专利名称：同时对乙肝病毒基因型定型和定量的方法
技术领域：
本发明涉及一新颖的引物对、探针对和用乙肝病毒基因为模版所扩增而得的核酸，和用其同时对基因型作定型及定量乙肝病毒的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，即基因序列位置上一群变异的单核苷酸，其分布于整个基因序列中。单核苷酸多态性也可以是等位基因。也就是说，由于存在该基因多态性，因此一物种中某些个体具有非变异序列(野生型)，而另一些个体则具有变异序列(变异型)。就动物个体而言，基因多态性可能导致隐性遗传疾病。上述疾病包括牛淋巴球粘着缺乏症(Bovine LeukocyteAdhesion Deficiency)、瓜胺酸血症(Citrullinemia)、枫糖尿病(Maple SyrupUrine Disease)、尿苷单磷酸合成酶缺乏症(Deficiency of Uridine MonophosphateSynthase)、α-甘露糖苷贮积症、泛发性糖原贮积症等。人类的囊性纤维化(cysticfibrosis)是上述隐性遗传疾病之一，该病患者群约占白种人族群中两千分之一。就诸如细菌或病毒之类的微生物病原体而言，单核苷酸多态性与不同的致病效应有关，并因此影响该病症的病人的治疗及长期预后状况。依据上述，迫切需要一种能够有效鉴定及定量内含单核苷酸多态性的核酸的方法。
发明内容
本发明涉及新颖的引物对、探针对和以乙肝病毒基因为模版所扩增而得到的核酸，和将其同时用于基因型定型及乙肝病毒定量上的应用。
本发明涉及一种能够同时鉴定一微生物目标核酸的单核苷酸多态性和定量该目标核酸的方法。该鉴定和定量是同时执行的。
本发明方法需使用第一探针及第二探针。该第一探针是与一目的核酸的第一序列相同或互补的，其包含与单核苷酸多态性相对应的碱基；该第二探针与一目的核酸的第二序列相同或互补，其不包含与单核苷酸多态性相对应的碱基。该第一探针共价结合于第一荧光标记，该第二探针共价结合于第二荧光标记。该第一荧光标记及该第二荧光标记中之一为荧光团供体，另一为荧光团受体，如此一来，当该第一探针及第二探针与该目的核酸杂交时，该荧光团供体与该荧光团受体处于邻近位置，使得两者之间能够进行荧光共振能量转移(FRET)。
本发明方法包括将一样本中的目的核酸复制扩增的步骤，其是通过聚合酶链式反应(PCR)以一对引物(primer)序列进行的，使得样本中该目的核酸形成一包含该第一序列及该第二序列的双链核酸。上述第一探针及第二探针在聚合酶链式反应的退火(annealing)步骤中与该核酸产物杂交，以分别形成第一双链(duplex)及第二双链。上述两种探针可以杂交于该核酸产物的同一链上。上述两种探针亦可以杂交于该核酸产物的不同链上，并且使得该荧光团供体与该荧光团受体位于邻近位置上。例如该两种探针所杂交的序列可以位于该核酸产物双链所形成的叉状结构或泡状结构上。
样本中目的核酸的定量检测，是通过测量该第一探针上荧光团受体所发出的荧光量进行的，其是在每一聚合酶链式反应循环的退火期的最末阶段进行的。上述荧光量的测定是将该待测荧光强度与一预定值比较得知，其中该预定值是由含有已知浓度的该目的核酸的溶液测量而得。上述荧光量的测定亦可将该聚合酶链式反应的交叉值(cross point value，Cp value)与一预定值比较得知，其中该预定值是由含有已知浓度的该目的核酸的溶液测量而得，其测量方法如Mackay I.等，Nucleic Acids Res.301292-1305，2002所述。
聚合酶链式反应完成后，加热使得温度高于该第一探针及其互补序列形成双链核酸的解链温度(melting point)。当该双链核酸分离时，上述荧光团供体与荧光团受体之间的FRET受到干扰。该目的核酸中单核苷酸多态性的鉴定，是以一激发光照射该荧光团供体，并测量该第一探针的荧光团受体所发出的荧光量的改变，该荧光量的变化为所升高温度值的函数。举例来说，鉴定一单核苷酸多态性时，首先，建立该第一双链核酸的一级导数解链曲线，其中该第一双链核酸包含一荧光标记探针，且该解链曲线基于随温度而变的荧光量而有所变化。其二，建立一温度曲线，其基于解链曲线的解链峰而得。其三，比较该温度值与该双链核酸的解链温度，其中该双链是由该第一探针与一互补序列形成。当该温度值比该解链温度低时，该目的核酸中存在一单核苷酸多态性，当该温度值与该解链温度相同时，则不存在单核苷酸多态性。
在另一方面，本发明提供了可用以扩增HBV的目标核酸的引物对，例如正向引物为TACTGCGG(SEQ ID NO13)及反向引物为GGTGAAGCGA(SEQ ID NO14)、正向引物为CGTGGAACC(SEQ ID NO17)及反向引物为GGTGAAGCGA(SEQ ID NO14)或正向引物为CTCAGGCCA(SEQ ID NO20)及反向引物为AACGCCGCAGACACATCCA(SEQID NO6)，其中每一个引物的长度为8到50个碱基(例如，15到40或18到30个碱基)。上述引物对亦可以为如下序列正向引物为CCGATCCATACTGCGGAAC(SEQ IDNO9)及反向引物为GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA(SEQ ID NO10)、正向引物为GCATGCGTGGAACCTTTGTG(SEQ ID NO1)及反向引物为CAGAGGTGAAGCGAAGTGC(SEQ IDNO2)、正向引物为TCATCCTCAGGCCATGCA(SEQ ID NO5)及反向引物为AACGCCGCAGACACATCCA(SEQ ID NO6)。
在本发明的另一个方面，提供了探针对，用于同时鉴定乙肝病毒中目标核酸的单核苷酸多态性及定量该目标核酸。该探针对分别包含下述序列编码(SEQ ID)的基因第一探针为TTGTCTACG(SEQ ID NO18)及第二探针为CGCTGAATC(SEQ IDNO19)、第一探针为TACGCGGACTC(SEQ ID NO15)及第二探针为GCCTTCTCATC(SEQ IDNO16)或一感应探针为ACACGGGTGTTTCC(SEQ ID NO21)及一锚定探针为ATTGAGAGAA(SEQ ID NO22)，其中每一个引物的长度为9到50个碱基(亦即，15到40或18到30个碱基)。上述探针对亦可为如下序列一感应探针ACGTCCTTTGTCTACGTCCCG(SEQ ID NO3)及锚定探针CGGCGCTGAATCCCGCGGAC(SEQ IDNO4)、感应探针TCTTTACGCGGACTCCCC(SEQ ID NO11)及锚定探针TCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC(SEQ ID NO12)、感应探针AAGACACACGGGTGTTTCCCC(SEQ ID NO7)及锚定探针GAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAGTCTA(SEQ ID NO8)。
本发明亦提供以乙肝病毒基因为模版所扩增而得的核酸产物，其包含SEQ IDNO15、18及21的基因，或其互补基因序列，其中每一个核酸产物的长度为100到1,000个碱基(例如，200到700或300到500个碱基)。上述核酸产物与上述引物及探针杂交，用以鉴定及定量含有单核苷酸多态性的目标核酸，其中该目标核酸取自HBV基因。
本发明亦提供一可同时鉴定及定量含有单核苷酸多态性的HBV目标核酸的试剂盒。该试剂盒包含1、2或3对上述引物对和/或探针。
本发明实施例的实施细节如下所述，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围应以权利要求的范围为准。
具体实施例方式
本发明的目的是提供一种同时鉴定乙肝病毒基因型及定量该基因的方法。
本发明方法需使用第一探针及第二探针。该第一探针的设计是依据目的核酸中熟知的单核苷酸多态性及其特性来设计的，例如，GC含量、退火温度、内部配对等，其可以软件程序来决定。为使得该第一探针能够鉴定不同种个体核酸中的单核苷酸多态性，该第一探针的序列是与一含有单核苷酸多态性的序列相同或互补的，能用以鉴定该物种中至少两种不同的基因型。上述序列的决定是通过比较该物种不同个体的脱氧核糖核酸的标准序列得到的，其方法与下文中“探针及引物的设计”单元中所述方法类似。上述不同个体的脱氧核糖核酸序列可由任何恰当的资料库中取得，例如www.ncbi.nlm.gov/PMGifs/Genomes。
该第一探针与一单核苷酸多态性配对基因(例如野生型)杂交而形成一双链核酸，且其中不具有任何错配的碱基对。该第二探针与另一单核苷酸多态性对偶基因(例如突变型)杂交而形成另一双链核酸，且其中具有错配的碱基对。由于上述双链核酸的后者具有错配的碱基对，故其解链温度(Tm)较前者为低。该第一探针可以设计为以基因为基础的方式来区分野生基因型及突变基因型。该第一探针与野生型基因及突变型基因杂交产生双链核酸的能力可以用实验方法测定。上述两种双链核酸的解链温度的差异亦可以用实验方法测定的，其差异大小(例如达摄氏2度)需足以测量出两者间的差异。
以肝炎病毒为例肝炎病毒包含单核苷酸多态性的基因序列为TACGCGGACTC(SEQ ID NO15)，TTGTCTACG(SEQ ID NO18)，ACACGGGTGTTTCC(SEQID NO21)(前述粗体斜线的字母表示对应于单核苷酸多态性的碱基)上述单核苷酸多态性能用来区分肝炎病毒A基因型至G基因型。参见表1及表2，以及下文中“同时鉴定及测量”一节。
上述包含单核苷酸多态性的序列，其侧翼的序列最好为一物种中不同基因型个体的保守序列(即，无变异的序列)。如下文所述，该保守(或无变异)侧翼序列对于设计第二探针以及聚合酶链式反应引物相当重要。
该第二探针的设计基于两个原则。其一，该第二探针不包含单核苷酸多态性，且其序列与物种中不同基因型的保守序列相同或互补。其二，该保守序列与上述包含单核苷酸多态性的序列相邻。此种设计的目的在于，当该第一探针及该第二探针与目的核酸杂交后，该两种探针的位置能够相当靠近，例如间隔1至3个碱基。
上述第一探针及第二探针连结于荧光标记，并可通过已知技术以直接或间接的方式测定。该荧光标记之一为荧光团供体，另一为荧光团受体，该荧光团供体所发出的荧光发射光谱(emission spectrum)与该荧光团受体的激发光谱(excitation spectrum)重叠。当该第一探针及第二探针与该目的核酸杂交时，该荧光团供体与该荧光团受体处于邻近位置，使得两者之间能够进行荧光共振能量转移(FRET)。上述荧光团受体所发出的荧光能够通过已知技术鉴定及定量。凡是发光光谱及激发光谱重叠的两个荧光标记都可以用来标定上述第一探针及第二探针，例如LightCycler-Red 640可以为上述荧光团受体，而荧光黄(fluorescein)可以为上述荧光团供体。
要同时鉴定和定量一目的核酸，须将上述探针与该目的核酸混合，立刻进行聚合酶链式反应(PCR)。上述PCR反应所用的引物(primer)对是根据已知技术的原则设计的。该引物序列尤其应该与单核苷酸多态性侧翼的序列相同或互补，其中该侧翼序列为一物种中不同基因型个体的保守序列。上述引物对是用于将含有单核苷酸多态性的目的核酸复制扩增。上述脱氧核糖核酸序列可由任何恰当的资料库中取得，例如组织匀浆物(tissue homogenate)、血液样本，并且，其可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸，若为核糖核酸，则在进行聚合酶链式反应的前应先施以反转录步骤。上述聚合酶链式反应依据一般标准程序进行，其可以参照Innis等(1990)PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，HarcourtBrace Javanovich，New York。在一实施例中，实时聚合酶链式反应是采用市面上可购得的实时聚合酶链式反应系统(Roche Molecular Diagnostic承销的LightCycler)。
聚合酶链式反应的三个步骤(即变性、退火、延伸三步骤)可以重复进行多次，使得能够获得足量的与目的核酸相对应的产物。其重复进行的次数则与其所使用的样本性质及其他因素有关。如果上述样本为复杂的核酸混合物，则我们要获得足量的上述目的核酸时，则重复进行聚合酶链式反应的次数必须较多。通常上述聚合酶链式反应重复进行的次数至少20次左右，但也可能达到40次、50次、60次甚至100次的多。上述聚合酶链式反应的产物与上述探针退火后，即可用以鉴定及定量上述目的核酸。
样本中目的核酸的量的测定，是通过测量上述荧光团受体所发出的荧光量实现的，其是在每一聚合酶链式反应循环的退火期的最末阶段通过照射上述荧光团供体实现的。上述发出荧光的强度是上述复制扩增的核酸产物量的函数，而上述核酸产物量是该目的核酸原始浓度及聚合酶链式反应重复次数的函数。若聚合酶链式反应重复进行的次数够多，则该复制扩增的核酸产物的累积率及荧光量变化率即进入一对数线性阶段。将该荧光强度值对该聚合酶链式反应次数绘图，即可获得对应于该对数线性阶段起点的聚合酶链式反应重复次数(亦即交叉值，Cp值)。然后，将上述测得的Cp值与一预定值比较，其中该预定值是由含有已知浓度的标准核酸溶液测量而得。利用下文中“HBV定量”一节所述的方法，即可获得一系列的上述Cp预定值。因此，我们可以通过将一给定的Cp值与上述一系列Cp预定值进行比较，即可得知该目的核酸的原始浓度。
或者，亦可将其所发出荧光强度与一预定荧光强度值比较，而来定量一目的核酸。除了其对应的核酸原始浓度为已知外，该预定荧光强度值是以相同方式决定的。
要鉴定一目的核酸，可于聚合酶链式反应结束后，对复制扩增的核酸产物进行解链曲线分析而得知。将该聚合酶链式反应后的反应溶液缓慢加热，其加热梯度约为每秒钟升高摄氏0.5度，使得温度高于该第一探针及其互补序列形成的双链核酸的解链温度。同时在照射该荧光团供体时，监测该荧光团受体所发出的荧光量。将该荧光强度(F)对该解链温度(Tm)作图，即可得到一解链曲线图。继的，将该荧光强度(F)对温度(T)微分，取其负值(-dF/dT)对温度作图，以获得该解链曲线的一次微分曲线，来确定一解链峰值。将该解链峰值所对应的温度与该第一探针的解链温度比较。在一较佳实施例中，上述解链曲线分析是用LightCycler分析软件(3.5版)进行的(Roche Diagnostics Applied Science，Manngeim Germany)。当该温度值低于该解链温度，则表示该目的核酸中含有单核苷酸多态性，当该温度值等于该解链温度，则表示该目的核酸中不含有单核苷酸多态性。上述方法能够有效地同时鉴定和定量含有单核苷酸多态性的核酸。
虽然本发明已以较佳实施例如上公开，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可进行修改和变化，因此本发明的保护范围应根据权利要求所要求的范围而定。
探针和引物的设计由www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/viruses.html所示资料库中取得216段完整的肝炎病毒DNA序列。其中有175段序列经鉴定为属于A到G基因型的病毒，该鉴定操作是用Biology WorkBench所提供的CLUSTRLW Multiple SequenceAlignment，DRAWTREE及DEAWGRAM软件进行的(workbench.sdsc.edu/)。
在上述175段基因序列中，有47段属于B基因型，有49段属于C基因型。将上述两种基因型的基因序列排列比较，以鉴定出另一含有单核苷酸多态性且两侧序列为上述两种基因型共有基因的基因序列片段，这是通过CLUSTRLW多序列比较程序(CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment program)进行的。上述步骤比较出三段基因序列，并据此设计出三对引物及探针，这是根据TIB MOLBIOL(Gerlin，Germany)所提出的原则进行的。上述引物对可通过PCR反应由其个别目的核酸来产生复制扩增产物。上述复制扩增产物、引物对及探针对的基因位置总结如表1所示。
表1用于鉴定及定量HBV中单核苷酸多态性的复制扩增产物、引物对及探针对
1核酸位置(nt)是以乙肝ayr亚型基因库的位置表示(GenBank登录号NC_003977)。
2P表不3’端经磷酸化处理以避免探针在PCR时延伸。
3FLU表荧光(flourescien)；LC-Red 640表示Light-cycler Red-640。
4所示TM值为平均数，TM值±1℃是为基因型定型所容许的。
5SNP位置以粗体、底线标示。
复制扩增产物1在核酸位置1425处含有一C/T单核苷酸多态性。复制扩增产物2在核酸位置1544处含有一A/T单核苷酸多态性。上述两种单核苷酸多态性位于HBx基因上。复制扩增产物3含有4个单核苷酸多态性，其分别为HBV的核酸位置285处(A/G单核苷酸多态性)；HBV的核酸位置287处(G/A单核苷酸多态性)；HBV的核酸位置292处(G/A单核苷酸多态性)；HBV的核酸位置294处(T/C单核苷酸多态性)。上述4种单核苷酸多态性均位于HBs基因上。
上述引物及探针由TIB MOLBIOL所合成。其中，第二探针(锚定探针)的3’端具有荧光标记，含有单核苷酸多态性的第一探针(感应探针)则是在5’端具有LC-Red640染剂标记。上述感应探针的3’端也已磷酸化。
为确认上述复制扩增产物中含有单核苷酸多态性，由40位乙肝病人取得血清样本，依照下文中“HBV的DNA制备”一节中所述方法由该血清样本中制备DNA。利用传统的PCR反应复制扩增上述基因样本，再将该等基因样本的复制扩增产物以ABI PRISM Big-dye试剂盒分析其基因序列，并通过ABI 3100 Genetics Analyzer(Applied Biosystem，Foster City，CA)分析的。结果显示，上述20种样本的复制扩增产物含有HBV C基因型的单核苷酸多态性，而另外20种样本的复制扩增产物含有HBV B基因型的单核苷酸多态性。
HBV DNA的制备由114位慢性乙肝病人取得血清样本。所有上述病人均由台湾大学附设医院门诊进行后续追踪。为确认上述血清提供者确患慢性乙肝，进一步以市售肝炎测试剂(Ausab，Ausria II，Murex HbeAg/抗-Hbe，Abbott Laboratories，North Chicago，IL)测试该血清样本含有HbsAg、抗-HBs、抗-HBc Igs、HBeAg、抗-HbeAg。上述血清中的HBV DNAs也以分支链DNA分析法(QUANTIPLEX tm HBV DNA Assay，ChironCorporation，Emeryville，CA)分析，根据该产品厂商提供的操作方法进行。上述操作均依照1975年赫尔辛基宣言中所示的医学伦理准则进行。
然后，由上述样本中制备HBV基因，这是用高纯度病毒基因制备试剂盒(RocheDiagnosis Applied Science，Mannheim Germany)进行的。取200μl的上述血清样本，将其与200μl的结合缓冲液混合，在摄氏72度中反应10分钟，其中该结合缓冲液成分包含6M盐酸胍(guanidine-HCl)、10mM尿酸、10Mm Tris-HCl、20％Triton X-100(体积/体积)、200μg的poly(A)、0.8mg胰蛋白K。然后，将该反应混合液与100μl的异丙醇混合，滴入一已预先充填了玻璃纤维的高纯度过滤管中。将该过滤管以一除去抑制物的缓冲液冲洗两次后，以100μl水将该病毒核酸洗出，其中该除去抑制物的缓冲液成分包含100％乙醇、20mmol/L氯化钠、2mmol/LTris-HCl。
然后，利用常规方法确认上述HBV病毒DNA所属的基因型，所述常规方法包括PCR-PFLP、使用基因型特异性引物的PCR、及直接测序等等。上述肝炎病患的血清中，有60个样本经鉴定为含有B基因型的HBV，而46个样本经鉴定为含有C基因型的HBV。其余8个样本中的HBV则无法以上述常规方法决定出其所属的基因型。
HBV定量为进行HBV的定量，必须先以质粒pHBV 48为对象，做成一复制量标准曲线。该质粒的制造是将1.5mer的HBV DNA片段(核酸位置为2851至3182/1至3182/1至1281)插入pGEM-3Z载体8中。上述质体合成后，用质粒纯化试剂盒(QIAGEN GMbH，Hilden Germany)纯化，并以光谱仪定量。其对应的HBV效价(拷贝/mL)是以每一质体的质量决定的。然后，将该质体进行一系列稀释，以得到HBV效价值介于1×102拷贝/mL至1×1011拷贝/mL的10个样本。上述10个样本根据下述方法做成一标准曲线。
每一上述样本，取2μl，将其与下列溶液混合0.5μl的LightCycler fastStartDNA Master杂交混合物、0.2μl的25mM氯化镁、以及如上文“探针及引物设计”一节中所述的第二探针，其中该LightCycler fastStart DNA Master杂交混合物包含成分Tag DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、10mM氯化镁、dNTP混合液(RocheDiagnosis Applied Science，Mannheim Germany)。混合上述液体后，将最终反应液的体积调整到5μl，使得每一反应液中的引物浓度为5μM，而每一反应液中的探针浓度为0.5μM。将上述最终反应液装入LightCycler毛细管中并离心，再置入LightCycler样本旋转架中(Roche Diagnosis Applied Science，MannheimGermany)。
然后，根据下述程序执行一实时PCR反应。首先以摄氏95度加热该反应液10分钟，使得DNA变性解链。然后重复进行如下程序55次于摄氏95度加热5分钟，使得DNA变性分离；于摄氏55度加热10秒，使得DNA退火；于摄氏72度加热20秒，使得DNA分子延伸。上述反应中温度转换速度的设定为分离/退火转换为每秒钟20度；而退火/延伸转换为每秒钟5度。在每一次退火步骤完成时，测量LC-RED640发出的荧光量。决定每一样本的Cp值，并利用LightCycler软件3.5版，将样本的Cp值对样本浓度对数值作图，即可得出标准曲线。上述标准曲线在1×102拷贝/mL至1×1011拷贝/mL的范围内呈现一直线段，表示其测试限度为1×102拷贝/mL。
然后测试该标准曲线以定量HBV DNA。该测试操作所使用的测试样本包括由HBV Genotype Panel(International Enzymes，Inc.，Fallbrook，CA)取得的15个基因型为A至F的样本、由QUANTIPLEX bDNA剂组取得的4个样本。上述19个样本均包含已知其效价的HBV。将上述样本进行实时PCR，并以上述方法获知其Cp值。并利用上述标准曲线找出与Cp值相对应的效价。针对每一样本进行6次(3次重复实验)上述定量作业。上述测试结果显示所有样本的效价均为正确。
将上述方法所获知的效价与依据传统方法获知的效价进行比较，其中该传统方法包含NGI SuperQuant、Roche Amplicor、Chiron Quantiplex bDNA assays。上述三种传统方法的实施根据其制造商提供的操作方法进行。将上述方法测得的效价对上述三种传统方法测得的效价进行线性回归，结果显示其具有显著相关(γ值分别为0.9866，0.9830及0.999)。通过皮尔森关联(Pearson correlation)估算其组间差异系数与组内差异系数。其结果为P值小于0.001，显示该方法具有相当的再现性。
HBV的鉴定测试上述三组探针对及引物对，以区分出在台湾、大陆及日本三地流行的乙肝病毒及丙肝病毒。
由上述样本中选取10个含有基因型B基因序列的样本，以及10个含有基因型C基因序列的样本。依据上述“HBV定量”一节中所述方法，以上述样本及第2组引物及探针进行PCR反应。于PCR反应结束后，先将反应液置于摄氏95中60秒，再将其冷却至摄氏45度(温度下降速度为每秒钟下降摄氏0.5度)，将该反应液置于摄氏45度中120秒，在将其加热至摄氏80度(温度上升速度为每秒钟上升摄氏0.5度)。同时，测量640nm的荧光量。绘出所有上述样本的解链曲线后，将该荧光强度(F)对温度(T)微分，取其负值(-dF/dT)对温度作图，以获得该解链曲线的一次微分曲线，来决定一解链峰值，上述解链曲线分析是用LightCycler分析软件(3.5版)进行的。
上述解链曲线的一级导数曲线显示，上述样本的解链峰值依其值的大小分为两群。且上述两群样本的解链温度平均值分别对应HBV基因型B及基因型C的温度(其分别为摄氏60.9度及54.8度)。上述10个含有基因型B基因序列的样本，其解链温度与60.9度的差异均在1.8度的内，亦即ΔTm(6.1度)的30％之内。上述10个含有基因型C基因序列的样本，其解链温度与54.8度的差异均在1.8度之内。因此1.8℃(或ΔTm(6.1度)的30％)是区分基因型B及基因型C的分界点。根据上述方法测定，第1组及第3组复制扩增物(及其相对应的引物和探针)的基因型分界点分别为2.5℃和4.9℃。上述平均解链温度和分界点总结于表1中。
然后，利用上述3组引物及探针，测定如前文“HBV DNA制备”一节中所述的60种B基因型的HBV及46种C基因型的HBV的基因型。采用第1组引物及探针时，上述106种HBV中，可以正确判定其中103种HBV的基因型。至于3个未被正确判定的样本，有1个被错误判定，另外2个则无法判定。采用第2组和第3组引物及探针时，则分别有1个和2个样本无法正确判定。然而，若同时采用上述3组引物和探针中任意2组时，则可以正确判断所有上述106个样本的基因型。
同时鉴定及定量HBV通过上述引物及探针与上述方法，针对含有B基因型及C基因型的HBV的样本同时进行鉴定及定量。自台湾大学附设医院(台北，台湾)取得含有B基因型及C基因型的HBV的质粒。将含有B基因型及C基因型的HBV的质粒依不同比例混合，其混合比例介于10∶1到1∶10之间。依据上述“HBV的鉴定”一节中所述方法，鉴定该质体混合液所含HBV的基因型，其中该质体混合液的效价为每毫升107个质体。上述操作的结果显示，各样本的解链曲线的一次微分曲线显示对应HBV B基因型及C基因型的解链曲线与解链峰值。同时，依据如前文“HBV定量”一节中所述的方法，测得各样本的Cp值及其中所含质体的效价。上述操作的结果显示，上述方法可以同时鉴定及定量一样本中所含的主要HBV群及次要HBV群。其中，上述次要HBV群的质体效价至少为上述主要HBV群的10％。上述方法可以仅以单管样本，同时鉴定及定量一含有单核苷酸多态性的目的核酸，该方法具有极佳的效率、正确性及灵敏度。
本发明方法除了可以用于鉴定及定量B基因型及C基因型之外，也可以用于其他基因型的鉴定及定量。前文“探针及引物的设计”一节中所述的175个HBV DNA序列，均可以依据该节所述方法排列比较。该引物及固定探针的序列在A到G的基因型中，均保持不变。还检验了对应复制扩增物的单核苷酸多态性，其序列变异及相对频率均如表2所示。
表2.HBV A基因型A至G基因型中单核苷酸多态性序列的变异
下划线字母和数字表示较低的变异及其频率。
如表2所示，7种基因型中除了基因型B及D之外，在3种复制扩增物中均具有独特的单核苷酸多态性组合。因此，可以依据下述方法，利用3组不同的引物及探针来鉴定HBV的基因型(1)使用第2组引物及探针，确定待测HBV是属于第1群(基因型A、C、E、G)或是第2群(基因型B、D、F)。
(2)使用第1组引物及探针，确定待测HBV是属于第1群的基因型A、G、C、E中哪一种。
(3)使用第3组引物及探针，确定待测HBV是属于第2群的基因型B、D、F中哪一种。
其他实施例虽然本发明已以数个较佳实施例如上公开，但它并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不违背本发明的精神和范围内，可以进行各种改变和修改，这些改变和修改都在权利要求范围内。
权利要求
1.一种可同时鉴定乙肝病毒目标核酸的单核苷酸多态性和定量该目标核酸的方法，其包括提供第一探针和第二探针，其中该第一探针与该目标核酸的第一序列相同或互补，所述第一序列包含与单核苷酸多态性相对应的碱基，所述第一探针的基因序列与SEQ ID NO7的序列具有至少90％的相似度；其中该第二探针与该目标核酸的第二序列相同或互补，所述第二序列不包含与单核苷酸多态性相对应的碱基，所述第二探针的基因序列与SEQ ID NO8的序列具有至少90％的相似度；通过聚合酶链式反应以一对引物来扩增该目标核酸，以形成一包含该第一序列和该第二序列的双链核酸产物，所述的一对引物之一的基因序列与SEQ ID NO5的序列具有至少90％的相似度，以及所述一对引物的另一引物的基因序列与SEQID NO6的序列具有至少90％的相似度；在反应液中将所述核酸产物分别与该第一探针和第二探针杂交，以分别形成第一双链和第二双链，其中该第一探针与第一荧光团共价结合，该第二探针与第二荧光团共价结合，其中该第一荧光团和该第二荧光团之一为荧光团供体，另一为荧光团受体，使得当该第一探针和第二探针与该目标核酸产物杂交时，该荧光团供体与该荧光团受体处于邻近位置，且其两者之间能够进行荧光共振能量转移(FRET)；加热该反应液，使得其温度高于该第一探针和其互补序列所形成的双链的解链温度；鉴定该单核苷酸多态性，通过用激发光照射该荧光团供体，并监测该第一探针的荧光团受体发出的荧光量的变化，该荧光量变化是升高的温度值的函数；和通过监测该荧光团受体所发出的荧光来定量该目标核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量步骤是将该荧光团受体所发出的荧光强度与一预定值比较。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，第一探针和第二探针与所述核酸产物的同一链杂交。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一探针和第二探针与所述核酸产物的同一链杂交。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该鉴定步骤包括建立该第一双链的一级导数解链曲线；确定该曲线的解链峰值所对应的温度值；比较该温度值与该双链的解链温度，其中该双链是由该第一探针与其互补序列形成，若该温度值比该解链温度低时，该目标核酸中存在一单核苷酸多态性，若该温度值与该解链温度相同时，则不存有单核苷酸多态性。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中该鉴定步骤包含建立该第一双链的一级导数解链曲线；确定该曲线的解链峰值所对应的温度值；比较该温度值与该双链的解链温度，其中该双链由该第一探针与其互补序列形成，若该温度值比该解链温度低时，该目标核酸中存在一单核苷酸多态性，若该温度值与该解链温度相同时，则不存有单核苷酸多态性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中该定量步骤是将该荧光团受体所发出的荧光强度值与一预定值比较。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中该第一探针和该第二探针杂交于该核酸产物的同一链上。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中该第一探针的基因序列是SEQ ID NO21，和所述第二探针的基因序列是SEQ ID NO22。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中该一对引物之一的基因序列是SEQ ID NO20，该一对引物另一的基因序列为SEQ ID NO6。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，其中该鉴定步骤包含建立该第一双链的一级导数解链曲线；决定该曲线的解链峰值所对应的温度值；比较该温度值与该双链的解链温度，其中该双链是由该第一探针与其互补序列形成，若该温度值比该解链温度低时，该目标核酸中存在一单核苷酸多态性，若该温度值与该解链温度相同时，则不存有单核苷酸多态性。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，其中该定量步骤是将该荧光团受体所发出的荧光强度值与一预定值比较。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，其中该第一探针和该第二探针杂交于该核酸产物的同一链上。
14.一种用于权利要求1所述方法的引物，其特征在于，该引物用于扩增乙肝病毒的目标核酸，该引物的基因序列与SEQ ID NO5的序列具有至少90％的相似度。
15.如权利要求14所述的引物，其特征在于，该引物的基因序列是SEQ IDNO5。
16.如权利要求14所述的引物，其特征在于，所述引物的基因序列为SEQ IDNO20。
17.一种用于权利要求1所述方法的引物，其特征在于，该引物该引物用于扩增乙肝病毒的目标核酸，该引物的基因序列与SEQ ID NO6的序列具有至少90％的相似度。
18.如权利要求17所述的引物，其特征在于，所述引物的基因序列为SEQ IDNO6。
19.一种探针，其特征在于，该探针包含一与单核苷酸多态性相对应的碱基，用于鉴定乙肝病毒目标核酸的单核苷酸多态性，该探针的基因序列与SEQ ID NO7的序列具有至少90％的相似度。
20.如权利要求19所述的探针，其特征在于，所述引物的基因序列为SEQ IDNO7。
21.如权利要求19所述的探针，其特征在于，所述引物的基因序列为SEQ IDNO21。
22.一种探针，其特征在于，该探针包含一与单核苷酸多态性相对应的碱基，用于鉴定乙肝病毒目标核酸的单核苷酸多态性，该探针的基因序列与SEQ ID NO8的序列具有至少90％的相似度。
23.如权利要求22所述的探针，其特征在于，所述引物的基因序列为SEQ IDNO8。
24.如权利要求22所述的探针，其特征在于，所述引物的基因序列为SEQ IDNO22。
25.一种用于权利要求1所述方法的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可同时鉴定乙肝病毒目标核酸的单核苷酸多态性和定量该目标核酸，该试剂盒包含如权利要求14所述的引物、权利要求17所述的引物、权利要求19所述的探针和权利要求20所述的探针。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，还包含如权利要求16所述的引物。
27.如权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，还包含如权利要求18所述的引物。
28.如权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，还包含如权利要求21所述的探针和权利要求24所述的探针。
全文摘要
一种可同时对乙肝病毒进行基因型定型和定量的方法。还公开了(1)一对引物，其分别包含SEQ ID NO13和14、SEQ ID NO17和14、或SEQ ID NO20和6的序列，每一引物的长度为8到50个碱基；(2)一对探针，其分别包含SEQ ID NO18和19、SEQ ID NO15和16、或SEQ ID NO21和22的序列，每一探针长度为9到50个碱基；(3)一以乙肝病毒基因为模版扩增而得的核酸，其含有选自SEQID NO15、19、22或其互补序列的序列，其序列长度为100到1000个碱基。
文档编号C12P19/00GK1995982SQ20071000188
公开日2007年7月11日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年3月21日
发明者陈培哲, 陈定信, 叶秀慧 申请人:普生股份有限公司