专利名称：乙型肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
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本发明涉及一种用于定量检测乙型肝炎病毒表面抗体的试剂盒。
背景技术：
众所周知，乙肝病毒是严重威胁我国人民身体健康的病原体微生物之一，人
群普遍易感。我国是乙型肝炎的高发区，人群总感染率高达60%,全国乙型肝炎 表面抗原携带者至少有1.2亿，其中约10%最终转化为各种慢性肝病，包括慢性 肝炎、肝硬化和肝癌。成年人感染HBV后，90%~95%为自限性，5%~10%可成 为持续性感染或慢性化，输血后乙型肝炎中的50。/。将慢性化。围产期及新生儿被 HBV感染后，如果没有进行疫苗阻断，85。/。 90。/。可以成为无症状的HBsAg携带 者。
普遍认为乙型肝炎表面抗体是乙肝病毒的唯一保护性抗体，它的存在是 HBV感染被清除，身体产生对乙肝病毒免疫力的标志。另外，随着乙肝疫苗的 普遍使用，对于疫苗的使用效果也要由身体是否产生表面抗体来判断。因此对于 乙型肝炎表面抗体的检测，能够提示乙肝病情的恢复和治疗情况，判断注射疫苗 后身体对病毒的免疫情况。
但长期以来，国产的HBV感染标志物检测试剂一直采用方法学上比较落后 的酶联免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)分析试剂，更先进的发光免疫检测试 剂则主要依赖进口；尽管进口的发光免疫检测方法在灵敏性、特异性、有效期和 测量范围方面均有优势，但其昂贵的价格却不易被国内大多数用户所承受。因而 市场上急需优质而价廉的国产诊断试剂。
发明内容
本发明中縮写的含义
HBsAg:乙型肝炎表面抗原；抗-HBs:乙型肝炎表面抗体；DTTA-Eu: —种铕 离子螯合物N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠；P-NTA: 0-萘酰 三氟丙酮；S印hacryl S-200 : —种凝胶层析柱填料聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200; Triton X-100:壬-(乙二醇)苯辛基醚；T0P0:三辛基氧化膦；Ag:
3抗原；Ab:抗体，Ab-Eu:铕标记抗体。
本法发明的目的是提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好、无污染的乙型 肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒。主要解决进口发光免疫检测方法成本过 高的技术问题。
为实现上述目的，本发明通过以下方案实施
乙型肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒，试剂盒由乙型肝炎表面抗体校
准品、纯化HBsAg包被反应板、铕标记纯化HBsAg、铕标记稀释液、荧光增强液、 浓縮洗液组成。
所述纯化HBsAg包被板的制备将纯化HBsAg以磷酸盐缓冲液稀释适当比例 (0. 75-6pg/ml)后加入微孔板内，100pl每孔，过夜后洗涤、封闭、干燥， 而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。
所述纯化HBsAg铕标记物的制备将纯化HBsAg对碳酸盐缓冲液透析后与 DTTA-Eu以1 : 5的比例混合，静置18小时后经S印hacryl S-200分离柱分 离DTTA-Eu与Ag-Eu，获得铕标记过的纯化HBsAg。
所述乙型肝炎表面抗体校准品的制备以中国药品生物制品检定所国家标准品 2mlU/ml、 5mlU/ml、 10mlU/ml标定抗-HBs羊血清，然后稀释成含量分别为 5mlU/ml、 10mlU/tnl、 40mIU/ml、 160mIU/ml、 640mIU/ml的校准品，以lml/ 瓶装量分装即可。
所述荧光增强液的配制，以无水乙醇溶解f3-NTA、 TOPO，再加邻苯二甲酸氢钾和 三蒸水，4(TC溶解后，加入乙酸、Triton X-100，调TO值至3. 2，并定容。 所述使用方法包括以下乙型肝炎病毒表面抗体测定步骤
1. 试剂的准备
(1) 洗涤液将40mL浓缩洗液和960mL去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工 作洗涤液备用。
(2) 铕标记物准确吸取0.3ml去离子水充分溶解标记物冻干品，并充分混匀， 使用前一小时内用铕标记稀释液按l:50倍稀释并一次用完(使用一次性的塑料 容器来配制)。
2. 将试剂及所需数量的微孔反应条置室温(室温专指20-25。C范围，下同)平3. 吸取lOOul抗-HBs校准品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴 封片。
4. 微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育40分钟。
5. 在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应 条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液400ul，再吸干各孔，重复以上洗涤4 次，最后一次将微孔反应条拍干。
6. 每孔中加入100ul铕标记物工作液，并加贴封片。
7. 微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育40分钟。
8. 第二次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条 放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液400ul，再吸干各孔，重复以上洗涤6次， 最后一次将微孔反应条拍干。
9. 每一孔中加入增强液100ul (加样过程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂， 尽量避免污染)，并加贴封片。
10. 微孔反应条在室温下，用振荡仪轻摇5分钟(在半小时内完成测定)。
11. 使用乙肝表面抗体定量测定试剂盒时必须使用6个校准品，或者使用两点定 标方法。每次更换批号时必须使用试剂盒所提供的6个校准品作出曲线(双对 数)，校准品复孔使用以保证准确性。血样中抗一HBs浓度通过标定曲线得出。
与已有乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒相比，本发明试剂盒具有以下优点
A. 以DTTA-Eu为标记物，采用时间分辨荧光检测的方式，使检测灵敏度更高；
B. 定量测定血清中乙肝表面抗体的含量，更加准确；
C. 以mlU/ml为单位，检测结果与国际标准接轨，便于推广。
附图为抗一HBs浓度标定曲线
具体实施例方式
一种定量检测乙型肝炎病毒表面抗体的试剂盒，试剂盒由乙型肝炎表面抗体校准 品、纯化HBsAg包被反应板、铕标记纯化冊sAg、铕标记稀释液、荧光增强液、
浓缩洗液组成。
所述纯化HBsAg包被板的制备将纯化HBsAg以磷酸盐缓冲液稀释适当比例(0. 75-6pg/ml)后加入微孔板内，100nl每孔，过夜后洗涤、封闭、干燥， 而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。
所述纯化HBsAg铕标记物的制备将纯化HBsAg对碳酸盐缓冲液透析后与 DTTA-Eu以1 : 5的比例混合，静置18小时后经S印hacryl S-200分离柱分 离DTTA-Eu与Ag-Eu，获得铕标记过的纯化HBsAg。
所述乙型肝炎表面抗体校准品的制备以中国药品生物制品检定所国家标准品 2mlU/ml、 5ralU/ml、 10mIU/ml标定抗-朋s羊血清，然后稀释成含量分别为 5mlU/ral、 10mIU/ml、 40mIU/ml、 160mIU/ml、 640mIU/ml的校准品，以lml/ 瓶装量分装即可。
所述荧光增强液的配制，以无水乙醇溶解e-NTA、 TOPO，再加邻苯二甲酸氢钾和 三蒸水，4(TC溶解后，加入乙酸、Triton X_100、，调PH值值至3.2，并定容。 所述使用方法包括以下乙型肝炎病毒表面抗体测定步骤
1. 试剂的准备
(1) 洗涤液将40mL浓缩洗液和960raL去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工 作洗涤液备用。
(2) 铕标记物准确吸取0.3ml去离子水充分溶解标记物冻干品，并充分混匀， 使用前一小时内用铕标记稀释液按l:50倍稀释并一次用完(使用一次性的塑料 容器来配制)。
2. 将试剂及所需数量的微孔反应条置室温(室温专指20-25'C范围，下同)平 衡。
3. 吸取100ul抗-HBs校准品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴 封片。
4. 微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育40分钟。
5. 在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应 条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液400ul，再吸干各孔，重复以上洗涤4 次，最后一次将微孔反应条拍干。
6. 每孔中加入100ul铕标记物工作液，并加贴封片。
7. 微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育40分钟。
8. 第二次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条
6放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液400ul，再吸干各孔，重复以上洗涤6次， 最后一次将微孔反应条拍干。
9. 每一孔中加入增强液lOOul (加样过程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂， 尽量避免污染)，并加贴封片。
10. 微孔反应条在室温下，用振荡仪轻摇5分钟(在半小时内完成测定)。
11. 使用乙肝表面抗体定量测定试剂盒时必须使用6个校准品，或者使用两点定 标方法。每次更换批号时必须使用试剂盒所提供的6个校准品作出曲线(双对 数)，校准品复孔使用以保证准确性。血样中抗一HBs浓度通过标定曲线得出， 参照附图。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒，其特征是试剂盒由乙型肝炎表面抗体校准品、纯化乙型肝炎表面抗原包被反应板、铕标记纯化乙型肝炎表面抗原、铕标记稀释液、荧光增强液、浓缩洗液组成。
2. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗体定量测定诊断试剂盒，其特征 是所述纯化乙型肝炎表面抗原包被板的获得将纯化乙型肝炎表面抗原以磷酸盐缓冲液稀释至浓度为0. 75-6pg/ml后加入微孔板内，100pl每孔， 过夜后洗涤、封闭、干燥，而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。
3. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗体定量测定诊断试剂盒，其特征是所述纯化乙型肝炎表面抗原铕标记物的获得将纯化乙型肝炎表面抗原对碳酸盐缓冲液透析后与Nl-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠以 1 : 5的比例混合，静置18小时后经聚丙烯酰胺葡聚糖S-200分离柱分 离Nl-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠与铕标记抗体，获得铕 标记过的纯化乙型肝炎表面抗原。
4. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗体定量测定诊断试剂盒，其特征 是所述乙型肝炎表面抗体校准品的获得以中国药品生物制品检定所国家标 准品2mlU/ml、 5mlU/ml、 10mIU/ml标定乙型肝炎表面抗体羊血清，然后稀释 成含量分别为5mlU/ml、 10mlU/ml、 40mIU/ml、 160raIU/ml、 640mIU/ml 的校准品，以lml/瓶装量分装即可。
5. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗体定量测定诊断试剂盒，其特征是所述荧光增强液的获得以无水乙醇溶解e -萘酰三氟丙酮、三辛基氧化膦，再加邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，4CTC溶解后，加入乙酸、壬_ (乙二醇)苯辛 基醚，调PH值至3.2，并定容。
全文摘要
本发明目的在于提供一种定量检测乙型肝炎病毒表面抗体的试剂盒，主要解决进口发光免疫检测方法成本过高的技术问题。试剂盒由乙型肝炎表面抗体校准品、纯化HBsAg包被反应板、铕标记纯化HBsAg、铕标记稀释液、荧光增强液、浓缩洗液组成，应用铕标记与时间分辨免疫荧光定量检测技术，结合时间分辨荧光检测仪，定量检测血清中的乙型肝炎病毒表面抗体。应用时间分辨免疫荧光技术，结果准确可靠，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、无污染等优点。
文档编号G01N33/576GK101614738SQ200810043550
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者吴冯波, 唐晓燕, 陈煌辉 申请人:上海新波生物技术有限公司