专利名称：细菌易位抑制剂以及细菌易位抑制方法
技术领域：
本发明涉及抑制细菌越过肠道屏障进行侵袭的细菌易位(translocation)抑制剂以及细菌易位的抑制方法。
背景技术：
几乎所有接触包括人在内的动物的微生物都是存在于动物肠道内的微生物。以人为例，每1g肠道内容物，在小肠的下端细菌数达到105～107，在大肠达到109～1011，细菌的种类据称大致有100种。这些细菌中的有害细菌侵入生物体内进行繁殖时，会引起所谓的条件性感染和多脏器功能不全、败血症等严重的疾病。
作为抑制这些疾病的方法之一，认为是抑制这些有害细菌透过肠粘膜侵袭腹腔、内脏器官等。
抑制这种侵袭的结构是肠道屏障。肠道屏障包括肠道免疫组织和解剖学结构。
肠道免疫组织是与消化道附属淋巴器官、分泌型IgA、吞噬细胞等有关的肠道周围特有的免疫组织。肠道屏障的解剖学结构是指粘膜的粘液层和上皮细胞等对细菌透过肠粘膜的物理性抑制。
具体地说，例如在细胞表层存在有构成细胞膜的一部分的蛋白、糖脂类、粘多糖类等糖类复合物。它们被称为糖衣或糖萼。这些结构发达则可以物理性地防御细菌的接触和攻击，使粘膜细胞的肠道屏障能力得到提高，降低上皮细胞的坏死、脱落的频率，降低对宿主生物体的负担。
我们将细菌越过肠道屏障侵入宿主生物体内称为细菌易位(BTL)。BTL的途径被认为有淋巴系统和血管两条途径。但是从多数动物实验、临床研究可以看出，淋巴系统是主要的途径。对于粘膜损害为轻度、由于细菌的异常繁殖而发生的BTL，细菌走淋巴途径；而伴有出血性休克等大的侵袭的BTL，则认为也另外有细菌直接进入血液中的途径。在淋巴性BTL中，细菌只侵袭至肠系膜淋巴结(以下简称为MLN)时，并不会显示严重的病态。但是，MLN中的细菌量超过可处理量时，细菌进一步侵袭血管系统和内脏器官，引发严重的疾病。因此，抑制侵入MLN的BTL与以BTL为起因的疾病的预防紧密相连。
禽畜肉用动物发生BTL时，涉及到食用部分的污染，不仅可能成为食物中毒的原因，也使正常的生长受阻，导致生产率降低。
现有的对发生BTL的人或动物的治疗方法例如有给予抗生素、疫苗、干扰素等。但是给予抗生素会导致出现耐药菌、副作用等问题。疫苗由于其效果是基于对每种感染菌的特异性作用机制而产生，因此对于通过给予疫苗来抑制BTL，需要给予对应于所有的感染菌的疫苗。干扰素价格高，可以对人使用，但从经济的观点来看，对于禽畜肉用动物则难以使用。
发明的公开本发明的目的在于提供简便而且有效地抑制BTL的药剂、以及简便且有效的BTL抑制方法。
根据本发明，提供含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活菌体作为有效成分的BTL抑制剂。
还根据本发明提供上述BTL抑制剂，所述BTL抑制剂的特征在于上述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌C-3102(通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所保藏号FERM BP-1096)。
进一步根据本发明提供上述BTL抑制剂，所述BTL抑制剂的特征在于上述枯草芽孢杆菌C-3102具有在经过提取、纯化、用序列1和序列2的引物进行PCR处理时生成约700bps片段的染色体DNA。
此外，根据本发明提供BTL的抑制方法，该方法包括将上述BTL抑制剂经口给予的步骤。
附图的简要说明
图1是显示实施例3中健康对照组回肠观察结果的显微镜照片。
图2是图1中观察的粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层浸润的说明图。
图3是显示实施例3中健康摄取组回肠观察结果的显微镜照片。
图4是图3中观察的粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层浸润的说明图。
图5是显示实施例3中健康对照组盲肠观察结果的显微镜照片。
图6是图5中观察的粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层浸润的说明图。
图7是显示实施例3中健康摄取组盲肠观察结果的显微镜照片。
图8是图7中观察的粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层浸润的说明图。
图9是显示试验例1中PCR扩增产物的电泳结果的照片。
实施发明的方式本发明的BTL抑制剂含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活菌体作为有效成分。本说明书中的“枯草芽孢杆菌活菌体”是指枯草芽孢杆菌的活芽孢和/或营养细胞。
枯草芽孢杆菌的细菌学性质记载于Bergey’s Manual of BacteriologyVol.11(1986)等中。上述活菌体可以具体地使用例如具有以下特征的菌体。
(1)革兰氏阳性(2)形成卵圆形芽孢(3)杆菌(4)游动性有
(5)好气性(6)过氧化氢酶阳性(7)50℃下生长+(8)pH 5.7下生长+(9)对枸橼酸盐的利用+(10)是否可由糖类生成酸阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖醇+(11)VP反应+(12)对淀粉的水解+(13)对硝酸盐的还原性+(14)吲哚的生成-(15)对明胶的水解+(16)对酪蛋白的水解+(17)在液体培养基上形成菌膜+(18)对牛乳的凝固-(19)对牛乳的胨化+枯草芽孢杆菌的BTL抑制作用根据菌株不同而多少有差异。作为本发明BTL抑制剂有效成分给予的枯草杆菌的菌株可以优选例如枯草芽孢杆菌C-3102。枯草芽孢杆菌C-3102于1985年12月25日保藏于通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所，保藏号FERM BP-1096。通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所更名为现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。公众可以通过现在的特许生物寄托中心利用枯草芽孢杆菌C-3102。
枯草芽孢杆菌C-3102具有下述特征使用下述序列1和序列2的PCR引物进行染色体DNA的PCR反应，则可扩增约700bps的片段。序列1和序列2的引物本来是扩增编码解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)淀粉酶的DNA而开发的引物，因此对于其他的枯草芽孢杆菌，采用该PCR引物不会发生扩增。由枯草芽孢杆菌C-3102扩增的约700bps的片段具有与淀粉酶的序列不相同的特征，可以明确地与其他的枯草芽孢杆菌区别开。
序列15’-GCCCCGCACATACGAAAAGACTGGCTGAAA-3’序列25’-GGATCCCACGTTGTGATTAAAAGCAGCGAT-3’作为培养基，上述枯草芽孢杆菌可以使用微生物培养中常用的含有碳源、氮源和无机物等的液体培养基或固体培养基进行培养。碳源只要是枯草芽孢杆菌可利用的碳源即可，可以例举葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、糖蜜等；另外氮源可以例举蛋白胨、酪蛋白水解产物、肉膏、硫酸铵等。并且，根据需要可以添加磷酸、钾、镁、钙、钠、铁和锰等的盐类，维生素类，氨基酸类，表面活性剂等。培养条件优选有氧条件，培养装置优选例如小型发酵罐等的通气搅拌液体培养装置、架式固体培养、自动制曲培养装置等，培养温度为20～50℃，特别优选30～45℃，培养时间可以为12小时～7天，培养的初始pH可以为pH 5～9，特别优选pH 6～8。
通过以上方法得到的培养物本身即可作为本发明的BTL抑制剂。另外，上述培养物的浓缩物、由上述培养物中分离的菌体或向其中添加赋形剂等添加剂制成干燥粉末、颗粒、片剂等制剂，均可作为本发明的BTL抑制剂使用。上述赋形剂并无特别限定，可以使用碳酸钙、玉米渣、玉米粉、脱脂米糠、麦麸、脱脂奶粉等。
本发明的BTL抑制剂优选含有106～1011个/g枯草芽孢杆菌活菌体，即芽孢和/或营养细胞。
本发明的BTL抑制剂的给药对象并无特别限定，可以例举牛、猪、鸡等禽畜肉用动物等动物和人等。在这些给药对象中，特别可以例举肠道内细菌的异常繁殖、宿主免疫机能低下、绒毛萎缩等解剖学上的肠道粘膜损害等有发生BTL的危险的对象。
给予本发明的BTL抑制剂的形式并无特别限定，可以是液体、粉末、颗粒、片剂等形式。特别是给药对象为人时，片剂或颗粒可以方便地给予，因而优选。另外给药途径并无特别限定，可以是经口给药等。特别是对于家畜动物，通过以粉末的形式混入饲料经口给药，很容易服用，因而优选。
本发明的BTL抑制剂的给药量以枯草芽孢杆菌活菌体计为106～1011个/天，特别优选108～1010个/天。特别是对于禽畜肉用动物，优选将制成粉末的BTL抑制剂添加到饲料中，使活菌数为103～109个/g，特别是104～107个/g。给药量为106个/天以上，则可获得充分的效果，1011个/天以下，则可以有效地地达到BTL的抑制效果。
本发明的BTL抑制剂可以增强给药对象的肠道屏障功能，抑制肠道内有害细菌对肠道膜淋巴结的侵袭，结果可以预防所谓条件性感染和多脏器功能不全、败血症等。通过对人给药，可以对人的健康做出贡献，另外，通过对禽畜肉用动物等动物给药，可以提供防止上述污染、安全的食用肉。
实施例以下通过实施例和比较例进行更详细的说明，但本发明并不受这些限定。
实施例1将18只从5周龄开始进行1周的预先饲养、使肠内菌群一致的6周龄小鼠(系统名ICR，雄性)分为对照组(10只)和摄取组(8只)2组，对对照组给予Clea Japan制造的饲料“CE-2”，对摄取组给予在饲料“CE-2”中添加了3×107CFU/g枯草芽孢杆菌C-3102(通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所保藏号FERM BP-1096)的饲料。自给药第14日起，通过对两组小鼠给予含有0.8mg/ml青霉素、2mg/ml链霉素的水作为饮用水给予抗生素。开始给予抗生素的第3天，镜检粪便，确认肠内细菌已排除，然后按照108CFU/只的量给予链霉素抗性大肠杆菌(E.coli C25；由美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)购入；保藏号PTA-1896；保藏日2000年5月19日，现在公众可得到)，之后给予只含有链霉素的水作为饮用水。自给予链霉素抗性大肠杆菌4天后，按照下述的操作处死并解剖小鼠，测定MLN和盲肠中的菌数。
盲肠中的菌数并没有很大的差别，但摄取组的MLN菌数显著减少，为对照组的49％。
表1
(菌数的测定方法)将小鼠通过颈椎脱臼处死，用70％酒精喷雾，然后切开腹部表皮，再次用70％酒精消毒腹膜，切开腹膜，取出MLN和盲肠。在该过程中，在每次改变切开部位时都要将使用的手术器具浸泡于100％酒精中，经火焰灭菌后使用。
在1ml的BHI液养基中，将取出的MLN匀浆，分别取0.2ml涂布于3个含链霉素的DHL培养基平板上，在37℃培养20小时。由出现的菌落数计算出每1个MLN的菌数。
另外，用剪刀剪取盲肠，将其放入装有玻璃球和10ml BHI液体培养基的50ml试管中，测定包括盲肠内容物的盲肠重量，然后剧烈搅拌，使内容物悬浮。用PBS(-)(商品名，株式会社ROMAN工业社制造，9.57mM)将悬浮物稀释100倍，将该操作重复3次，稀释为100万倍，将最终的稀释液分别取0.1ml，涂布于3个含链霉素的DHL培养基平板上，在37℃培养20小时。由出现的菌落数计算出盲肠内容物中的菌数。
实施例2将30只从5周龄开始进行1周的预先饲养、使肠内菌群一致的6周龄小鼠(系统名ICR，雄性)分为对照组(15只)和摄取组(15只)2组，对对照组给予Clea Jpan制造的饲料“CE-2”，对摄取组给予饲料“CE-2”中添加了3×107CFU/g枯草芽孢杆菌C-3102(通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所保藏号FERM BP-1096)的饲料。自给药第14日起，通过对两组小鼠给予含有0.8mg/ml青霉素、2mg/ml链霉素的水作为饮用水给予抗生素。开始给予抗生素的第3天，镜检粪便，确认肠内细菌已被排除，然后按照108CFU/只的量给予与实施例1所用的相同的链霉素抗性大肠杆菌，之后给予只含有链霉素的水作为饮用水。自给予链霉素抗性大肠杆菌4天后，按照与实施例1相同的操作处死并解剖小鼠，测定MLN和盲肠中的菌数。
盲肠中的菌数并没有很大的差别，但摄取组的MLN菌数显著减少，为对照组的62％，在5％显著性水准下有统计学显著性差异。
表2
*P＜0.05实施例3将39只从5周龄开始进行1周的预先饲养、使肠内菌群一致的6周龄小鼠(系统名ICR，雄性)分为BTL对照组(18只)、BTL摄取组(17只)、健康对照组(2只)和健康摄取组(2只)4组，对BTL对照组和健康对照组给予Clea Japan制造的饲料“CE-2”，对BTL摄取组和健康摄取组给予饲料“CE-2”中添加了3×107CFU/g枯草芽孢杆菌C-3102(通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所保藏号FERMBP-1096)的饲料。自给药第14日起，通过对BTL对照组和BTL摄取组小鼠给予含有0.8mg/ml青霉素、2.0mg/ml链霉素的水作为饮用水给予抗生素。开始给予抗生素的第3天，镜检粪便，确认肠内菌已排除，然后按照0.63×108CFU/只的量给予与实施例1中使用的菌相同的链霉素抗性大肠杆菌，之后给予只含有链霉素的水作为饮用水。自给予链霉素抗性大肠杆菌4天后，处死并解剖小鼠。对于健康对照组和健康组的小鼠不给予抗生素和链霉素抗性大肠杆菌，与BTL对照组和BTL摄取组同一天处死并解剖。取出回肠和盲肠，在10％体积的福尔马林缓冲液(pH 7.2)中固定。之后按照常规方法进行石蜡包埋，制成厚度为5μm的切片，进行苏木精-曙红染色和PAS染色，在光学显微镜下观察。
对于各组的回肠和盲肠的粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及对固有层的细胞浸润，以没有为0、少数为1、中等程度为2、多数为3进行打分，求出平均分数，并对BTL摄取组和BTL对照组求偏差。结果如表3所示。
表3回肠
盲肠
*5％显著性水准的显著性差异在BTL摄取组和BTL对照组两组中，强烈引发了BTL。对BTL摄取组给予了本发明的BTL抑制剂，对BTL对照组并未给予。将此作对比，则与BTL对照组相比，BTL摄取组的粘膜上皮细胞坏死、剥离脱落以及对固有层的浸润都少。对于回肠的坏死和盲肠的剥离脱落，可见5％显著性水准的显著性差异。与健康对照组相比，健康摄取组的粘膜上皮细胞的坏死、剥离脱落和对固有层的浸润也少。
另外，与BTL摄取组和对照组相比，在健康摄取组和健康对照组中多见粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层的浸润。认为这可能是由于在BTL对照组和BTL摄取组中，观察是在因抗生素的作用使肠道发生的损害处于恢复时期进行的缘故。
健康对照组和健康摄取组的回肠显微镜照片分别在图1和图3中显示，健康对照组和健康摄取组的盲肠显微镜照片分别在图5和图7中显示。图1、3、5和7中观察的粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层的浸润的位置分别在图2、4、6和8中显示。
图1～8的数字分别表示下述内容。
11嗜曙红染色的核浓缩、坏死、脱落部位12核消失、坏死、脱落部位13嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润部位31细菌32脱落的部位51细菌52坏死部位71细菌在健康对照组的回场和盲肠中，粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落明显，多见嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层的浸润(参照图1和图2以及图5和图6)。而健康摄取组的回肠和盲肠与健康对照组相比，也显示出粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层的浸润少的倾向，观察到粘膜上皮细胞表面有轮廓分明的厚糖衣(参照图3和图4以及图7和图8)。由这些结果可知，通过给予本发明的BTL抑制剂，使得肠道粘膜上皮细胞的坏死和剥离脱落减少，使细菌等对肠道组织的侵入减少，并使嗜中性粒细胞和淋巴细胞对固有层的浸润减少。
试验例1将枯草芽孢杆菌C-3102菌株、解淀粉芽孢杆菌ATCC23350菌株(模式菌株)、解淀粉芽孢杆菌IFO14141菌株、解淀粉芽孢杆菌IFO3022菌株、枯草芽孢杆菌IFO3009菌株、枯草芽孢杆菌IFO12112菌株、枯草芽孢杆菌ATCC9372菌株和枯草芽孢杆菌ATCC6051菌株(模式菌株)共8种菌株分别在10ml的TS培养基上培养过夜，收集菌体并洗净。
公众可由美国典型培养物保藏中心购入解淀粉芽孢杆菌ATCC23350菌株、枯草芽孢杆菌ATCC9372菌株和枯草芽孢杆菌ATCC6051菌株，可由财团法人发酵研究所购入解淀粉芽孢杆菌IFO14141菌株、解淀粉芽孢杆菌IFO3022菌株、枯草芽孢杆菌IFO3009菌株和枯草芽孢杆菌IFO12112菌株。
用酵母-革兰氏阳性菌用DNA制备试剂盒“GenTLE”(宝酒造制)提取并纯化培养的各个菌株的染色体DNA，得到染色体DNA溶液。提取和纯化过程除了将真空干燥后的染色体DNA沉淀用20μl的TE缓冲液溶解之外，均按照DNA制备试剂盒的使用说明书进行。
如表4所示，将得到的染色体DNA溶液与其他的试剂混合，配制PCR处理用试样。
表4染色体DNA溶液 1μl10×PCR缓冲液 5μldNTP混合液 8μl(各2.5mM)引物1 0.2μM(总量中浓度)引物2 0.2μM(总量中浓度)Taq聚合酶 0.5μl(5单位/μl)无菌水 34.5μl总量 50μl
表4中，“10×PCR缓冲液”使用宝酒造公司制造的“TaKaRaLA-PCR kit Ver2”所附带的该试剂。另外，引物1和引物2分别使用上述序列1和序列2所示的引物。这些是作为在解淀粉芽孢杆菌中扩增编码α-淀粉酶的约2KB的DNA片段而开发的、具有下述序列的DNA。
序列15’-GCCCCGCACATACGAAAAGACTGGCTGAAA-3’序列25’-GGATCCCACGTTGTGATTAAAAGCAGCGAT-3’使用宝酒造公司制造的“TaKaRa LA-PCR kit Ver2”和“TaKaRa PCRThermal Cycler PERSONAL”热循环仪，对该PCR处理用试样进行PCR处理，得到PCR扩增产物。PCR处理的温度条件如表5所示。
表594℃ 1分钟 72℃ 10分钟4℃ 反应停止取5μl得到的PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶、水平型电泳仪Mupid2(ADVANCE Co.，Ltd.)进行电泳。使用λ-DNA的HindII消化产物作为分子量标记。电泳结果如图9所示。
在图9中，上排数字(1～9)表示泳道编号。各泳道中分别电泳了下述试样。
泳道1 分子量标记(λ-DNA HindII消化产物)可见泳道1中有6条条带，迁移距离短的3条明显的条带分别是标记为23,130bp(迁移距离最短的)、9,416bp(迁移距离第二短的)和6,557bp(迁移距离第三短的)的。接下来的一条暗条带是标记为4,361bp的。从该暗带到迁移距离长、稍微明显的两条带分别标记为2,322bp(迁移距离第二长的)和2,027bp(迁移距离最长的)标记的。
泳道2来源于枯草芽孢杆菌C-3102菌株的DNA扩增产物泳道3来源于解淀粉芽孢杆菌ATCC23350菌株(模式菌株)的DNA扩增产物泳道4来源于解淀粉芽孢杆菌IFO14141菌株的DNA扩增产物泳道5来源于解淀粉芽孢杆菌IFO3022菌株的DNA扩增产物泳道6来源于枯草芽孢杆菌IFO3009菌株的DNA扩增产物泳道7来源于枯草芽孢杆菌IFO12112菌株的DNA扩增产物泳道8来源于枯草芽孢杆菌ATCC9372菌株的DNA扩增产物泳道9来源于枯草芽孢杆菌ATCC6051菌株(模式菌株)的DNA扩增产物在解淀粉芽孢杆菌的各菌株试样的电泳结果(泳道3、4、5)中，可以确认约2kb片段的扩增产物。在枯草芽孢杆菌IFO3009菌株、枯草芽孢杆菌IFO12112菌株、枯草芽孢杆菌ATCC9372菌株和枯草芽孢杆菌ATCC6051菌株试样的电泳结果(泳道6、7、8、9)中未检出扩增片段。但在枯草芽孢杆菌C-3102菌株试样的电泳结果(泳道2)中，可以确认具有其他菌株所没有的约700bp的明确的条带。
序列表<110>卡尔皮斯株式会社(Calpis Co.，Ltd.)<120>细菌易位抑制剂以及细菌易位抑制方法<160>2<210>1<211>30<212>DNA<213>Bacillus amyloliquefaciens<400>
gcccc gcaca tacga aaaga ctggc tgaaa 30<210>2<211>30<212>DNA<213>Bacillus amyloliquefaciens<400>
ggatc ccacg ttgtg attaa aagca gcgat 30
权利要求
1.一种细菌易位抑制剂，所述抑制剂含有枯草芽孢杆菌的活菌体作为有效成分。
2.权利要求1所述的细菌易位抑制剂，其特征在于所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌C-3102(生命工学工业技术研究所保藏号FERM BP-1096)。
3.权利要求2所述的细菌易位抑制剂，其特征在于所述枯草芽孢杆菌C-3102具有通过提取并纯化染色体DNA、用序列1和序列2的引物进行PCR处理而生成约700bp片段的染色体DNA。
4.一种细菌易位的抑制方法，所述抑制方法是将有效量的权利要求1～3中任一项的细菌易位抑制剂经口给予需要抑制的给药对象。
5.权利要求4所述的细菌易位抑制方法，其中所述给药对象是除了人以外的动物。
6.权利要求4所述的细菌易位抑制方法，其中所述有效量以枯草芽孢杆菌活菌体计为106～1011个/天。
全文摘要
本发明涉及含有枯草芽孢杆菌的活菌体作为有效成分的细菌易位抑制剂和包括将所述细菌易位抑制剂经口给予的细菌易位抑制方法。
文档编号C12N1/21GK1494426SQ0280597
公开日2004年5月5日 申请日期2002年3月5日 优先权日2001年3月5日
发明者丸桥敏弘, 今林宽和, 和, 丸田喜义, 义 申请人:卡尔皮斯株式会社