专利名称：用于在生物微阵列表面同时对不同放射性核素定量的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种方法和装置，用于在沉积、吸附或固定有一种或多种放射性核素的表面的任意区域内同时对这些核素定量。这些放射性核素可作为以不同原理与该表面化学物质结合的组织切片或较大的生物分子中通常掺入的化合物的标记。该方法特别适合于利用标记有不同β发射核素的核苷酸进行DNA微阵列推演。
背景技术：
众所周知，在活生物体中，数千种基因及其产物，即RNA和蛋白，以复杂而有序的方式发挥作用，从而使生命充满了的奥秘。但传统的分子生物学方法通常是以“一次实验研究一种基因”为基础，这样难以全面了解基因的功能。而生物微阵列是近年来新开展的生物学研究中最强有力的新工具之一，因为它使人们有可能对一整套基因及其产物同时进行研究。
微阵列是指固定在测试板上的样品点中的生物分子的一种有序排列，可作为介质与已知的和未知的生物分子样品相匹配。固定在测试板上的分子通常被称为探针分子，而待测样品中的生物分子被称为靶分子。在探针分子与靶分子形成特异的生物分子互补对的情况下，可通过测试点的有序排列来确定生物体测试样品中的特定生物分子以及这些分子的丰度。互补生物分子的典型实例包括DNA杂交对、基因-反义基因等。微阵列中样品点的直径通常小于200μm，但样品点直径为300μm或300μm以上的“微阵列”也有见描述。
生物微阵列技术的应用非常广泛，如诊断、新基因和新蛋白的鉴定/发现、药物开发、药理和毒理学研究，等等。当把不同来源的生物组分，如来源于健康细胞和肿瘤细胞的生物组分吸附在同一阵列上时，该技术还可用于对比检测。
近年来，生物微阵列中有一种类型特别引起人们的关注DNA微阵列。该技术允许在单个芯片上监测整个基因组，因而使人们有可能对数千种基因之间的相互作用同时进行更好地研究。
现有技术一般而言，利用DNA微阵列测定生物活性的传统方法如下所述将探针cDNA链(长度一般为500-5000个碱基)以特定的有序阵列固定在固体板上(一般为玻璃板)。然后将探针cDNA暴露于单独的或混合的一种或几种靶(来源于测试样品的标记cDNA)。靶，即标记cDNA，是以酶学方法利用逆转录酶由提取于测试样品并被特异性标记分子标记的RNA样品产生。将样品的逆转录RNA转录物与微阵列上的探针cDNA杂交。由于每个测试点发出的标记信号反映微阵列上每个测试点的每种特定转录物的相对转录量，因而可通过测量微阵列上每个测试点每种标记分子的位置和浓度的方法来确定每种靶cDNA的数量和类型。为了排除样品变异，优选的是以两种竞争性样品之间的信号比作为衡量标准。
荧光标记的核苷酸利用该技术进行信号检测的基础通常是在体外掺入的用适当荧光团标记的核苷酸，也就是将不同颜色的特定荧光团(荧光分子)分别插入到由每种样品提取的RNA中。从而将用不同颜色荧光团标记的核苷酸掺入到将与探针cDNA杂交的靶cDNA中。这些荧光团可以被不同波长的光激发，同样也可以发射不同波长的光。利用激光和适当的滤光片分离两种或多种cDNA群体产生的信号通常可以实现这一目的。
但原材料的需要量一般约为50μg总RNA，或相当于约5×107个细胞。正因为所需原料的量相对较高，使许多十分相关的应用领域无法使用该标准技术，其中包括临床诊断。导致灵敏度不足的一个极为重要的因素是，目前使用的荧光团标记核苷酸在由RNA逆转录成cDNA的过程中掺入率较低。因而在每个合成的cDNA中只掺入了相对较少量的荧光分子。此外，需要通过细胞培养掺入荧光的应用领域也被排除在外，因为利用细胞机制通常无法加入荧光团标记的核苷酸。一些新兴的技术可用于获得更好的信号强度，其中包括样品材料的酶学扩增方法以及化学信号放大方法。这些方法说明有可能减少样品量。
最近公布的一些扩增技术可以使样品量减少至100ng总RNA的原材料[1]。其实现方法是在RNA与cDNA之间进行一轮或多轮循环反应。该反应的每轮可以使原料增加约50倍，其方法是在一个末端连接T7启动子以使RNA能够产生，并在另一末端充分利用某些逆转录酶的特性，用于在第一次逆转录时将一种特定引物添加至所有cDNA的5’末端。这种特性是避免产生长度较短的cDNAs所必需的。
另一种可选策略是用化学方法将测试材料的信号放大。目前可使用的最灵敏的策略依赖于被标记的分支型合成DNA分子的嵌套缠结[2，3，4]。在进行阵列杂交前，可将这些分子结合于cDNA的聚腺苷酸尾。一般可以使信号强度提高250倍。
这些策略的性能可靠性和灵敏度都未经严格的测试。由于酶的加工特性以及不同mRNA转录物长度的巨大变化，这些扩增技术有可能会导致原材料出现一定程度的偏差。
因此，现有技术的主要缺点是需要大量的测试原材料来获得足够的信号强度，以及目前可用的荧光团都难以被逆转录酶接受的问题。
放射性标记的核苷酸已知被逆转录酶接受性差的问题可通过用放射性同位素标记核苷酸的方法来解决。
此前，放射性同位素被广泛应用于核酸的灵敏检测和定量。常见的用法是将单纯的一种放射性核素，一般是β发射核素，掺入到一种探针(探测核酸)中，或直接掺入到体内。检测的方法是使用液体闪烁计数器或γ计数器，在二维分布的情况下(如Northern和Southern印迹)则采用放射自显影胶片、磷光成像仪和数字放射自显影系统。
在组织薄切片或Southern及Northern核酸印迹膜上检测放射性化合物分布的传统方法是胶片放射自显影，该方法仍然是高分辨率研究的通常选择。但是其动态量程有限(只有1.5-3个数量级)、灵敏度低，并且操作费力，结果不精确。
储荷磷光屏成像系统的灵敏度远高于胶片放射自显影方法，比使用32P在X-射线胶片上显影的方法灵敏250倍，比使用14C和35S直接进行胶片放射自显影的方法灵敏60-100倍。这些系统的线性动态量程为4-5个数量级，并且定量方法的结果要比使用胶片获得的结果可靠得多。但是其最小阈值以下的活性范围不能精确定量，从而不可避免地限制了活性分布测量的精确度。
后两种放射显影方法的一个主要的实际问题是在采集图像之前需要知道曝光时间，以避免出现曝光不足或曝光过度。尤其是在使用胶片时，若曝光时间为几个月，则错误地估计曝光时间可能会导致浪费大量的时间。
与后两种放射显影方法有关的问题大多可通过使用直接检测事件的数字系统来解决。其结果具有绝对线性，计数速率只受限于电子仪器的速度，并由于可在任何时间检查累积图像，因而无需精确地估计曝光时间。尽管目前可使用的此类系统的几何分辨率还不能与胶片技术相比，但是与磷光屏成像系统的分辨率相当。
但这些技术无法区分不同的非单能核素的分布情况，因而不能对生物微阵列同一点上的两种或多种不同的发射体同时进行定量检测。显然，这阻碍(妨碍)了在需要对一种以上的样品，如一个健康细胞和一个肿瘤细胞，产生的放射活性同时进行比较的各项应用。因此，在重要的诊断和研究领域的一整类应用都不能享受含有放射性同位素的标记核苷酸和/或其他生物分子所带来的利益。
此外，根据我们的知识，用于实施传统放射显影的已知方法和装置都局限于在所有分子的表面只标记一种放射性核素或有限的放射性同位素。因而需要一种常规的方法，用于在生物微阵列的每个点上同时测定两种或多种不同的放射性核素的放射性/强度。带有平行孔的γ相机可用于同时测量一种表面上几种γ放射性核素的分布。但这种相机不能分辨亚毫米级的空间结构。
发明目的本发明的主要目的是提供一种基本上消除或减少上文所述问题的方法和装置，用于同时对一种或多种靶生物分子进行定量和/或比较，这些分子被不同的放射性同位素标记，继而吸附在沉积于一种基质上的生物分子探针阵列上。
本发明的另一目的是提供一种特定的方法和装置，用于同时测定两种或多种cDNAs，这些cDNAs被分布情况不同的β发射核素标记，继而被吸附在一种DNA-微阵列上。
发明概述上述目的可以通过下文所述及所附权利要求中阐明的特征来实现。
本发明的目的可通过使用一种数字检测系统来实现，该系统能够a)记录撞击检测器表面的每个粒子/光子的位置和能量，b)进行实时整理和数据简化，并c)根据整理的数据同时估计探针表面任意区域内存在的两种或多种放射性核素的量，如利用本发明的两位发明人最近公布的方法[5]在放射自显影图像中分离出两种放射性核素的分布情况。
数字检测系统或装置包含一个用于小放射性样品的检测和成像的电子器件，它能够寄存和记录每个穿过该装置传感系统的放射性粒子的储积能量和位置。该器件是美国专利5,656,818和欧洲专利0,983,705中公开的仪器的进一步改进形式，因而这两个专利均引入作为参考。该仪器的工作原理与上述专利中公开的仪器基本相同。因而我们只概括叙述本发明的仪器的工作原理，该仪器可以说由两个主要部分组成1.一种被设计成单板形式的双面单片半导体条带传感器。该板优选的是表面积大于或至少等于生物微阵列的表面积。典型的尺寸是，面积为10平方厘米数量级，厚度约为300μm。半导体板一面的表面覆盖灵敏p型材料平行带或“条”，另一面的表面覆盖n型材料平行带或条。n型带与p型带垂直。从而在带的每个交接点都形成一个pn-二极管，所有带则组成一个矩阵，可用于对放射性粒子的撞击位置进行二维读数。也就是说，只要使这些pn-二极管处于反向偏置状态，它们就能够在放射性粒子穿过二极管空间时，对其连接的两个正交条位置上的电流脉冲产生反应。条带间距通常为50μm数量级。因此，对64mm×32mm的灵敏区域而言，其条带将为1280×640个，从而使该装置具有一个含820,000像素的二维网格。这种半导体传感器板可被制成能够对所有类型的放射性粒子产生反应，其中包括α、β、γ和正电子射线。根据放射性的能量等级和类型，可以使用Si、GaAs、CdTe或CdZnTe等材料的单片板。
2.一种用于读出传感器信号的电子系统。该系统可包含一个环绕传感器板的多芯片模块(MCM’s)，以及若干个平行FE芯片(ASIC)，每个芯片都带有前置放大器和噪声过滤放大信道的一个阵列。对于每个撞击传感器的放射性粒子，由传感器上带有最大信号的x-和y-条带以及相邻的两个或多个条带产生的电荷信号都将被相应FE-芯片中的相应信道所集成和过滤，以计算出该粒子的能量。一般而言，撞击的放射性粒子都将通过使传感器板上的疏松材料发生电离而释放其能量，因而该粒子的能量与传感器板有效条带上记录的信号的振幅总和成正比。x-和y-侧放大信号可用一种数据采集系统(DAQ)从MCM读出，从而控制计算机可以接收到放射性粒子撞击的x-y坐标和事件的能量。
通过固态技术与高集成读出电子器件的这种特定结合，人们可获得具有高灵敏性、高精确性和高可靠性的装置，该装置可记录每个穿过其传感器板的放射性粒子的位置和能量。从而将该传感器板与生物微阵列紧密接触，即可测量由生物微阵列的每个测试点产生的放射性。为了使该装置具有通用性并适用于不同类型的放射线，可以考虑为其配备可替换的传感器板，这些传感器板的尺寸相同，但是由不同单片半导体材料制成，并且易于插入到集成的读出电子器件中。因此，举例来说，如果使用的是一种对β射线响应良好的由硅制成的传感器板，而又希望检测被γ发射体标记的生物微阵列时，可以将硅传感器板替换成对γ射线响应良好的由镉-锌-碲制成的传感器板，从而很快地使该装置适用于此类检测。
在记录时，微阵列玻璃板面朝下与该装置的半导体传感器板紧密接触，其间隔有1.3μm的聚酯薄膜片。因而该检测系统由于其pn-二极管的二维模式而能够同时记录入射放射性粒子的能量及其起始的生物微阵列上的位置。这意味着总发射强度必须足够低，以使该装置能够逐个记录每次发射。在整个表面内，可准确测量的最大活性的范围是宇宙背景辐射(约1Bq)至10MBq，但对许多实际应用而言，优选的是以4-6kBq为限。但在测量β发射体时，比较和/或同时测定其活性是一个常见问题，因为它们能够以几种不同的能级发射，通常可形成连续的能谱。也就是说，即使人们使用两种发射β粒子并且其平均能量具有明显差异的放射性同位素，也无法通过记录的粒子能量来直接确定该粒子来源于两种同位素中的哪一种。但是可以针对每种放射性核素来分别测量两种同位素的能谱，只要这些同位素的能谱具有足够大的差异，就可以利用这些能谱来区分每种同位素的分布情况。
在本发明的方法中，产生同位素能谱的方法是将发射的β粒子的整个能量跨度划分成kmax个不连续能级(energy bin)的一种向量，其中，kmax是一个正整数，优选的是大于20。也就是说，对探针面的每个区域r，根据被记录的β粒子所属的第k个能级将其分类。从而可根据表达式Erk=Σij∈rEijk,]]>获得探针面每个区域的同位素实际能谱的一个不连续向量表示。
通过实时数据整理以及可能的后续简化，该装置可在预设测量期结束时以含有k个能带的图像(能带图)的形式提供图像信息，这种图像类似于含有红、蓝、绿等颜色带的彩图。能带图的一个元素，称为Ei，j，k，包含了在数字坐标i，j处记录的位于第k个能量间隔内的粒子数量。
对任一图像区域r，记录的不连续能量矩形图Erk都是每种实际放射性同位素的已知能谱的一种线性组合。下文将说明使用两种同位素时应采用的方法，但应该认识到，该方法可应用于任意数量的同位素。如果与采集能带图时使用相同能级获得已知能谱，并且已进行标准化，以使所有能级的总和为1，则可以如下所述进行计算用sAk和sBk分别表示用同位素A和B的纯样品获得的能级k的能谱。并且用ar和br分别表示同位素A和B在区域r内的未知分配(contribution)(记录的总发射数)。重要的是参照谱的能级要与实际测量的数据采集以获得能带图(Erk)时使用的能级相同。
那么Erk＝sAkar+sBkbr(1)这些关系可用于文献[5]提供的上述任一种算法，以估计探针面每个区域的ar和br。该文献提供了两种一般算法，即最小二乘法(LS)和最大似然法(ML)。这两种算法均在此引入作为参考，只需说明一点，LS-算法最简单，其所需的计算能力要比ML-算法少得多，但缺点是估计的偏差稍大。因此，我们在下文的论述中以LS-算法为重点，但仍需强调的是，这两种算法均在本发明中引入。
LS-算法的工作原理如下目的是找到在哪种ar和br分配下得到最小的完整向量最小误差和Sr，其中Sr如下Sr=Σi=kkmax(Erk-sAkar-sBkbr)2-----(2)]]>
最小值的计算方法是∂Sr∂ar=0]]>和∂Sr∂br=0-----(3)]]>上文描述的是用该方法确定两种同位素的分配情况。而只需简单地在等式中为每种附加的同位素添加一标准项“Sck*cr”，即可将该方法用于任意数量的同位素。
该方法的实际使用形式如下针对传感器板的每个像素ij，都在装置的记忆系统中建立一个具有kmax个计数器的向量Eijk。整个数据集Eijk最初被设为零。当第x，y个像素记录到一个β粒子时，具有适当能级数k的第x，y计数器增加1。持续该过程，直到记录的事件数量足以产生一个能谱的统计学表示，然后将该结果应用于一种算法，以确定探针面每个区域r内的同位素A和B在记录的能量矩形图中的分配。
为了获得一个具有广泛应用性的灵活装置，可为其配备一个包含大量像素的分辨率极高的传感器板。这样可以使多种应用领域中的生物微阵列分辨率低于传感器板的分辨率，此时，如果将周围像素的记录数据加到中央像素上，从而将记录数据压缩，则可以节约大量的计算时间。也就是说，例如，将一个像素与其周围最邻近的所有像素(共9个像素)的记录事件都加到中央像素上，则可以使分辨率和计算结果的数量都降低9倍。如果所需的分辨率更低，则可以将周围两列的所有邻近像素(共25个像素)都包括在内，等等。这样可以模拟一个分辨率较粗的传感器，从而相应地减少所需的计算步骤。空间区域的压缩还可以明显增加所得压缩能带图中每个元素Erk的事件记录数，从而使估计的分配具有更高的统计精确性。
此外，该方法还要求提前知道每种实际放射性核素的预期能谱。其获得方法是，在检测未知样品之前，用分布有每种实际放射性核素源的表面对装置进行校准。
装置中整合有自动校准程序，利用该程序可以测量传感器板一侧(x-侧)的每个条带的能谱。通过确定这些能谱的一阶矩和二阶矩，就可以确定相对于参照条带的零偏移和增益(注意，校准过程未考虑邻近条带储存的能量)。继而这些校准数据可用于实时修正每个检测到的放射性事件的能量。此外，该校准过程可以避免由外部光子(γ)源带来的散射辐射导致能谱改变的问题。
由于含生物微阵列的玻璃板相对于装置的主轴可能存在轻微的旋转，因而必须测定旋转角，以使微阵列的测试点在图像上精确地形成垂直的和水平的行列。测定最佳角度的方法如下将能带图Eijk中的所有条带相加，形成一个总图，也就是对指数k求和。然后将该图逐步旋转，每次旋转0.1度，并针对每个新角度分别计算该图在x-轴和y-轴上的投射。最佳旋转角相当于变化最大(即最大对比差)时的角度。这些投射值可以方便地用于确定矩阵的上、下、最左和最右的位置。从而能很容易地识别测试点及其占据的相关区域。由此可以创建一个新的能带图，使其每个点都相当于一个测试点所占据的区域。这样可以显著地提高最终结果的统计精确性。此外，通过使矩阵与一个虚拟矩阵相关联，即可对该矩阵的外边界进行测定。该方法的优点是不需要由用户输入。
该方法和装置是作为一种通用方法来描述的，它适用于对已记录能谱的一种以上放射性同位素的分配同时进行测定，该能谱可以是每种同位素产生的未知量的叠加。由于β发射体具有相互重叠的能谱，在对其进行检测时显然需使用该方法，但是对单能性更佳、从而产生的独特能谱一般互不重叠的其他放射线而言，该方法似乎并不是必需的。尽管如此，本发明的方法在这些情况下仍具有一些优势，原因是该方法由于能区分可能重叠的能量分配，从而允许使用那些发射光子或能量差较小的粒子的放射性同位素。此外，该方法还可以自动处理由背景辐射和无法避免的散射导致的二次记录问题，从而使测定结果具有极佳的精确性。该特征显然对所有类型的放射线而言都是一个优点。
附图简述
图1a是具有条带的传感器板的示意图，以及二维pn-结点(二极管)阵列的略图。
图1b显示在传感器板撞击位置附近测量的储积能量的典型分布。该图中，放射性粒子在传感器板上的撞击点用十字标记，终止点用箭头标明。
图1c示意一个放大器信道的流程图。
图1d显示传感器板及其周围用于测定放射性粒子撞击位置和能量的电子器件的示意图。
图2示意在同时测定两种或多种cDNAs情况下的本发明优选实施方案的流程图，这些cDNAs被分布不同的β发射核素标记，然后吸附在DNA微阵列上。
图3是示意用于区分每种放射同位素分配的数据处理过程的框图。
图4是显示以实际的能量间隔数(能级)由本发明的装置测量的能谱曲线图。
图5显示33P和35S标记的鲑鱼精子的单独测定结果和组合测定结果的x-轴投射。
图6显示对33P和35S标记的来自OHS骨肉瘤细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系的RNA分别进行同时测定后获得的虚拟荧光点。
发明详述下文将根据附图和本发明优选实施方案的一个实例来对本发明进行详细说明。
如上所述，用于记录入射放射性粒子的撞击位置和能量的装置包含两个部分带有正交条带的双面条带传感器板，以及周围用于测量传感器板在放射性粒子撞击时产生的捕获信号的读出电子器件。
图1a显示传感器板2的示意图，其中，在传感器板的两面排列有正交的条带，并且在条带的交叉点形成了位于传感器板内部的pn-结(二极管)。
总的来说，这种传感器板是一种众所周知的装置，主要用作物理学研究中的检测器。在用于记录β发射时，这种传感器板是一个由加工的高电阻率硅晶片切割而成的矩形片。其厚度通常为300μm，大小通常为数十平方厘米。更具体的实例是6.4cm×3.2cm的装置。在晶片两面均横跨嵌入了窄间距的低电阻率条带，并且一面嵌入的是P+，另一面嵌入的是N+。条带的间距通常为50μm，因而在上述大小的实例中，可以在一面嵌入1280个条带，而在另一面嵌入640个(正交的)条带。由于嵌入的是P+/N+条带，因而每个条带交叉处都将成为一个P+/N+(pn-)结点，这意味着每个交叉处都是一个小二极管。从而表示该实例中的装置将由1280×640个pn-结点(二极管)的二维阵列组成。这使该装置具有位置分辨(成像)性质。为了激活这些二极管，必须在一面条带与另一面条带之间施加偏压。为了使二极管处于反向偏置状态，P+面必须施加负偏压。此时，这些二极管处于反向偏置状态，只有微弱的漏电流流过。
当一个放射性粒子由样品矩阵发射，并进入传感器板，则该粒子可透入传感器空间(正交条带之间)，并在前进过程中将其能量遗留在晶片内部。在实际使用这种传感器的大多数情况下，该粒子将释放其所有能量并最终停止。释放的能量将使包含反向偏置二极管的空间发生电离。根据穿透的角度，可能有一个或多个二极管包含被移动粒子影响而发生电离的空间。每个被影响的二极管都将对电离作用产生反应，从而释放出与该粒子在该二极管释放的能量成比例的电荷。从而通过将所有被影响的二极管所释放的电荷相加，就有可能知道透入粒子最初具有多少能量。因此，双面检测器就成为一种能够测量各个撞击粒子的位置及其能量的检测装置。
大多数粒子都会以一定的角度穿透传感器，也就是不与平面垂直(见图1b)。因此，常见的情况是粒子的能量足以使其以一定的角度前进一定距离，从而形成一个穿越若干二极管空间的轨迹。交叉的条带结构不能准确测定这是哪个二极管，因为条带的读数只提供这些二极管在x-轴和y-轴上的投射，也就是确定一个包含被影响的二极管的矩形区域。这种鉴别能力在本发明中非常重要，因为它有助于确定粒子进入传感器的点，从而提高“成像”质量。
如上所述，对信号能量的测定也十分重要。通过将条带产生的信号相加即可获得总能量。但这些条带的能量分布曲线也很重要，因为它是最终确定粒子进入点所必需的。根据物理特性，该空间内的移动粒子在其终止时能够使最多的物质发生电离。也就是说，能量测量值最大的条带将是终止点的投射位置，而进入点也可根据这一知识来确定。
若没有办法将条带的电荷信号读出到计算机中，那么硅传感器将毫无用处。信号的读出由周围的读出电子器件来完成，本发明的这些电子器件可读出传感器的一些特性，这在上一节已有描述。对这种传感器而言，这些电子器件的最小可用配置是每个条带都连接有一个放大器，用于将传感器产生的电荷转换成放大器输出的可测电压。放大器输出的电压变化与该条带连接的二极管释放的电荷量成正比，因而也与粒子在该条带所含区域中释放的能量成正比。图1b说明了如何用放大器测量粒子的储积能量。粒子进入传感器板的位点用十字标明，接着粒子向下移动，这在图中未标明，但通常还具有一个水平移动的分量，图中用箭头显示。受影响的条带将使其连接的放大器输出端产生一个电压振幅(V)，其能量值(E)代表了储积在真实条带中的能量。该实例的条带信号的振幅用纵条表示。一面纵条的总和表示粒子释放的总能量，如上所述，最高的纵条可用于确定粒子移动的终点。
应该强调的是，该实例只显示了很少的条带。实际上，条带的数量将会很大，而受影响的条带数量通常与该实例使用的数字接近。这意味着该方法可用于少量提高空间分辨率，但相对来看，不会与该实例中呈现的情况接近。在许多应用领域，只对一个受影响的条带进行检测已足以达到要求。
为了使这些电子器件可用于通过计算机来捕获条带信号，每个放大器后面必须平行连接一个触发部件和一个振幅测量部件。如图1c所示。触发部件包含一个具有预定阈值的鉴别器，它可以告诉系统检测到了一个粒子。振幅测量部件包含一个取样/保持器，它可以储存条带的能量依赖性振幅值。
图1d显示周围电子器件的完整结构，它负责将粒子最初产生的适当数据传送到系统中。传感器的两面将使用相同类型的电子器件，这些电子器件通常被集成在ASIC中。一个ASIC所具有的空间只供特定数量的信道使用，因而可将几个ASICs彼此串联，以完全覆盖传感器的一面(所有条带)。显示在这些信道后面的电子器件将与其处在同一芯片上，但制备的方式应满足以下条件，即平行使用一个以上的芯片时，这些电子器件能够象全部处在一个单芯片上一样运转。
这种ASIC的作用方式如下所有信道将平行检测条带上的信号。当一个粒子撞击传感器时，一个信道可通过触发部件检测到该事件。实际上可以有一个以上的信道检测到同一信号，但内部的判优机制将确保只有一个信道检测到。一旦完成该检测，触发信号将被传送到外部系统(文中未做描述)，并指示外部系统从芯片读出数据。此时，芯片将把产生触发信号的信道的位置(地址)提供给系统。继而还把作用中心附近的多个条带的信号振幅提供给系统。模拟值将被依次传送，首先是产生触发信号的信道的振幅，然后是按照某个方向的下一条带的振幅，等等。此外还以相同的方式同时对相反方向的条带进行读数，以获得另一方向的读出值，并且从同一点开始读数。该原理可用于快速读数，并且具有灵活性。具有灵活性的原因是无需对所有条带进行扫描，而是只需对触发条带附近的条带进行读数。如上文所述，需要读数的条带通常只有少数几个。该系统可以选择要对多少条带进行读数。
系统时钟将会使数据传送同步。在传送振幅值的过程中，可以在位置数据行保留或不保留位置地址。
传感器的另一面具有与刚描述的一面完全相同的结构和作用方式。为了收集所需的位置信息，需要进行双面读数。
用于测定微阵列上每种放射性同位素分配情况的本发明所述方法的一种优选实施方案如图2和图3所示，方法是将上文描述的传感器板和读出电子器件与一种数据采集部件和一台计算机部件相连接，该计算机部件中装有能够实现[5]提供的一种或两种算法的软件。该实例是对DNA分子的活性进行测定，这些DNA分子被两种不同的β发射体标记并吸附在DNA微阵列上。如上所述，两种放射性核素的能谱应基本上截然不同，并且具有适当的衰变特性和能级，从而能够在适当的时间范围内测定β发射。因此，35P和33S是两种适当的放射性核素。图4显示这些同位素纯样品的能谱。
在图2中，数字1标明含有被未知量的放射性β发射体35P和33S标记的DNA微阵列的玻片。将玻片置于硅制单片半导体双面传感器板2之下并压紧，以使传感器板覆盖DNA微阵列。传感器板2与DNA微阵列之间隔有1.3μm厚的聚酯薄膜片(未显示)。因而当一种放射性核素发射一个β粒子时，该粒子将撞击传感器板2，并在基本上直接位于发射出该β粒子的放射性核素之上的pn-二极管中产生一个小电流脉冲。装置的读出电子系统3将提取该像素的位置(x，y-坐标)，和DNA微阵列上产生该β粒子的实际测试点。此外，该电子系统还测量β粒子的能量，并将信息以数字形式传送到数据采集部件4，该部件可存储所有记录到的事件，并根据记录的位置和能量将这些事件进行组织。数据采集部件4可含有任一种常规的数字存储部件，如RAM-存储芯片、硬盘、软盘、CD-ROM，等等。
当数据采集部件接收的数据足以进行可靠的统计学分析时，也就是当元素Eijk带有足够的信息时，即可终止对传感器板的事件记录。
然后将记录的能带图输入软件程序，该程序针对微阵列每个测试点位置的每个像素，或是如上文所述进行区域压缩后的每个像素，利用[5]提供的一种算法计算出每种同位素的量。也就是说，该算法可以确定每种放射性核素对Eijk所起的作用(根据记录的事件数)，或是在测试点较大的情况下对Erk所起的作用(正确地定量当然需要了解核苷酸的半衰期以及检测器对实际放射性核素的灵敏度(表面上每单位活性的记录事件数))。该过程以示意图的方式显示于图2和图3的突出显示框内。这些附图描述的实例是对两种β发射核素进行检测，采用的算法为最小二乘法，并且像素被压缩了9倍(位于同一层的周围所有像素都被加到中央像素上)。
该方法的一个优点是能够计算每个测试点位置的每种同位素的绝对量。因而在表现信息的方式上可以有几种选择。当测定两种同位素时，一种选择是计算出这两种同位素在每个测试点的比例，并将其以生物微阵列虚拟图的方式来表现。另一种选择是在单个图像中模拟由红色/绿色荧光技术获得的色彩将一种放射性核素的图像密度指定为红色，另一种指定为绿色，然后产生红色与绿色以不同比例混合的色标度。此外还可以表示为柱状图，以显示每种放射性核素的绝对量。
RNA绝对量的测定下文将以测定被已知量的33P和35S标记的RNA的绝对量为例，说明本发明所述方法和装置的优选实施方案的可行性。
在对装置进行校准之后，以及对DNA微阵列进行测量之前，如下文所述分别测量33P和35S的能谱使放射性核素溶液在玻片上均匀沉积，并使其干燥。由这些玻片获得的多个能带图都具有15keV的能级，并且从较低的阈值20keV开始有20个能级。利用相同的能级大小和能级数建立能谱，这些能谱被认为与检测器的位置无关，因而全部能带图都对能谱产生影响。用回归分析法以及最大似然法分别计算33P和35S对每个像素(或每个点)的未知影响P和S。将所得图像P和S以常用于表示荧光图像的方式显示为单个图像。磷图像(P)发送至显示的红色通道，硫图像发送至绿色通道。因而等量的红色和绿色产生了黄色。
所有实施例的DNA阵列都按下述方法制备包被用于印制的玻片是购自J.Melvin Freed Brand(Sigma.Cat.No.S-8902)的聚L-赖氨酸包被的洁净显微镜用玻片，尺寸为75×25mm。玻片的赖氨酸包被方法是将其置于NaOH/EtOH溶液中(75g NaOH，300ml ddH2O和450ml 96％EtOH)，并在定轨摇床上振荡2小时，然后转移至高纯水(双蒸水，ddH2O)，并上下浸没至少10次，直到玻片表面澄净。再将玻片置于新ddH2O中反复振荡清洗，然后浸在聚L-赖氨酸溶液中(40ml聚L-赖氨酸，40ml PBS和300ml ddH2O)，并在定轨摇床上振荡1小时。最后将玻片置于ddH2O中反复清洗，并旋转干燥(500rcf，5分钟)，然后于55℃暴露1小时。在印制之前，玻片可在室温下至少保存2周。
印制用一种按NI H的P.Meltzer所述自制的自动仪器作为阵列印制仪。使用的硬质合金开口销由Beecher Inc.制造，一次运行使用8个销针(2×4)，可印制48个玻片。清洗销针，方法是在1M NaOH中浸2分钟，然后在10％SDS中浸2分钟，再用ddH2O简短冲洗。然后用超声简短处理10秒，再用ddH2O冲洗。然后用加压空气将销针吹干。在Costar 96孔板(U形底，聚苯乙烯，cat.no.3367)中使DNA PCR产物沉淀并溶解于25μl 3×SSC，这些DNA可直接用于印制。印制在湿度约为50％的条件下进行。印制期间的温度约为27-30℃。使用的阵列含有2200-2700种基因。
后处理将玻片用100mJ剂量的UV处理，以使DNA与聚L-赖氨酸交联封闭液的配制方法是在搅拌条件下将6.0g琥珀酸酐溶解在335ml 1-甲基-2-吡咯烷酮和15ml 1M硼酸(pH8.0)中。然后将玻片浸没在该溶液中，并在定轨摇床上振荡15-20分钟。将玻片置于ddH2O中简短清洗，然后在热水(95℃)中浸泡2分钟，再移至96％冷EtOH中浸泡30秒。最后将玻片干燥(500rcf，5分钟)并保存待用。
所有实验使用的cDNA探针都按下述方法制备将2-5μg总RNA转换成33P/35S标记的第一链cDNA放射性的掺入使用Amersham Pharmacia Biotech的a-33P-dATP，10mCi/ml，cat.no.AH9904和a-35P-dATP，10mCi/ml，cat.no.AG1000。
在冰上进行RT-反应5×第一链反应缓冲液 4.0μlRNasin 0.5μlDTT 100mM2.0μl锚定的寡聚-dT 2μg/μl 1.0μl20×低-dA/NTP混合物 1.0μla-33PdATP/a-35dATP 4.0μl5μg总RNA+H2O 6.5μl19.0μl将反应于65℃温育5分钟，然后冷却至42℃并温育5分钟。加1μlSuperScriptII酶，并于42℃再温育30分钟。再加1μl SuperScriptII酶，并于42℃再温育30分钟。加5μl 500mM EDTA以终止反应，然后加10μl 1M NaOH，并将混合物65℃温育60分钟，以使RNA水解。然后将混合物冷却至室温，并加25μl 1M Tris-HCL(pH7.5)以中和溶液。在澄清之前将制备好的探针保存在冰上。
探针澄清(cleanup)和制备用Microcon柱使探针澄净。每个RT-反应加300μl 1×TE，将两种不同标记的样品合并，然后转移至Microcon柱，并在13K条件下离心，直到剩余30-50μl溶液。反复添加TE并离心，最终获得10μl的澄净溶液。将柱倒置插入一个新管，并在13K条件下离心1分钟，以回收探针。探针的终体积为18μl(用于大小为22×20mm的一个盖玻片)，其中包含有1μl 10μg/μl COT-1 DNA、1μl 8μg/μl聚腺苷酸、1μl 4μg/μl酵母tRNA、1μl 10μg/μl BSA、1μl 50×Denhardt溶液、3.1μl 20×SSC(终浓度3.5×SSC)和0.5μl 10％SDS(终浓度0.3％)。然后将探针置于沸水浴中加热2分钟，再于13K条件下离心10分钟。
实施例1为了说明本发明所述方法和装置的可行性，用33P和35S进行模拟实验，这两种同位素都稀释在鲑鱼精子DNA中，并且点样在玻片上，以使每个未稀释点的放射性约为1贝克勒尔。此外，为了说明本发明所述方法和装置的动态量程，还进行了一系列稀释以稀释5个对数。对两种同位素的每一种都单独进行了如此操作，并且对两种同位素的组合物也进行了如此操作。使用的点状网格包括中心距离为250μm和400μm两种。图5显示所有3组实验的结果，其中有荧光点形式的结果，为了显示与稀释度的定量关系，也有作为x-轴信号投射的记录能谱形式的结果。
实施例2为了证实本发明的方法和装置可应用于微阵列领域，用较少量的两种细胞系RNAs进行实验。其他均采用标准的微阵列方法。利用OHS骨肉瘤细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系这两种不同细胞系的RNA来说明能够成功地区分不同的核素，图6以伪彩色图像的重叠形式将两种同位素显示为荧光点图。该图清楚地说明本发明的方法和装置能够实现对信号的动态变换，其结果与利用荧光团进行实验的预期结果类似，但RNA原材料的使用量要低得多。
如前文所述，放射性标记的生物物质能够很容易地掺入活细胞，这与大多数荧光物质正相反。掺入的方法可以是添加中间替代物，例如已掺入放射性同位素的核苷酸、氨基酸或其他成分。这种可能性使其具有一系列新的应用领域，这里介绍其中的两种实施例3细胞内所有蛋白的量都在一定程度上受其相应RNA的稳定性的调控。这通常被认为与聚腺苷酸尾的长度有关，并且与其他序列特异性因子也有一定关系。迄今为止，首选的方法都是对单独种类的mRNA进行检测。掺入两种放射性标记的方法使人们有可能通过与标准的比较来监控群体中所有类型的mRNA。如果与DNA微阵列技术结合，则可以在基因组水平上对RNA半衰期进行扫描。
作为用酶学方法在无细胞系统中使用放射性cDNA的替代方法，可以在时间点0将a35S-UTP和a33P-UTP以适当的浓度添加到平行细胞培养的培养基中。然后使细胞生长至时间点1，此时掺入的放射性核苷酸足以允许对细胞从时间点0开始产生的RNA进行检测。在时间点1，对一组平行样品进行化学处理，以阻断RNA合成。在时间点2，收集两种培养物，分离RNA，并把来自两种培养物的等量RNA相混合。然后按实施例1的cDNA组合探针处理方法对该混合物进行处理，并使其与微阵列杂交。
最后记录信号并进行分析，以确定每种核苷酸所起的作用，从而计算出比率。这一数据反映了可在该细胞系中检测到的所有种类的RNA的相对半衰期。这种新方法与通过标准的微阵列分析获得的传统信息相结合，可用于在基因组水平上监控RNA半衰期在细胞调控方面的重要功能。
实施例4在蛋白组学(protemics)这一新兴领域可采用与实施例3类似的方法，此时使用的是氨基酸标记。例如，磷酸化是所有细胞的主要调控现象，通过掺入在培养基中添加的放射性标记的标记物，则可以对蛋白的各种磷酸化程度进行监控。通过印制抗体阵列，还可以对多种不同蛋白的磷标记同时进行监测。
本发明是以分别标记有不同β发射核素的两种DNA/RNA物质的比较试验的实施例方式来描述的，但应该强调的是，本发明的方法和装置可作为通用方法，用于检测生物微阵列上吸附的放射性标记生物分子的量。它可应用于所有类型的放射性，其中包括α、β、γ、正电子射线，以及所有放射性核素，尤其是那些可掺入靶分子从而将微阵列每个点的放射性调至1-100贝克勒尔数量级的辐射。此外，尽管该方法特别适用于具有重叠能谱的放射性(β发射体)，但应该了解的是，就单能辐射而言，尤其是使用的放射性核素产生能差较小的辐射时，该方法中对记录的放射性事件的统计处理也会带来一些好处。这些好处包括极佳的背景噪音(二次辐射，等等)过滤/分离能力和极高的灵敏性。本发明的方法和装置还设计用于一种或一种以上的不同放射性核素。放射性核素的种类数在理论上不存在限制，但实际限度是少于约20种，优选的是少于约10种，更优选的是少于5种不同的放射性核素。
参考文献1.Wang，E.，Miller，L.D.，Ohnmacht，G.A.，and Liu，E.T.(2000)，″High-fidelitymRNA amplification for gene profiling″，Marincola FM Nat Biotechnol，18(4)，457-459.
2.Nilsen，T.W.，Grayzel，J.and Prensky，W.(1997)，″Dendritic Nucleic AcidStructures″，J.theor.Biol.，187，273-284.
3.Wang，J.，Rivas，G.，Fernandes，J.R.，Jiang，M.，Paz，J.L.L.，Waymire，R.，Nilsen，T.W.，and Getts，R.C.(1998)，″Adsorbtion and Detection of DNA Dendrimers atCarbon Electrodes″，Electroanalysis，10，553-556.
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5.Kvinnsland，Y.and Skretting，A.(2000)，″Methods for separation of contributionsfrom two radionuclides in autoradiography with a silicon strip detector″，Phys.Med.Biol.，45，1183-1193.
权利要求
1.一种方法，用于在沉积、吸附或固定有一种或多种放射性核素的探针面的任意区域内同时测定这些核素的量，其中的每一种放射性核素都作为沉积、吸附或固定在该探针面上的化学或生物探针物质上的靶组织切片、靶化学化合物或生物靶分子中掺入的化合物上的标记，其特征在于-记录由探针面任意区域发射的粒子和/或光子的位置和能量，以及-利用在每个区域记录的绝对量信息，通过对这些信息进行任意适当的统计学评估来确定该区域内存在的每种放射性核素的量和/或活性。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于-将来自于探针面各个区域的发射的粒子和/或光子的记录位置和能量作为能带图加以保存和积累，也就是作为整个探针面每个区域r的kmax能级的一个向量加以保存。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于-统计学评估包括最小二乘法，该方法是将预先记录的每种放射性标记的能谱的线性组合——即作为每种放射性核素的分配的未知系数——针对能带图(测量的复合能量矩形图或向量)的一个像素或一个区域的数据进行拟合，和/或-最大似然法，该方法是利用测量的每种放射性标记的能谱来找出得到记录的能量矩形图或向量的每个能级内的每种放射性标记产生的最可能撞击数，由此提供从每种放射性核素发生的总事件数。
4.根据权利要求2或3的方法，其特征在于，该方法可用于探针区域直径一般小于200μm的生物微阵列，以及探针区域直径一般大于300μm的宏阵列。
5.根据权利要求1-4的方法，其特征在于，该方法可用来对一种或多种发射α、β、γ或正电子粒子和/或光子的放射性核素定量，这些放射性核素被掺入靶分子，从而将探针面上每个探针区域的放射性调至1-100贝克勒尔数量级。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，该方法可用于那些具有部分和/或完全重叠的能谱的非单能放射性标记，包括β发射核素。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述β发射核素包括33P和35S。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，该方法可用于通过与一种标准细胞类型/系的样品的比较来监测一种细胞类型/系的样品的整个mRNA群体，其中-在时间点0将a35S-UTP和a33P-UTP以适当的浓度添加到平行细胞培养的培养基中，-然后使细胞生长至时间点1，此时掺入的放射性核苷酸足以允许对细胞从时间点0开始产生的RNA进行检测，-在时间点1，对一组平行样品进行化学处理以阻断RNA合成，并且-在时间点2，收集两种培养物，分离RNA，并把来自两种培养物的等量RNA相混合，最后-将该混合物作为cDNA的组合探针进行处理，并使其与生物微阵列杂交，由此可以确定两种放射性标记的总量。
9.根据权利要求1-6之一的方法，其特征在于，该方法用于通过将放射性标记的氨基酸标记掺入培养基，然后将其吸附在含有多组结构化抗体的生物微阵列上而同时监测多组蛋白的磷酸化程度。
10.一种装置，用于对沉积、吸附或固定有一种或多种放射性核素的探针面上的任意区域内的放射性核素进行同时定量，其特征在于，该装置包含-一种电子系统，用于实时测量由探针面测试区域发射的放射性粒子/光子的撞击位置和储积能量，该系统包含一种在相对的两面分别带有正交的p-型和n-型条带的多条带半导体检测器、可检测每个放射性事件在检测器上的撞击位置(x，y-坐标)和粒子/光子储积能量的读出电子器件，以及使探针面的整个表面与半导体检测器接触，其间只隔有薄的聚酯薄膜片以保护半导体检测器的一种加载机制，-一种实时数据组织模块，可跟踪并保存每个记录的放射性事件的位置和能量，并且可将半导体检测器的每个像素(x，y-位置)记录到的事件划分成k个能级的向量，从而形成一种能带图，-一种计算机模块，含有可利用能带图来确定半导体传感器板任一像素或压缩区域上存在的每种放射性标记的绝对量或绝对活性的硬件和软件，以及-一种用于显示半导体板，或任选探针面选定测试区域内，每个像素的每种放射性标记活性分布的模块。
11.根据权利要求10的装置，其特征在于，用于实时测量放射性粒子/光子的撞击位置和储积能量的读出电子器件包括-一种放大器信道，每个条带的放大器信道都由一个前置放大器及过滤部件，以及平行的一个触发部件和取样/保持部件组成，和-一种与放大器信道相联的数据采集系统，该系统能够跟踪所有记录到的撞击半导体传感器板灵敏部位的放射性事件的位置(x，y)和能量。
12.根据权利要求10或11的装置，其特征在于，半导体检测器包括一种单片半导体材料的双面板，其尺寸通常为10平方厘米，厚度约为300μm，敏感区为64×32mm2，并且半导体板相对面的n-型灵敏条带和p-型正交条带的带间距都是50μm，因而形成1280×640的总条带或820000像素的二维网格。
13.根据权利要求10-12的装置，其特征在于，加载机制和半导体检测器都被设计成能够将半导体板取出并替换成具有类似的像素结构和尺寸，但为了使该装置能够检测不同类型的放射性而由另一种半导体材料制成的另一种半导体板。
14.根据权利要求13的装置，其特征在于，该半导体板是含有下述材料之一的一种单片板Si、GaAs、CdTe或CdZnTe。
15.根据权利要求10-14之一的装置，其特征在于，该装置的计算机模块含有利用每个像素的k个能级的记录向量的信息来区分/确定半导体传感器板每个像素的每种放射性标记对记录的能谱所起作用的绝对量，采用的方法是最小二乘法，该方法是将预先记录的每种放射性标记的预期能谱的线性组合对测量的复合能谱进行拟合，和/或最大似然法，该方法是利用每种放射性标记的预期能谱来找到各种放射性标记在每个能级内的最可能撞击数，从而产生记录能量的能量矩形图。
16.根据权利要求10-15之一的装置，其特征在于，跟踪并保存每个记录的放射性事件的位置和能量并将半导体检测器每个像素(x，y-位置)记录的事件划分成k个能级的向量的实时数据组织模块能够通过将所有邻近像素的向量信息加到中央像素的向量上而将记录并保存的数据压缩以节约计算时间，从而使数字图的虚拟分辨率与探针面的物理平面分辨率保持一致，并且/或提高预计分配的统计精确性。
17.根据权利要求16的装置，其特征在于，实时数据组织模块可以将周围任意行数的像素相加，以使虚拟分辨率与探针面的粗阵列保持一致，也就是说，当把1行像素相加时，则是把中央像素周围的所有8个邻近像素加到中央像素中，当把2行像素相加时，则是把周围第一行的所有8个像素和周围第二行的所有16个像素都加到中央像素中，等等。
18.根据权利要求10-17之一的装置，其特征在于，用于呈现所测定的探针面每个测试区域内每种放射性标记的活性的模块包含有图形处理工具，用于将数据以代表探针面的虚拟图的形式呈现，其中，每种放射性核素用不同的颜色表示，并且用相应颜色的强度来表示所测定的在探针面每个测试区域内每种放射性标记的活性，从而在生物阵列虚拟图中产生一个可以直接与传统荧光技术的结果相比较的色标度。
19.根据权利要求10-17之一的装置，其特征在于，用于呈现所测定的每种放射性核素的活性的模块包含有可将数据以柱状图形式呈现的工具，该柱状图可显示每种放射性核素在探针面每个测试区域内的绝对量。
20.根据权利要求10-19之一的装置，其特征在于，该装置配备有可根据生物阵列每个测试点的最上、最下、最左和最右的位置来测定物理范围的工具，方法是将能带图的所有能带相加，以形成单一的总图，计算总图的x-轴和y-轴投射，将生物阵列图逐步旋转并重复上述过程，每次旋转0.1°，然后根据总图的y-轴投射值变化情况计算出测试点的行与x-轴对准时的旋转，并且利用这些投射值来确定测试点在图像中的行列位置。
全文摘要
本发明涉及一种方法和装置，用于在沉积、吸附或固定有一种或多种放射性核素的表面的任意区域内同时对这些核素定量。这些放射性核素可作为以不同原理与该表面化学物质结合的组织切片或较大的生物分子中通常掺入的化合物的标记。该方法特别适合于利用标记有不同β发射核素的核苷酸进行DNA微阵列推演。
文档编号C12M1/00GK1496411SQ02806354
公开日2004年5月12日 申请日期2002年1月11日 优先权日2001年1月12日
发明者E·霍维, A·斯克雷廷, E·尼高, Y·克温斯兰, K·布雷斯托尔, K·约施奥卡, ┌驴, E 霍维, 姿雇卸, 死淄, 滤估 申请人:莫列斯生物有限公司