专利名称：微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统的制作方法
技术领域：
本发明为微气泡加快的免疫反应结合由抗体修饰的树脂微珠制成的新型免疫传 感器而发展的化学发光免疫检测系统，尤其是微气泡加快免疫反应的快速免疫分析方 法；本传感器还涉及用于单组分化学发光免疫分析的检测系统。二、 背景技术免疫分析作为一种高选择性和高灵敏度的分析方法，在临床诊断、环境监测、食 品安全等领域得到了F!益广泛的应用。免疫分析分为均相和异相免疫分析，后者因为 能获得更高的灵敏度而被广泛应用。化学发光分析也是近年来快速发展的分析技术， 其仪器便宜，操作简便，环境友好，是目前最灵敏的分析技术之一，特别适合于痕量 物质的检测。流动注射技术有重现性好，自动化程度高，分析速度快等优点，是实现 高通量分析最有效的手段之一。将后两种技术与免疫分析联用而发展起来的流动注射 化学发光免疫分析技术，是免疫分析领域近年来的研究热点，并已经取得了令人瞩目 的成果。异相免疫分析需要用一种载体去固定抗体或者抗原，然后进行免疫反应。理 想的免疫反应载体应当符合以下要求(l)载体表面必须有适当的功能基团，可与抗 原抗体发生共价键合反应；(2)表面键合方式不应当对抗原抗体的空间构型产生较大 影响，以保持其免疫活性；(3)载体应有较大比表面积，以提高其对抗原抗体的固定 量-,(3)载体表面应具有较强亲水性，以减小非特异性吸附；(4)载体必须为刚性材 料，在载流连续冲击的情况下仍能保持其物理形状。异相免疫分析常用的载体包括尼 龙、壳聚糖、硅材料、玻璃微珠、磁珠和琼脂糖等；但是这些材料存在要么价格高、 或者非特异性吸附大、或者亲水性差、或者机械性能不好、或者因为比表面积小而固定容量不够等缺点，所以寻找一种理想的固定载体对异相免疫分析至关重要。在异相免疫分析中，温育时间(即免疫反应速率)是制约免疫分析速度的瓶颈， 而免疫反应速率受传质速率和免疫反应动力学控制。加热可以加快免疫反应动力学， 但是这样会增加分析成本和操作复杂性，并且加热温度过高会引起蛋白质的变性。因 此，通过加快传质速率来缩短温育时间引起人们的很大兴趣。不同的方法己被用来加 快传质速率，例如电场和磁场驱动、捕获基质旋转和低能微波等，但是这些方法需要 复杂或者特殊的装置。
发明内容
本发明的目的是利用微气泡加快免疫反应，结合流动注射分析技术，以抗体修 饰的树脂微珠制成新型免疫传感器，提供一种快速、灵敏、自动化的化学发光免疫分 析检测系统。
本发明通过以下技术方案来实现.-
一种微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统包括溶液传输系统、微气泡温 育装置、免疫传感器、化学发光检测器和计算机。传输系统由蠕动泵(P1， P2)、微量 注射泵(P3)、四根连接管和八通注射阀(V)组成；四根连接管通过多通道蠕动泵和微量 注射泵分别连接到八通注射阀和传感器上；免疫传感器置于化学发光检测器上面；输 液传输系统和化学发光检测器均于计算机相连。样品和酶标抗体形成的预温育复合物 通过微量注射泵(P3)注入免疫传感器；载流、冲洗液和再生液通过蠕动泵(P1)传输， 发光底物由蠕动泵(P2)混合后经过八通注射阔形成底物区带，由载流将区带载入免疫 传感器，产生化学发光信号。
上述的多通道蠕动泵(P1， P2)的转速、微量注射泵(P3)的注射速度和液体流速是可
调的，连接管与通氮气的管道是分别是内径0.8 mm和0.5 mm的聚四氟乙烯管。八通 注射阀可通过仪器所带程序由计算机控制实现不同流路的切换。免疫传感器由充满抗 体修饰的羧基活化树脂微珠的无色透明玻璃管(内径1.6mm，长为4cm)制成。
上述的载流为0.01 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0;冲洗液为0.01 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0,含0.05%吐温-20;再生液为0.1M氨基酸/盐酸缓冲液，pH7.0;化学发光底物为 0.5 mmo1/1鲁米诺，0.6 mmo1/1对碘苯酚和4 mmo1/1双氧水。
一种微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统，其具体分析步骤如下
(1) 将含抗原的待测样品和辣根过氧化物酶标记的示踪抗体加入温育管内，通入氮 气产生微气泡，加快免疫反应，形成抗原酶标抗体复合物；
(2) 用微量注射泵(P3)将抗原-抗体复合物以0.025 mL/min通过免疫传感器，在传感 器内形成酶标免疫夹心复合物；
(3) 通过蠕动泵(P1)将冲洗液以2.0 mL/min流速通过免疫传感器，洗去未结合免疫 试剂；同时，鲁米诺-对碘苯酚混合液和双氧水由蠕动泵(P2)分别以1.0mL/min流速混合产生100 |iL区带，利用蠕动泵(P1)驱动载流以2.0mL/min注入免疫传感器， 产生强烈的化学发光，记录发光信号。由该信号可得到组分的浓度。
(4)测定完成后，依次将再生液和载流通过蠕动泵(P1)输入免疫传感器，使免疫 夹心复合物解离，再生免疫传感器，以进入下一轮测定循环。
微气泡加快免疫反应的流动注射化学发光免疫检测系统的构成
本检测系统的结构如图1所示，共包括五个部分第一个部分是溶液传输系统，
该传输系统以两个蠕动泵和一个微量注射泵产生传质动力，以若干聚四氟乙烯管为传
质连接管，以一个八通注射阀控制液流方向，把不同溶液注入免疫传感器；第二部分 是微气泡加快的温育装置；第三部分是免疫传感器；第四部分是化学发光检测器；第 五部分是计算机控制系统。
本检测系统的工作原理-
本检测系统基于微气泡加快的免疫反应，结合由抗体修饰的树脂微珠制成的新型 免疫传感器，采用传统的双抗体夹心模式，可以快速、灵敏地进行流动注射化学免疫 分析。如图2所示，以一种待测抗原为例，在免疫传感器中固定待测物的抗体，将含 有待测物的样品与辣根过氧化物酶标记的示踪抗体加入小管内预温育，通过微气泡加 快免疫反应，形成抗原酶标抗体复合物；然后将该抗原酶标抗体复合物缓慢流过免疫 传感器，形成双抗体夹心复合物；随后通入冲洗液洗去未结合的免疫试剂，通入酶的 发光底物(鲁米诺、对碘苯酚和双氧水混合溶液)，产生强烈的化学发光，记录发光信 号，得到待测物的含量。
测定完成后，依次通入再生液和载流两个循环，可使形成的免疫夹心复合物解 离，免疫传感器获得再生，进入下一个测定循环。
.分析过程中，所有溶液由蠕动泵和微量注射泵上连接管输入分析系统，通过转动八通注射 阀实现不同流路的切换，全过程由计算机进行程序化自动控制。
本检测系统的测定原理
当待测样品中存在拟测定的抗原物质时，待测抗原物质先与酶标抗体在微气泡的 作用下进行快速的免疫反应，生成的复合物注入免疫传感器形成双抗体夹心复合物。 通入辣根过氧化物酶的化学发光底物(鲁米诺、对碘苯酚和双氧水混合溶液)，得到待测组分的化学发光信号，通过换算得到待测抗原的浓度。 本发明与现有技术相比，具有以下特点
本发明结合流动分析技术与化学发光检测，利用微气泡加快免疫反应，通过由抗 体修饰的树脂微珠制成的新型免疫传感器，进行快速免疫检测。相对于检测系统，具 有以下特点
(1) 操作简单，全分析过程均在流动体系中完成，以计算机进行程序化自动控制， 手工操作极少，无需熟练操作人员。
(2) 微气泡加快免疫反应，分析时间短，全过程包括加样、温育、冲洗、检测与再 生仅需16分钟，是目前最快速的免疫分析方法之一。
(3) 仪器设备简单，成本低廉，整个分析系统由低值的蠕动泵、八通注射阀、聚四 氟乙烯管和化学发光检测器组成。
(4) 免疫传感器可以通入再生缓冲液进行反复再生使用，与常规的免疫分析方法相 比，大大节约了昂贵的包被抗体，进一步降低了分析成本。
(5) 由于其检测模式为极灵敏的酶催化的化学发光反应，本方法可测出底浓度的样 品，满足绝大多数的分析需求。
(6) 由于采用了自动化的流动分析技术，使分析的重现性比传统的手工操作方法大
为提高，有利于制定相关标准。
四
图1.微气泡加快免疫反应的流动注射化学发光免疫检测系统的结构示意图
Pl、 P2为蠕动泵；P3为微量注射泵；V为八通注射阀
图2.微气泡加快免疫反应的流动注射化学发光免疫检测系统原理示意图
五具体实施例方式
实施例l:基于抗体修饰树脂微珠的传感器制备。
该传感器具体制备过程如下取50毫克树脂微珠在20%的乙醇溶液中溶胀，用
pH5.5的活化缓冲液2-(N-吗啡啉)乙磺酸冲洗三次，重新分散到该活化缓冲液中，然 后加入30毫克碳二亚胺(EDC)和30毫克N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌活化2小时，用偶联缓冲液(pH7.0磷酸盐缓冲)冲洗三次，加入200微升的单克隆抗体，室温缓慢搅拌2小时，4。C下冰箱放置24小时，然后用1%的牛血清蛋白封闭24小时，用偶联缓冲液彻底清洗。最后将抗体修饰的树脂微珠填充入4厘米长的无色透明玻璃管(内径1.6mm)中，制得该免疫传感器。
实施例2:结合附图1对微气泡加快免疫反应的流动注射化学发光免疫检测系统进一步说明
微气泡加快免疫反应的流动注射化学发光免疫检测系统包括溶液传输系统、微气
泡加快的温育装置、免疫传感器、化学发光检测器和计算机。四根内径为0.8mm的聚四氟乙烯连接管将多通道蠕动泵(P1， P2)、微量注射泵(P3)、八通注射阀和传感器连接起來，样品和酶标抗体在微气泡作用下，快速免疫反应，形成的预温育复合物通过微量注射泵(P3)传输通过免疫传感器流出，载流、冲洗液和再生液通过蠕动泵(P1)传输，发光底物由蠕动泵(P2)混合后经过八通注射阀注射通过免疫传感器，免疫传感器置于化学发光检测器上面；输液传输系统和化学发光检测器均于计算机相连。
实施例3:化学发光免疫分析方法
所有分析步骤由计算机进行程序化自动控制。再生液为0.1 M氨基酸/盐酸缓冲液，pH2.0;冲洗缓冲液为含0.05。/o吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.0;化学发光底物为0.5 mmo1/1鲁米诺、4 mmo1/1双氧水与0.6 mmo1/1对碘苯酚的混合溶液。具
体分析过程如下
(1) 将含有抗原的待测样品和辣根过氧化物酶标记的示踪抗体加入温育管内，通入
氮气产生微气泡，在微气泡作用下，室温温育10min。
(2) 用微量注射泵(P3)将抗原抗体复合物以0.025 mL/min通过免疫传感器。
(3) 通过蠕动泵(Pl)将冲洗液以2.0mL/min流速通过免疫传感器，洗去未结合免疫试剂，同时，鲁米诺-对碘苯酚和双氧水通过蠕动泵(P2)分别以LOmL/min流速混合产生100 ^tL区带，利用蠕动泵(P1)驱动载流以2.0 mL/min注入免疫传感器，产生强烈的化学发光，记录发光信号。由该信号可得到组分的浓度。
(4) 测定完成后，以2.0mL/min流速通入再生液再生免疫传感器。
(5) 以2.0mL/min流速通入载流调节免疫传感器，进入下一轮测定循环。实施例4:以一种重要的肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)为例，说明该微系统的应
用
用鼠单克隆抗甲胎蛋白抗体修饰羧基活化树脂微珠，以牛血淸蛋白封闭残余活性
位点，将树脂微珠填充到长4cm内径1.6mm的无色透明玻璃管中，制成免疫传感器。AFP的示踪抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠单克隆AFP抗体。
具体流程如下，向温育管中加入30微升样品、30微升示踪抗体，通入氮气产生微气泡，在微气泡作用下，室温温育10min。将温育液缓慢通过免疫传感器，然后冲洗免疫传感器1分钟。注入辣根过氧化物酶底物，产生化学发光，收集信号。检测完成后，分别通入再生液和载流，再生和平衡传感器。检测一系列标准溶液的信号，得到AFP的标准曲线。再利用标准曲线和检测样品测得的化学发光信号，得到临床血样中该肿瘤标记物的浓度。
权利要求
1. 本发明涉及一种微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统。该系统包括溶液传输系统、微气泡温育装置、免疫传感器、化学发光检测器和计算机。传输系统由蠕动泵(P1，P2)、微量注射泵(P3)、四根连接管和八通注射阀(V)组成；四根连接管通过多通道蠕动泵和微量注射泵分别连接到八通注射阀和传感器上；免疫传感器置于化学发光检测器上面；输液传输系统和化学发光检测器均于计算机相连。样品和酶标抗体形成的预温育复合物通过微量注射泵(P3)注入免疫传感器；载流、冲洗液和再生液通过蠕动泵(P1)传输，发光底物由蠕动泵(P2)混合后经过八通注射阀形成底物区带，由载流将区带载入免疫传感器，产生化学发光信号。
2. 根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的免疫传感器由充满抗体 修饰的羧基活化树脂微珠的无色透明玻璃管制成。
3. 根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的八通注射阀可以通过仪 器所带程序由计算机控制实现不同流路的切换，所有液体流速是可调的。
4. 根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的载流为0.01M磷酸盐缓 冲液，pH7.0;冲洗液为0.01 M磷酸盐缓冲液，pH7.0,含0.05%吐温-20;再生液为 0.1 M氨基酸/盐酸缓冲液，pH 7.0;化学发光底物为0.5 mmol/l鲁米诺，0.6 mmo1/1 对碘苯酚和4 mmo1/1双氧水。
5. 根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的微气泡温育装置将氮气 通入温育管产生微气泡，加快兔疫反应。
6. —种微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统，其具体分析步骤如下(1) 将含抗原的待测样品和辣根过氧化物酶标记的示踪抗体加入温育管内，通入氮 气产生微气泡，加快免疫反应，形成抗原酶标抗体复合物；(2) 用微量注射泵(P3)将抗原-抗体复合物以0.025 mL/min通过免疫传感器，在传感 器内形成酶标免疫夹心复合物；(3) 通过蠕动泵(P1)将冲洗液以2.0 mL/min流速通过免疫传感器，洗去未结合免疫 试剂；同时，鲁米诺-对碘苯酚混合液和双氧水由蠕动泵(P2)分别以1.0 mL/min 流速混合产生100 nL区带，利用蠕动泵(P1)驱动载流以2.0 mL/min注入免疫传 感器，产生强烈的化学发光，记录发光信号。由该信号得到组分的浓度。(4) 测定完成后，依次将再生液和载流通过蠕动泵(P1)输入免疫传感器，使免疫夹 心复合物解离，再生免疫传感器，以进入下一轮测定循环。
全文摘要
一种微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统。该系统包括溶液传输系统、微气泡温育装置、免疫传感器、化学发光检测器和计算机。传输系统由蠕动泵(P1，P2)、微量注射泵(P3)、连接管和八通注射阀(V)组成；免疫传感器由充满抗体修饰的羧基活化树脂微珠的无色透明玻璃管制成，并置于化学发光检测器光窗上方。将待测样品和酶标抗体加入温育管后，通入氮气产生微气泡，加快免疫反应，减少预温育时间，并用微量注射泵将温育复合物注入免疫传感器，形成夹心免疫复合物。用蠕动泵(P1)通入冲洗液，洗净未结合的过量抗体后，由蠕动泵(P2)注入一体积的辣根过氧化物酶的化学发光底物，尔后蠕动泵(P1)通入载流将底物区带载入免疫传感器，产生化学发光信号，由信号强度检测样品浓度。检测完成后由蠕动泵(P1)通入再生液，可再生免疫传感器进行下一个分析流程。该检测系统成本低、快速、灵敏度高、重现性和精密度好，适合于环境监测、临床诊断、和食品安全等领域。
文档编号G01N21/76GK101545901SQ20081002442
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月24日 优先权日2008年3月24日
发明者枫 严, 杨占军, 鞠熀先 申请人:江苏省肿瘤医院;南京大学