环境下保存备用。
2. 荧光微球垫的制备；荧光微球标记单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备取1 mg包裹有香豆素的荧
光微球1000Xg离心10min，离心后收集沉淀用0.01MpH4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓 度为OD450=0.2，然后分别加入80 的20 mg/mL EDC，禾Q 130 pL的20 mg/mL NHS，振 荡混匀后，室温孵育20 min后，1000 X g离心5 min，沉淀用0.01M pH 4.8的硼酸盐缓冲 液溶解，调节微球浓度OD45Q为1.0， 1 mL荧光微球中加入1 |ig的单核细'胞增生李斯特菌 单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应3h，超纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01MpH7.2 的PBS (其中包含5 %蔗糖和0.05 °/。 Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，用BIODOT操 作平台(BIODOT Dispensing System),按照8 ^L/cm的量喷涂至30X0.8 cm的玻璃纤维膜 上，25匸真空干燥1.5h，放于干燥环境备用。
3.组装试纸条在5.5 X 30 cm的PVC底板上依次搭接地粘贴(1)滤纸和样本垫，样 本垫为一种经过1 % Tween-20处理的1 X30 cm的玻璃纤维膜,样本垫处理方法用含5% 庶糖和1 % Tween-20的0.01M pH 7.4的磷酸缓冲液浸泡湿润后，放置37 "C烘箱干燥2 h， 放置于干燥环境保存备用；(2)分散有荧光微球标记单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体 的0.8X30 cm的荧光微球垫；(3)有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体作为检测区和有 抗鼠抗体作为质控区的2.5X30cm的硝酸纤维素膜；(4) 1.2X30 cm的吸水纸。组装好 后放入准备好的试纸条盒中，装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环境 下至少可保存一年。
二、定性和定量检测牛肉馅样本中单核细胞增生李斯特菌；
1. 定性检测无菌称取25g牛肉馅样本，加入225mLEB增菌液中，充分搅拌成均质， 3(TC培养48h， 10CTC加热5min，冷却至室温后吸取70 菌悬液直接加入样本孔，十分 钟后，将检测卡放入简易荧光检测仪中检测窗口内，荧光微球在LED灯源激发下，发射特 定颜色的荧光，经过单色滤光片过滤后，选择只能透过蓝绿色光的滤光片，从观察窗口观 察，在简易荧光检测仪上观察到，检测区和质控区均能看到一条清晰的蓝绿色荧光条带。 说明检测样本中污染有单核细胞增生李斯特菌。
2. 定量检测
(1) 在试纸条上加入样本，常温反应10min后，检测试纸条放入检测窗口；
(2) 截留在检测区和质控区的荧光微球在LED灯源激发下，发出强烈的荧光条带；
(3) 发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管，送入光电倍增管，光信号 得到增强，在经过信号转换元件，经过软件处理后，荧光的强弱以数值的高低在数据输出 410的显示器上显示出来。(4)实验过程中，以特定数量的单核细胞增生李斯特菌为标准样品，测出其对应的荧 光强度的数值，从而根据这一系列数值与对应浓度建立一条标准曲线。对已知样 本检测(该已知检测样本经培养法确定为104CFU/mL)，最后根据检测样本的数据 输出的数值为0.40，查标准曲线图得出富集培养基中单核细胞增生李斯特菌的数 量为104 CFU/mL。
实施例二:检测牛奶样本中大肠杆菌0157: H7的荧光微球免疫层析试纸条的制备；
一、 层析试纸条的制备； .
1. 硝酸纤维素膜的制备；
检测区和质控区的制备用0.05 M pH 7.2的PBS(其中包含5%蔗糖和0.05%Tween-20) 调节大肠杆菌0157: H7多克隆抗体的浓度为1.0 mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检 测区，用0.01 M pH 7.2的PBS (其中包含5%蔗糖和0.05%Tween-20)调节抗鼠抗体的浓 度为1.0mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控区，两区的喷膜量均为0.74 ^L/cm，两 区位置相隔5mm，质控区距硝酸纤维素膜一端2mm， 37。C烘干处理过夜后，于室温干燥 的环境下保存备用。 '
2. 荧光微球垫的制备；
荧光微球标记大肠杆菌0157: H7单克隆抗体的制备取1 mg包裹有菲咯啉联钌染料 的荧光微球在1000Xg离心15 min，离心后收集沉淀，用0.01MpH4.8的硼酸盐缓冲液调 节微球浓度为OD45o=0.2。然后分别加入90 的50 mg/mL EDC，和150 的5 mg/mL NHS，振荡混匀，室温孵育15min后，1000Xg离心15min，沉淀用0.01MpH4.8的硼酸 盐缓冲液溶解,调节微球浓度OD45Q为0.5。0,1 mL荧光微球中加入10吗的大肠杆菌0157: H7单克隆抗体，充分混合后，室温搅拌反应3h，超纯水离心洗涤3次后，沉淀用0.01M pH 7.2的PBS(其中包含5 %蔗糖和0.05 % Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，用BIODOT Dispensing System,按照4 ^L/cm的量喷涂至玻璃纤维膜(30X0.8 cm)上，25。C真空干燥2 h，放于干燥环境备用。
3. 组装试纸条在PVC塑料底板上依次搭接地粘贴(l)滤纸和样本垫，样本垫为一 种经过5 % Tween-20处理的玻璃纤维膜；(2)分散有荧光微球标记大肠杆菌0157: H7单 克隆抗体的荧光微球垫；(3)有大肠杆菌0157: H7多克隆抗体作为检测区和有抗鼠抗体 作为质控区的硝酸纤维素膜；(4)吸水纸。组装好后，放到准备好的试纸条盒中，装入铝 箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环境下至少可保存一年。
二、 定性和定量检测牛奶样本中大肠杆菌0157: H7;1. 定性检测无菌吸取25mL牛奶样本，加入225mLEB增菌液，37。C培养24h后， IO(TC加热10min，吸取70jiL悬液，加入样本垫上进行检测，十分钟后，将检测卡放入简 易荧光检测仪中检测窗口内，荧光微球在LED灯源激发下，发射特定颜色的荧光，经过单 色滤光片过滤后，选择只能透过红色光的滤光片，从观察窗口观察，在简易荧光检测仪上 观察到检测区和质控区均有一条清晰的红色荧光条带。说明检测样本污染了大肠杆菌 0157: H7。
2. 定量检测
(1) 在试纸条的样本垫上加入样本，反应10min后，检测试纸条放入检测窗口；
(2) 荧光微球在LED灯源激发下，发出强烈的荧光；
(3) 发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管，送入光电倍增管，光信号 得到增强，在经过信号转换元件，经过软件处理后，荧光的强弱以数值的高低在数据输出 410的显示器上显示出來。 '
(4) 实验过程中，以特定数量的大肠杆菌0157: H7为标准样品，测出其对应的荧光强 度的数值，从而根据这一系列数值与对应浓度建立一条标准曲线。样本增菌液充分混匀后， 吸取70^L悬液，进行检测。检测样本的数据输出的数值为0.85，査标准曲线图得出检测 样本中大肠杆菌0157: H7的数量为105 CFU/mL。
实施例三检测猪肉样本中金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的荧光微球免疫 层析试纸条的制备
一、层析试纸条的制备
1. 硝酸纤维素膜的制备；
检测区制备用0.01 M pH 7.2的PBS调节单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的浓度 为0.5mg/mL，调节金黄色葡萄球菌单克隆抗体的浓度为0.8 mg/mL，然后将所得溶液分别 喷涂在膜上形成两个检测线，喷膜量均为0.74 ^L/cm,两线相隔5 mm，并距离吸水纸2 mm， 37"烘干处理过夜后，于室温干燥的环境下保存备用。
—
2. 荧光微球垫的制备； 荧光微球标记的单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的制备(制法如实施例1)
荧光微球标记的金黄色葡萄球菌多克隆抗体的制备
取1 mg包裹有菲咯啉联钌染料的荧光微球在1000Xg离心10 min，离心后收集沉淀， 用0.01M pH 4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD45o=0.2。然后分别加入20 的20 mg/mLEDC，禾口 lOO)iL的10mg/mLNHS，振荡混匀，室温孵育30min后，1000Xg下离心10 min，沉淀用0.01M pH 4.8的硼酸盐缓冲液溶解,调节微球浓度0045()为0.8。 0,1 mL 荧光微球中加入5pg的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，充分混合，室温搅拌反应3h后，超 纯水离心洗涤3次，沉淀用0.01 M pH 7.2的PBS (其中包含5%蔗糖和0.05 % Tween-20) 复溶沉淀至起始体积，然后用BIODOT Dispensing System,按照4 ^L/cm的量喷涂至玻璃 纤维膜(30X0.8 cm)上，25 。C真空干燥2h，放于干燥环境备用。
3.组装试纸条在PVC底板上依次搭接地粘贴(l)滤纸和样本垫，样本垫为一种经 过5 % Tween-20处理的玻璃纤维膜；(2)喷涂有荧光微球标记的单核细胞增生李斯特菌多 克隆抗体和金黄色葡萄球菌多克隆抗体的荧光微球垫；(3)有金黄色葡萄球菌单克隆抗体 和单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体作为两个检测区的硝酸纤维素膜；(4)吸水纸。组装 好后放到准备好的试纸条盒中，装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环 境下至少可保存一年。
二、定性和定量检测猪肉样品中污染的金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌；
1. 定性检测无菌称取25g猪肉样本，放入灭菌均质器中加225 mLEB增菌液，30°C 培养24 h后升温至37'C培养24h， IO(TC加热10 min，然后取70 悬液加入至样本垫， 十分钟后，将检测卡放入简易荧光检测仪中检测窗口内，荧光微球在LED灯源激发下经过 两色单色滤光片过滤后，从观察窗口观察，在对应于金黄色葡萄球菌检测区出现一条红色 荧光条带，在对应于单核细胞增生李斯特菌检测区无任何条带，说明该猪肉样本中含有金 黄色葡萄球菌。
2. 定量检测
在上述定性检测的歩骤后进行以下的定量检测步骤
(l)发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管，送入光电倍增管，光信号得 到增强，在经过信号转换元件，经过软件处理后，荧光的强弱以数值的高低在数据输出的 显示器上显示出来。
(2)实验过程中，以金黄色葡萄球菌配制已知系列浓度的样品，测出其对应的荧光强度 的数值，从而根据这一系列数值与对应浓度建立一条标准曲线。加入70pL样本，进行检 测，最后根据检测样本的数据输出的数值0.40，查标准曲线图得出检测样本中金黄色葡萄 球菌的数量为104 CFU/mL。
实施例四检测沙拉酱中污染大肠杆菌0157: H7和单核细胞增生李斯特菌的荧光微 球免疫层析试纸条的制备
一、层析试纸条的制备1. 硝酸纤维素膜的制备；
检测区和质控区的制备用0.02MpH 7.2的PBS调节大肠杆菌0157: H7单克隆抗体 的浓度为1.0mg/mL，调节单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的浓度为0.5mg/mL，然后将 所得溶液分别喷涂在膜上形成两个检测区，两区的喷膜量均为0.74pL/cm，两区位置相隔 5mm，距硝酸纤维素膜一端2mm， 37"烘干处理过夜后，于室温干燥的环境下保存备用。
2. 荧光微球垫的制备；
制备荧光微球标记的单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体(制法如实施例1) 制备荧光微球标记的大肠杆菌0157: H7多克隆抗体(制法如实施例2)
3. 组装试纸条在PVC底板上依次搭接地粘贴(l)滤纸和样本垫，样本垫为一种经
过5 % Tween-20处理的玻璃纤维膜；(2)分散有荧光微球标记的单核细胞增生李斯特菌多 克隆抗体和大肠杆菌0157: H7多克隆抗体的荧光微球垫；(3)有大肠杆菌0157: H7单 克隆抗体和单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体作为两个检测区和有抗鼠抗体作为质控区 的硝酸纤维素膜；(4)吸水纸。组装好后放到准备好的试纸条盒中，装入铝箔袋，加入干 燥剂后，封.口保存，于室温干燥的环境下至少可保存一年。
二、定性和定量检测沙拉酱样品中污染的单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌0157:
H7
1. 定性检测无菌称取沙拉酱25 g，加入225 mLEB增菌液，均质后3(TC培养24 h 然后37。C培养24h， IO(TC加热10min后，吸取70(aL悬液，加入样本垫上十分钟后，将 检测卡放入简易荧光检测仪中检测窗口内，荧光微球在LED灯源激发下，发射蓝绿色和红 色的荧光光谱，经过单色滤光片过滤后，从观察窗口观察，检测区出现两个条带，说明该 样本中同时污染大肠杆菌0157:. H7和单核细胞增生李斯特菌。
2. 定量检测
(1) 预先把增菌液加入试纸条的样本垫，反应10 min后，将检测试纸条放入检测窗口 ；
(2) 荧光微球在LED灯源激发下，发出强烈的荧光；
(3) 发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管46，送入光电倍增管， 光信号得到增强，在经过信号转换元件，经过软件处理后，荧光的强弱以数值的高低在数 据输出的显示器上显示出来。
(4) 实验过程中，分别以大肠杆菌0157: H7和单核细胞增生李斯特菌配制已知系列 浓度的样品，分别测出其对应的荧光强度的数值，从而根据这一系列数值与对应浓度分别 建立一条标准曲线。吸取70^L悬液，进行检测，最后根据检测样本的数据输出的数值分
15别为0.85禾n 0.40，查标准曲线图得出检测样本中大肠杆菌0157: H7和单核细胞增生李斯 特菌的数量分别为105 CFU/mL和104 CFU /mL。
实施例三和实施例四采用的联检方法，检测一种样本中的不同食源性致病微生物，可 以类推到三检和多检，适用于对大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、 金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、肉毒杆菌、副溶血弧菌、变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、 霍乱弧菌、粪链球菌、致病性大肠杆菌以及隐孢子虫等微生物的检测。
实施列五用荧光微球免疫层析试纸条定性检测牛奶样本中大肠杆菌0157: H7;
检测牛奶样本中大肠杆菌0157: H7的荧光微球免疫层析试纸条制备方法见实施例二。 定性检测牛奶样本中大肠杆菌0157: H7的荧光微球免疫层析试纸条的检测歩骤如下 定性检测无菌吸取25 mL牛奶样本，加入225 mL EB增菌液，37'C培养24 h后， IO(TC加热10min，吸取70pL悬液，加入样本垫上进行检测，十分钟后，将检测卡放入简 易荧光检测仪中检测窗口内，荧光微球在LED灯源激发下，发射特定颜色的荧光，经过单 色滤光片过滤后，选择只能透过红色光的滤光片，从观察窗口观察，在简易荧光检测仪上 观察到质控区有一条清晰的红色荧光条带，检测区无荧光条带，和说明检测样本不包含大 肠杆菌0157: H7。
权利要求
1. 一种检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于在底板上依次搭接地粘贴滤纸，样本垫，玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的玻璃纤维膜上喷涂有荧光微球标记的食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体，所述的硝酸纤维素膜上包被有食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体作为检测区和包被有抗鼠抗体作为质控区。
2. 根据权利要求1所述的检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所述荧光微球是直径为0.01 10 pm的用聚合材料或二氧化硅包裹荧光物质的微球，其表面连接有活性基团，或与链霉亲和素偶联；所述荧光物质包括有机或无机 的荧光物质或多种荧光物质的掺杂物以及量子点。
3. 根据权利要求2所述检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条，其特 征在于所述聚合材料为聚苯乙烯、聚乙烯和聚氯乙烯，所述的活性基团为一CHO、 -COOH、 -OH、 -NH2或-SH，所述荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、 异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯、荧光烷衍生物类、1,8-萘二酰亚胺类、香豆素 类有机荧光染料或其掺杂物或量子点。
4. 根据权利要求1所述的检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的制 备方法，包括如下的步骤(1)硝酸纤维素膜的制备；(2)荧光微球垫的制备；(3)组装试纸条； 所述的硝酸纤维素膜的制备，包括检测区和质控区的制备； 所述的荧光微球垫的制备，包括如下的歩骤① 荧光微球的制备；② 荧光微球标记食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体，并将其喷涂在玻璃纤 维膜上制备荧光微球垫。
5. 根据权利要求4所述的检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述食源性致病微生物多克隆抗体和食源性致病微生物单克隆抗体选自大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺 氏菌、肉毒杆菌、副溶血弧菌、变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、粪链球菌、 致病性大肠杆菌以及隐孢子虫病原微生物的多克隆抗体或单克隆抗体。
6. 根据权利要求4所述的检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述检测区和质控区的制备方法如下用BIODOT Dispensing System将食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体和抗鼠 抗体包被到硝酸纤维素膜上分别用0.01 0.1 M pH 7.2的磷酸盐缓冲液调节包被物浓 度为0.5 8.0 mg/mL，喷膜量为0.74 )iL/cm，检测区喷涂食源性致病微生物多克隆抗体 或单克隆抗体，质控区喷涂抗鼠抗体，两区相隔5mm;在要求多检和联检的情况下， 用多种食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体在检测区包被多条检测线，无质控 区，各检测线间也相隔5mm， 37'C烘干处理过夜后，室温干燥的环境下保存备用。
7. 根据权利要求4所述的检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的制 备方法，其特征在于用荧光微球通过共价偶联标记食源性致病微生物单克隆抗体或多 克隆抗体取微球在1000Xg离心10 15 min，离心后收集沉淀，用0.01 M pH 4.8的 硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD45。=0.2，然后分别加入20 100 mg/mL EDC，和2 20mg/mLNHS，振荡混匀，室温孵育10 30 min后，1000Xg离心5 15 min，沉淀 用0.01 M pH 4.8的硼酸盐缓冲液溶解，并调节微球浓度为OD45Q为0.2-1.0， 1 mL该荧 光微球中加入0.1 100 pg的食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体，充分混合后， 室温搅拌反应1 4 h;超纯水离心洗涤2 5次，沉淀用0.01 M pH 7.2的磷酸盐缓冲液 复溶沉淀至起始体积；用BIODOT Dispensing System将标记好的荧光微球喷涂至玻璃 纤维膜上，25t:真空千燥1 2h，置于室温干燥的环境下备用。
8. 根据权利要求4所述的检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条的制 备方法，其特征在于荧光微球免疫层析试纸条的组装，即在粘性底板上依次搭接地粘 贴下述材料(1)滤纸；(2)样本垫；(3)荧光微球垫；(4)包被食源性致病微生物多克隆抗 体或单克隆抗体作为检测区和包被抗鼠抗体作为质控区的硝酸纤维素膜；(5)吸水纸， 即组装成本发明的荧光微球免疫层析试纸条。
9. 用权利要求l、 2或3所述的荧光微球免疫层析试纸条定性检测食源性致病微生物的方法，包括如下的步骤(1) 在试纸条上加入样本，反应10min后，将检测试纸条放入检测窗口；(2) 荧光微球在灯源激发下，发出强烈的荧光；(3) 当样本中不含有被检测食源性致病微生物时，检测区不出现荧光条带，而质控 区出现一条荧光条带，即检测样本为阴性；当样本中含有过量的被检测食源性致病菌时，检测区和质控区均有荧光条带，检测样本即为阳性。
10. 用权利要求1、 2或3所述的荧光微球免疫层析试纸条定量检测食源性致病微生物的方法，包括如下的步骤 ，(1) 在试纸条上加入样本，反应10min后，将检测试纸条放入检测窗口；(2) 截留在检测区和质控区的荧光微球在LED灯源激发下，发出强烈的荧光条带；(3) 发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管，送入光电倍增管，光信 号得到增强，再经过信号转换元件，软件处理后，荧光的强弱以数值的高低在 显示器上显示；以不同已知浓度的待检测食源性致病微生物作检测，获得一系 列数值后，绘制待检测食源性致病微生物浓度与荧光强弱数值关系的标准曲线。(4) 根据检测样本的显示数值，以及上述标准曲线得出检测样本中食源性致病微生 物的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种快速、特异、定性、定量检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法，在底板上依次搭接地粘贴滤纸，样本垫，喷涂有荧光微球标记食源性致病微生物单克隆抗体或多克隆抗体的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有食源性致病微生物多克隆抗体或单克隆抗体作为检测区和包被有抗鼠抗体作为质控区；试纸条的制备步骤(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)荧光微球垫的制备；(4)组装试纸条；检测过程中，利用CCD扫描技术，把所有的发射光谱收集，聚集和倍增后，再通过荧光分析仪以及相关软件分析，从而实现定量检测。本发明主要用于食品安全检测中所有食源性致病微生物的定性和定量检测。
文档编号G01N33/577GK101464464SQ200810007599
公开日2009年6月24日 申请日期2008年2月29日 优先权日2008年2月29日
发明者熊勇华, 赖卫华, 晶 金, 华 魏 申请人:无锡中德伯尔生物技术有限公司