专利名称：通过测定PPARδ激活作用筛选物质的方法和药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过测定激活过氧化物酶体增殖物激活受体5 (peroxisome proliferator activated receptor 5 ， PPAR 5 )的作用来筛选 具有产热促进作用的物质的方法，以及含有具有产热促进作用的化合 物的药剂，该药剂具有PPAR5激活作用。另外，本发明涉及一种能 专一性地增强线粒体功能中的解偶联蛋白(UCP )导致的解偶联呼吸 或在线粒体内膜中质子泄漏(以下一般称之为质子泄漏)的药剂，线 粒体是使用脂肪酸和丙酮酸作为底物的能量代谢(呼吸)细胞内的细 胞器。另外，本发明涉及抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、以及减少内脏 积累脂肪的药剂或抑制内脏积累脂肪的药剂。
背景技术：
体内的能量代谢调节系统，包括食物摄取调节系统和能量消耗 调节系统。能量消耗调节系统参与两种类型的能量消耗，即用于基础 代谢以便维持生命的能量消耗，和其他能量消耗。在后一种情况下的 主要能量消耗是非战栗产热(nonshivering thermogenesis， nST),它 是产热的，并且，它的功能意义是在出生之后即刻、在接触寒冷期间 以及在冬眠结束时保持体温等，以及通过消耗由于吃得过多而产生的 多余能量，从而抑制肥胖和糖脂代谢疾病等。特别是在恒温的哺乳动 物和乌类中，尤其是小型动物中，nST对于保持体温来说是重要的。 在诱导nST的机制中，线粒体中的质子泄漏，即细胞呼吸链的电子 转运系统和ATP合成的参与是重要的。在褐色脂肪组织(BAT)中，在线粒体膜中存在一种被称为解 偶联蛋白(UCP1)的特殊蛋白，其分子量为32kD，并且包括大约300 个氨基酸。该蛋白具有使ATP合成与褐色脂肪细胞(BA)的呼吸链的 电子转运系统解偶联的作用。UCP1包括一种结构域的三次重复的结 构，该结构域包括约100个氨基酸，并且每个结构域具有两个跨膜部位， 一共6个部位。所迷跨膜区构成了线粒体膜上的通道。UCP1是转运质子的栽体。由UCP1和其他成分构成的质子通道具 有按照电化学梯度使质子自由穿透，以释放热量的功能。这就是nST. 就是说，nST通过经质子通道的质子渗透导致所述解偶联，并且，所迷 解偶联减弱了 ATP合成，激活了线粒体内的呼吸，从而保持ATP与 ADP的比例恒定。结果，大量脂肪和糖被氧化以产生热量.UCP1的生理学作用是在出生之后即刻、在接触寒冷期间等情况下 保持体温，并且，用转基因小鼠进行的研究，业已证实了它参与肥胖 的抑制。在各种肥胖模型中，UCP1表达减弱这一亊实，表明了UCP1 与肥胖发生、发展和持续的相关性。例如，业已证实，在BAT减少的 转基因小鼠中，在没有过量进食的情况下出现了肥胖(Lowell等，Nature, 366, 740-742(1993))。另外，在小鼠中观察到了身体脂肪的减少，和 对由于高脂肪食物所导致的饮食诱导的肥胖的抗性，其中通过将UCP1 基因插入脂肪专一性基因aP2的启动子，强制所述小鼠表达大量的 UCP1 (Kopecky等，J. Clin Invest, 96, 2914-2923 ( 1995)),另夕卜， 在UCP1表达被抑制到1/3的小鼠体内，观察到了在暴露于寒冷的环境 时体温保持功能的减弱、由于身体脂肪的增加而导致的肥胖和胰岛素 抗性(Lowell B.B.等,Nature, 366, 740-742(1993))。另外，UCP1剔除 小鼠是不耐寒的(EnerbackS.等,Nature, 387, 90-94 ( 1997))。如 上文所述，通过动物实验业已了解到UCP1作为产热分子在体温调节和 能量消耗方面具有重要作用，并且与肥胖密切相关。UCP1表达的数量，主要是由核内基因转录水平调控的，而UCP1 基因表达随cAMP浓度的提高而加强(斋藤等，最新医学，52， 1095-1096 ( 1997))。大约20-40%的细胞内能量消耗被认为是通过线粒体内膜上的质 子泄漏而产生的。另外，在具有很少BAT的成年人和其他动物中，大 部分nST被认为是在骨骼肌和白色脂肪組织(WAT)中产生的.基于 上述事实， 一直认为UCP存在于除了 BAT以外的组织中.有两个研究 小组在1997年连续报导了来自除了 BAT以外的组织的UCP2的cDNA 克隆(Fleury等，Nature Genet, 15， 269-272(1997); Gimeno等，Diabetes 46， 900-906 ( 1997))。4人UCP2表现出与人UCP1的59%的同源性，并且像UCP1那样 形成了具有6个跨膜区的通道，并且它具有嘌呤核苷酸结合位点。UCP2 与UCP1的不同之处在于，它是在系统组织中广泛表达的，在肺和胰腺 中是以特别高的浓度表达的，并且在心脏、肝脏、大脑、肾脏、睾丸、 WAT、 BAT和骨骼肌中也检测到了表达。至于UCP2功能，在食用高脂肪饮食的小鼠体内，观察到在附睾 周围的脂肪组织中UCP2基因表达的上调，不过，据报导，UCP2剔除 小鼠在寒冷条件下，在体温保持功能方面是正常的(Arsenijevic D.等， NatureGenet, 26, 387-388 ( 2000))。另外，在上述UCP1剔除小鼠 中观察到了褐色脂肪组织中UCP2的表达得到充分上调，这种现象被认 为是代偿作用，并且所述小鼠不耐寒(Enerback， F.等，Nature, 387, 90-94(1997))。另外，业已证实UCP2能通过改变胰腺P细胞中细胞内 A丁P浓度，抑制胰岛素分泌(ZhangC-Y.等，Cell, 105, 745-755( 2001 ))。 对于糖尿病治疗来说，这是一种不利的特征.如上文所述，对于UCP2 来说，到目前为止，与能量消耗/肥胖的关系尚未搞清楚，尽管业已证 实了其质子通道的解偶联功能.体内的多余能量，最初主要是作为内脏脂肪积累的(特别是作为 肠系膜脂肪)。与其他部位的脂肪(特别是皮下脂肪)相比，内脏脂 肪容易受到脂肪动员(adipokinetic)作用，快速地分解和消耗。内脏脂肪 (肥胖)被认为是导致与生活方式相关的疾病(成年人疾病)的多重 危险因素。其原因是从WAT中的白色脂肪细胞(WA)中分泌的脂肪 酸通过门静脉直接流入肝脏，促进了胰岛素耐受性和脂肪合成，其结 果是，诱导了糖耐受性异常、高血压和高血脂，并且，这些疾病最终 并发导致动脉硬化。因此，预计抑制内脏脂肪的积累和减少内脏脂肪 的积累，能有效预防与生活方式相关的疾病(如成年人的糖尿病)的 发生，并且治疗所述疾病.过氣化物酶体增殖物激活的受体(PPAR)在它的结构等方面被认 为是核受体(核激素受体)超家族的一员.到目前为止，业已鉴定了 三种类型的PPAR亚型，这三种亚型是PPARot， PPAR5 (又称为 NUC-1、 PPAR0或FAAR)和PPARy，并且业已克隆了它们的基因 (cDNA) (Lemberger等，Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.， 12, 335-363(1996))。据报导，贝特(fibrate)药剂对三种类型PPAR中的PPARoc具有 配体作用，在临床上表现出对血清甘油三酯含量的很强的降低作用 (Forman等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 94， 4312-4317 ( 1997)),PPARv主要是在脂肪组织中表达的，并且据报导，PPARy是与 调控脂肪细胞分化密切相关的因子(Tontonoz等，Genes and Development, 8， 1224-1234( 1994);和Tontonoz等，Cell, 79, U47-1156 (1994))。各种类型的逸唑烷二酮衍生物，在非胰島素依赖型糖尿 病(NIDDM)的动物模型中表现出降血糖作用，并且预期可以作为 NIDDM的新型治疗剂，它具有胰岛素抗性解除作用.最近的研究证实 了漆唑烷二酮衍生物还具有作为PPARy的配体的作用，并且能专一性 地激活PPAR y ( Lehman等，J. Biol. Chem.， 270， 12953-12956(簡))。不过，尚未搞清楚PPAR5的生理学功能(Willson等，J. Med. Chem., 43 (4) ， 527-550 (2000) ) 。 W097/28149披露了一种具有 血液HDL提高作用的PPAR6配体，而WO99/04815披露了施用PPAR 5受体激活物质能够降低胆甾醇含量。不过，没有说明或暗示PPAR5 和产热促进作用与PPAR5和解偶联蛋白之间的相关性.另外，已知诸如花生四烯酸、卡巴前列环素(carbaprostacyclin, cPGI) 、 L-165041 (4- (3- ( 2-丙基-3-羟基-4-乙酰-苯氣基)丙氧基)-苯氣基乙酸)的不饱和脂肪酸，能增强UCP2的表达(The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, No.M， Issue of April 6, pp.10853-10860, 2001 )。不过，没有有关UCP1和PPAR5之间的相关性的报导。发明内容本发明的目的是提供一种筛选具有产热促进作用的物质的方法， 以及含有所迷物质作为有效成分的药刑。本发明的进一步的目的是提 供一种抗糖尿病药剂，抗肥胖药刑和用于减少内脏脂肪积累或抑制内 脏脂肪积累的药剂。本发明的发明人关注的是由nST对体内能量消耗调节系统的刺激 而产生的产热促进作用，他们试图促进线粒体的解偶联呼吸，促进BAT 线粒体中的质子泄漏(相对nST组织而言是比较小的)，促进WAT线粒体中的质子泄漏，并且促进UCP1 (解偶联蛋白的同系物)的功能，由此提高它们的效率，本发明的发明人为了解决上迷问题进行了深入的研究，发现卡巴前列环素(cPGI: 6，9 0(-亚甲基-110(，155-二羟基^ )31汰-5￡，136-二烯-1-酸)和伊洛前列素(Iloprost， 5- ((E)-(lS，5S，6R,7R)-7-羟基-6-[(E). 。S，4RS);羟基-4-甲基-5-辛-6-烯]-双环[3.3.0]-3-亚辛基)戊酸)(它们 是非专一性PPAR配体)，在骨骼肌细胞或脂肪细胞中具有UCP1表达促进作用。这一新的发现与以下发现組合在一起贝特化合物和Wyl4643(它 们是PPARa的配体)，以及逸唑烷二酮化合物(它们是PPARy的配 体)，几乎不表现UCP1表达促进作用。根据这一组合发现，本发明人 推测PPAR 5主要参与UCP1表达促进作用，并且他们还对具有PPAR 5激活作用的化合物做了进一步的研究。结果，通过使用人类或啮齿类动物的骨骼肌细胞或脂肪细胞进行 的实验，他们发现具有PPAR5激活作用的物质表现出UCP1表达促进 作用。另外，基于UCP基因的表达是由PPAR5调控这一事实，本发明 的发明人证实了可以通过测定PPAR 5激活作用，筛选具有产热促进作 用的物质，它能增强UCP1基因的表达并且促进nST功能，因此，本发明包括以下主题(1 )筛选具有产热促进作用的物质的方法，其特征在于测定PPAR5激活作用。(2) 筛选具有促进线粒体的解偶联呼吸作用的物质的方法，其特 征在于测定PPAR 5激活作用。(3) 筛选具有促进线粒体内膜质子泄漏作用的物质的方法，其特 征在于测定PPAR 5激活作用。(4) 筛选能增加UCP1在含有线粒体的细胞中的表达量的物质的 方法，其特征在于测定PPAR5激活作用。(5) 筛选能促进脂肪酸0氧化作用的物质的方法，其特征在于测 定PPAR5激活作用。(6) 如上迷(1 ) - (5)中任一项的筛选物质的方法，该方法利用了报导基因。(7) 如第(6)项中的筛选具有产热促进作用的物质的方法，该 方法包括下面①-③的步骤① 让具有PPAR5激活作用的物质与能表达UCP1基因的细胞接 触和/或导入所述细胞，② 测定UCP1基因在所述细胞中的表达量，和③ 筛选能提高所述UCP1基因在所述细胞中的表达量的化合物。(8) 如第(7)项中的筛选方法，其中能表达UCP1基因的细胞 是脂肪细胞或骨駱肌细胞.(9) 如第(7)项中的筛选方法，其中能表达UCP1基因的细胞 是脂肪细胞。(10) 具有产热促进作用的药剂，其含有具有PPAR5激活作用的 物质作为有效成分。(11 )促进线粒体的解偶联呼吸的药剂，其含有具有PPAR5激活 作用的物质作为有效成分.(12) 促进线粒体内膜中的质子泄漏的药剂，其含有具有PPAR 5激活作用的物质作为有效成分。(13) 提高UCP1在含有线粒体的细胞中的表达量的药剂，其含 有具有PPAR 5激活作用的物质作为有效成分。(14) 促进脂肪酸P氧化的药剂，其含有具有PPAR5激活作用的 物质作为有效成分。(15) 如上述(10) - ( 14)中任一项的药剂，其中具有PPAR5 激活作用的物质是非专一性PPAR配体或PPAR5配体.(16) 如上述(10) - ( 14)中任一项的药剂，其中具有PPAR5 激活作用的物质是卡巴前列环素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙酰基-3-羟基 -2-丙基笨氧基)-丙氧基)笨乙酸。(17) 如(11 ) - ( 13)中任一项的药剂，其中线粒体存在于骨骼 肌，白色脂肪组织或褐色脂肪组织的细胞中.(18) 如(11) - (13)中任一项的药剂，其中线粒体存在于白色 脂肪组织或褐色脂肪组织的细胞中，(19) 抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、减少内脏积累脂肪的药剂或抑制内脏积累脂肪的药剂，其含有具有PPAR 5激活作用的物质作为有效成分。(20)抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、减少内脏积累脂肪的药剂或 抑制内脏积累脂肪的药剂，其含有如(10) - (18)中任一项的药剂作为有效成分。附图简述
图1表示通过PPAR5配体之外的各种类型的测试化合物在人类脂 肪细胞中诱导的UCP1 mRNA表达量.图2表示通过PPAR 5配体或各种类型的测试化合物在人类脂肪细 胞中诱导的UCP2 mRNA表达量。图3表示通过PPAR 5配体或各种类型的测试化合物在人类脂肪细 胞中导致的游离脂肪酸&氧化作用的促进程度。实施本发明的方式本发明的具有能专一性地增强nST组织的线粒体中质子泄漏等作 用的药剂，包括具有PPAR5激活作用的化合物或其衍生物作为有效成 分。本发明的所述药剂可以是上迷有效成分本身或者是含有所述成分 的合适的配合物、组合物或混合物。另外，具有PPAR5激活作用的化 合物，表示能通过像"PPAR配体"那样与PPAR结合，调控PPAR的 靶基因的转录激活功能的化合物.所迷化合物不局限于天然存在的化 合物，而且还包括人工合成的化合物。为了说明上述有效成分的作用，通过向实施例中所示的各种类型的 骨骼肌细胞或脂肪细胞中添加各种类型的PPAR配体，测定UCP1的 mRNA的数量。结果，证实了与测定的PPARoc和PPARy配体相比， PPAR5配体表现出UCP1的mRNA的明显更大数量的表达，PPAR5 配体的例子包括p-(3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基笨氣基)-丙氣基)笨乙酸 (YM-16638 )，该配体作为具有例如降血液胆甾醇活性作用的化合物 披露于WO9904815中。可以使用报导基因，通过一种简单方法，以很高的灵敏度确定一种 物质的PPAR结合程度和/或激活程度。例如，以下方法是已知的使用融合蛋白表达栽体的方法，该栽体是通过将酵母转录因子GAL4的 DNA结合结构域与PPAR的配体结合结构域融合而荻得的，以及使用 一种动物细胞的方法，其中，业已转导了含有与GAL4响应序列(GAL4 结合元件)连接的报导基因的报导质粒(W096/33724;Lehmann等，J, Bio.Chem., 270， 12953-12956( 1995 );和Willson等，J. Med. Chem.， 39， 665-668 (W96))。使用报导基因的方法是按以下方式实施的 首先，当测试化合物是诸如能结合或激活PPAR的物质时，该测试化合 物与GAL4的PPAR的配体结合结构域结合。于是，与PPAR的配体结 合结构域融合的GAL4的DNA结合结构域与报导质粒的GAL4响应因 子结合，以便启动所述报导基因的表达.通过测定由所述报导基因表 达的蛋白的活性等，就是说通过检测所述报导物活性，可以确定所迷 测试化合物是PPAR结合化合物或PPAR激活化合物，或者不是。因此，在篩选能结合PPAR的未知配体时，或在确定一种测试化合 物是否是PPAR结合配体的检验中，检测和分离天然或人工合成的配体 是可行的。另外，报导物活性的检测可以根据本领域的技术，通过根 据报导基因的类型，从染色、焚光、细胞活性中选择的指标适当地完 成。另外，在本发明的筛选方法中，在上迷系统中选择性地增加以下步 骤，以便检测报导物活性(a)让一种测试样品与UCP1基因表达细 胞接触或导入该细胞，(b)测定UCP1基因在所述细胞中的表达量， 和(c)筛选能增加UCP1基因在所迷细胞中的表达量的化合物，被用于筛选的"UCP1基因表达细胞"没有特别限制，优选的是诸 如白色脂肪细胞或褐色脂肪细胞的脂肪细胞或骨骼肌细胞，所述细胞 可以是从动物组织中分离的原代培养细胞，或通过细胞的癌化或不死 化制备的建立细胞系。作为脂肪细胞，例如，各种类型的脂肪细胞， 如披露于以下实施例中的人类白色脂肪细胞、大鼠褐色脂肪细胞、 3T3-L1 (小鼠脂肪细胞)可以优选使用，而作为骨骼肌细胞，例如， 各种类型的骨骼肌细胞，如SkMC (人骨骼肌细胞)和C2C12 (小鼠骨 骼肌细胞)可以优选使用。另外，UCP家族(解偶联蛋白同系物)基 因的例子包括UCP1基因、UCP2基因、UCP3基因、UCP4基因.在本发明筛选方法的一个步骤中，让测试样品与能表达UCP1基因的细胞接触和/或导入该细胞，并且测定UCP1基因的表达量。为了测定所述基因的表达量，可以使用本领域技术人员所熟知的各种类型的方法。所迷基因表达的测定可以通过测定DNA、 RNA或蛋白的量实现， 例^口， 通过Northern印迹方法(Sambrook等，Molecular Cloning, 20N206, ( 1987), Cold Spring Harbor Laboratory )， RT-PCR方法(Shaffer 等，Anal. Biochem., 190, 292-296 ( 1990))等，当通过所述测定检测到UCP1基因表达的显著增强时，所迷测试样 品的化合物就被认为具有促进nST功能的作用。UCP1的表达是在nST 组织的细胞中的线粒体中燃烧脂肪或糖所必需的。不过，本发明的有 效成分，具有显著提高UCP1在上述组织的细胞中的表达量的作用。通 过以上分子水平上的发现可以了解，本发明的药剂能有效抑制内脏脂 肪积累和减少内脏脂肪积累.实际上，在实施例中，为了证实UCP(其表达是由PPAR5促进的) 能够发挥抑制或减少内脏脂肪积累的作用，就是说加速细胞内死亡和 糖类的燃烧，将各种类型的PPAR配体添加到所述原代人脂肪细胞中， 并且测定脂肪酸P氧化作用(已知这种氧化作用是脂肪酸燃烧促进作用 的指标)。正如在实施例中具体示出的，对脂肪酸P氣化作用的促进， 与UCP表达量成正比。在PPAR5配体中，对脂肪酸P氧化作用的促 进最强。本发明的药剂具有提高内膜穿透型蛋白UCP1在诸如骨骼肌和脂 肪的非战栗产热组织细胞的线粒体中的表达量的作用，它与nST相关， 特别是与促进上述细胞的线粒体中的解偶联呼吸、质子泄漏和产热相为有效成分,;且它具有高度表达ucpi的作用，其中:，所述作用大大提高了 UCP1在诸如上述脂肪和骨骼肌的nST组织中的细胞表达量。 可以根据UCP1表达活性鉴定、分离和纯化本发明的药剂。通过作为有 效成分化合由此获得的物质，可以制备用于降低内脏脂肪积累量或用 于抑制内脏脂肪积累的、特别是对抗肥胖具有显著作用的药刑。本发明的药剂可用于和治疗肥胖，特别是治疗哺乳动物(例如人 类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、猫、马、兔子等)或禽类的肥胖， 因为它能促进能量代谢和脂肪代谢，并且降低血脂，另外，它还可用于预防或治疗与肥胖并发的疾病(例如，成年人疾病，如糖尿病、高 血压、高血脂、动脉硬化或缺血性心脏病)等.作为所述降低药剂或抑制药剂的栽体，可以根据使用模式使用合适 的填充刑、结合剂、增量剂、崩解刑、表面活性剂、防湿剂、赋形刑、 稀释剂等。药剂的形状可以根据使用目的适当地确定，并且没有特殊 限制。所述药剂的例子包括固体药剂(如片剂、颗粒、粉末、丸剂和 胶囊)，液体药剂，悬浮剂、乳剂等。通过这种方式获得的抗糖尿病 药剂，抗肥胖药剂，减少内脏积累脂肪的药剂或抑制内脏积累脂肪的 药剂，优选是通过口服施用的。所迷刑量是根据要治疗的患者的症状 等适当确定的。因此，每天服用的剂量和次数等没有特殊限制。实施例下面将结合实施例对本发明作进一步的详细说明，不过，本发明并 不局限于这些实施例。在以下实施例中，每一种搮作都是按照披露于"Molecular Cloning"中的方法进行的(Sambrook，丄，Fritsch， E.F, 和Maniatis, T， Cold Spring Harbor Laboratory Press )，除非另有说明.[实施例1]药剂对诱导UCP1和UCP2 mRNA在人类白色脂肪细 胞中表达的影响(1)人类白色脂肪细胞的培养和RNA的制备人类脂肪细胞，来自皮下脂肪组织的未分化的冷冻原脂肪细胞 (Cat. No. SP-F， Lot. No. L011399)是从美国ZenBio公司购买的。按 照生产商的说明，在24孔平板上培养所述细胞，并且分化成脂肪细胞. 将所培养的细胞用作人类白色脂肪组织衍生的脂肪细胞。具体地讲， 通过使用24孔平板在二氧化碳培养箱中，在37'C下在原脂肪细胞培养 基中培养所述原脂肪细胞，直到达到铺满状态.然后，将所述培养基 更换成分化培养基，并且再继续培养72小时，以便诱导分化。另外， 将所述培养基更换成脂肪细胞培养基，并且进行14天培养，以便获得 完全分化的白色脂肪细胞.在以下条件下，对所述培养细胞进行进一 步的培养。将各种类型的测试化合物分别添加到培养基中，使它的最终浓度为lOpM,并且将所述细胞培养6小时(n-3).所述测试化合物是PPAR (X配体必降脂(Bezafibrate)、 WY14643、 PPAR5配体YM-16638、 PPAR Y配体曲格列酮(Troglitazone)、罗格列酮(Rosiglitazone)、非专 一 性 PPAR配体cPGI、伊洛前列素、肾上腺素能受体激动剂L755507. 通过添加DMSO制备对照，它是所述测试化合物的溶刑，使它的最终 浓度为0.5%,并且以与测试化合物相同的方式用它进行培养。对于每 一种测试化合物或对照来说，回收培养的细胞，将它们悬浮在150微升 的细胞裂解緩沖液(RLT溶液，由QIAGEN公司生产)中，然后裂解 细胞，以便获得细胞提取物。通过使用RNA制备试剂盒(商品名RNeasy 总RNA试剂盒，由QIAGEN公司生产)按照该试剂盒所附带的说明书， 从所述细胞提取物中制备总RNA。(2 ) UCP1 mRNA表达量的测定通过使用上面所获得的总RNA (大约0.1微克)作模板，按下文 所述方法进行实时聚合酶链式反应(RT-PCR)，以便测定UCPl mRNA表达量。作为人UCP1基因的PCR引物，使用了两种类型的寡核苷酸 5'-AACCCACAGAGGTCGTGAAAG-3，(正向引物)和 5，-CGTGTAGCGAGGTTTGATTCC-3，(反向引物) 作为PCR探针，使 用了 5，-CAGACTTCAAGCATAGAGCCATCTCCA-3，，所述探针是用一 种荧光染料FAM标记过的。另外，G3PDH mRNA的测定是按照PE Applied Biosystems推荐的方法进行的，该测定是与2-Reporter Assay同 时进行的。所述引物是由Amersham-Pharmacia Biotech公司化学合成 的，而所述探针是由PE Applied Biosystems公司化学合成的(包括用所 述荧光染料标记)。通过使用待测定的制备的总RNA，上面所提到的引物和探针，以 及通过商业渠道获得的实时检测PCR试剂盒(TaqMan EZ RT-PCR Core Reagent Kit (商品名),由PE Applied Biosystems公司生产)制备表1 所示的反应溶液，表中所示出的用量相应于一个反应试管.[表l〗成分终浓度模板RNA5 x丁aqManEZ緩沖液A1 x10 mM dATP300pM10 mM dGTP300^M10 mM dCTP300pM10 mM dTTP300^M10岸UCP1正向引物200nM10pM UCP1反向引物200nM5pM UCP1探针lOOnMIO)liM G3PDH正向引物40nM10, G3PDH反向引物40nMl(VM G3PDH探针lOOnMr丁th DNA聚合酶(2.5U/nl)O.卿lAMP Erase UNG(,l)0.01，25mM Mn(OAc)23mM将25微升如上制备的反应溶液》欠入PCR Perkin Elmer Microamp Optical Tuber (商品名，由PE Applied Biosystems公司生产)中，并且 用 一个盖子密封所述试管。将该试管放在ABI PRISM 7700序列检测系 统(商品名，由PE Applied Biosystems公司生产)，并且在以下条件下进行反应。在50'C下用50分钟时间由UNG分解DNA污染物，在60'C下进 行逆转录处理10分钟，并且在95'C下加热2分钟使UNG失活。在随 后的PCR反应中，在95'C下进行15秒钟的变性处理，并且在58'C下 进行90秒钟的退火处理(循环次数40循环)。在该反应开始之后， 通过实时处理自动确定荧光强度，以便测定UCP1 mRNA表达量。UCPl mRNA表达量是通过一种相对值表示的，该相对值是通过将被用作空 白对照的参考样品中的量设定为100，并且通过G3PDHmRNA表达量 对所述值进行校正而计算的.14结杲如图1所示。PPAR5配体(具有激活PPAR5的作用的化合 物)YM-16638能够将UCP1 mRNA表达量提高到对照表达量的大约12 倍 这表明，PPAR5配体能有效促进所迷表达。由于该实验证实了 PPAR 5配体能专一性地增强UCP1基因，很显然，PPAR 5配体对WAT 的功能的促进作用，是由于PPAR5配体对WAT的直接作用.UCP1 表达的显著加强不仅出现在啮齿类动物，而且还出现在人类的白色脂 肪细胞中这一事实表明，PPAR5配体对于人类糖尿病和肥胖来说是极其有效的。(3 ) UCP2 mRNA表达量的测定通过使用在上面的第(1)项获得的总RNA(大约0.1微克)作模 板，通过与上述第(2)项相同的实时聚合酶链式反应，测定UCP2 mRNA 表达量。作为人类UCP2基因的PCR引物，使用了两种类型的寡核苷 酸5,-CGCCAAATGAGCTTTGCCT-3，(正向引物)和 5，-GCCCTTGGTGTAGAACTGTTTGA-3，(反向引物)。作为PCR探针， 使用了 5 ， -TGTCCGCATCGGCCTGTATGATTC-3 ，.所述探针用 一种焚 光染料FAM标记。结果如图2所示。PPAR5配体(具有激活PPAR5的作用的化合 物)YM-16638能够将UCP2 mRNA表达量提高到对照表达量的大约2 倍。[实施例2]药剂对人类白色脂肪细胞中游离脂肪酸P氧化的影响 按与实施例1相同的方法制备人类完全分化的白色脂肪细胞，然 后除去上清液，添加500微升培养基，该培养基是通过向脂肪细胞培养 基中添加适量的油酸和棕榈酸，使它们的浓度分别为0.67mM和 0.33mM而制备的。将各种类型的测试化合物添加到所述培养基中，使 它们的最终浓度为10yM,然后向每一个孔中添加[9,10(n)JH]棕榈酸 (由Amersham Phamacia公司生产)，最终浓度为1 p Ci/毫升)，并且， 在37'C下培养所述细胞48小时。所述测试化合物是PPAR5配体的 YM-16638, PPARoc配体的WY14643， 肾上腺素能受体激动刑的 L755507和PPAR y配体的Rosiglitazone.通过添加DMSO制备对照， DMSO是所述测试化合物的溶剂，使它的最终浓度为0.5%,并且以与测试化合物相同的方式培养.为了防止在培养期间由于细胞对[W0(n)JH]棕榈酸的p氧化所产生的3H20的蒸发，用由住友Bakelite 公司生产的微型培养滤膜(MS-30055 )对培养平板进行密封.在培养"小时之后，将培养基的200微升上清液转移到一个1.5 毫升的Eppendorf管中，添加50微升50%的三氯乙酸，并且将该试管 放在冰上保持30分钟，以便产生沉淀，并且以15000rpm的速度离心 该混合物IO分钟。然后，将没有盖子的1.5毫升Eppendorf管放入亊先 在它里面放入了 500微升蒸馏水的20毫升的玻璃瓶中，将上面所荻得 的上清液的总量放入该Eppendorf管，并且用聚丙烯封装盖紧密密封所 述玻璃瓶。在5(tc下对所述玻璃瓶进行加热18小时，以便所述玻璃瓶 内部被^20饱和，在4'c下对所迷玻璃瓶进行冷却之后，再进行离心 (1000rpm， 1分钟)。丢弃瓶中Eppendorf管中残留的上清和Eppendorf 管。向留在所述玻璃瓶中的含有^20的蒸馏水中添加5毫升液体闪烁 混合物(Ultima Gold,由Packard公司生产)，并且在充分混合之后测 定放射性。结果如图3所示。10nM的PPAR5配体YM16638将所述细胞的 P氧化作用提高了 30°/。。另 一方面，10 m m的PPAR y配体Rosiglitazone 具有15%的增强作用，而10 )j M的PPARot配体WY14643和10 p M的 0 3肾上腺素能受体激动剂L755507的P氧化，没有表现出增强作用. 以上结果表现出与在实施例1中观察到的各种类型的PPAR配体对 ucp1 mRNA表达的促进作用的良好的相关性，就是说，PPAR5配体 通过促进ucp1基因表达提高了 ucp1蛋白的数量，以便增强用游离脂 肪酸作底物的e氧化。所述P氧化作用是ucp1的功能之一。这表明 ppar5配体能促进能量代谢，并且抑制或减少内脏脂肪积累.以上结 果表明PPAR5配体能有效抗人类糖尿病和肥胖.产业上利用的可能性本发明获得了一种具有产热促进作用等的物质，并且荻得了诸如 抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、减少内脏积累脂肪的药剂或抑制内脏积 累脂肪的药剂的含有所述物质的药刑.序列表<110>TEIJIN LIMITED YAMAOKA Kazuyoshi TAKAGI Kenichiro KATAOKA Kenichiro YAMAMOTO Masanori CHIKANISHI Toshihiro<120>通过测定PPAR S激活作用筛选物质的方法和药剂<130> T-456<150> JP P2001-216502 <151> 2001-7-17<160>6<210> 1 <211>21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP1基因PCR的正向引物 <400> 1aacccacaga ggtcgtgaaa g 21<210> 2 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP1基因PCR的反向引物<400> 2cgtgtagcga ggtttgattc c 21<210> 3 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP1基因PCR的探针 <400> 3cagacttcaa gcatagagcc atctcca 27<210>4 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP2基因PCR的正向引物 <400> 4cgccaaatga gctttgcct 19<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP2基因PCR的反向引物 <400> 5gcccttggtg tagaactgtt tga 23<210>6 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP2基因PCR的探针 <400> 6tgtccgcatc ggcctgtatg attc 2权利要求
1.具有产热促进作用的药剂，其含有具有PPARδ激活作用的物质作为有效成分。
2. 促进线粒体的解偶联呼吸的药剂，其含有具有PPAR5激活作 用的物质作为有效成分。
3. 促进线粒体内膜中的质子泄漏的药剂，其含有具有PPAR5激 活作用的物质作为有效成分。
4. 提高UCP1在含有线粒体的细胞中的表达量的药剂，其含有具 有PPAR5激活作用的物质作为有效成分。
5. 能促进脂肪酸0氧化的药剂，其含有具有PPAR5激活作用的 物质作为有效成分。
6. 权利要求1-5中任一项的药剂，其中具有PPAR5激活作用的 物质是非专一性PPAR配体或PPAR5配体。
7. 权利要求1-5中任一项的药剂，其中具有PPAR5激活作用的 物质是卡巴前列环素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基苯 氧基)-丙氧基)苯乙酸。
8. 权利要求2-4中任一项的药剂，其中线粒体存在于骨骼肌、白 色脂肪组织或褐色脂肪组织的细胞中。
9. 权利要求2-4中任一项的药剂，其中线粒体存在于白色脂肪組 织或褐色脂肪组织的细胞中。
10. 抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、减少内脏积累脂肪的药剂或 抑制内脏积累脂肪的药剂，其含有具有PPAR5激活作用的物质作为 有效成分。
11. 抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂、减少内脏积累脂肪的药剂或 抑制内脏积累脂肪的药剂，其含有权利要求1-9中任一项的药剂作为. 有效成分。
全文摘要
本发明提供了一种筛选包含具有PPARδ激活作用的化合物的产热促进物质；含有所述化合物的药物；以及具有抗糖尿病、抗肥胖或减少内脏积累脂肪作用的药物。本发明提供一种药剂，其包含具有激活过氧化物酶体增殖物激活的受体PPARδ的作用的化合物，并且具有促进非战栗产热(nST)，特别是促进在脂肪组织等的细胞中的线粒体解偶联呼吸或线粒体内膜中的质子泄漏，和提高UCP1表达量的作用；本发明也提供含有上述化合物的抗糖尿病药剂、抗肥胖药剂和减少内脏积累脂肪的药剂。另外，本发明还提供了通过测定PPARδ激活作用筛选化合物的方法。
文档编号G01N33/68GK101259276SQ200810090910
公开日2008年9月10日 申请日期2002年7月17日 优先权日2001年7月17日
发明者山冈一良, 山本真则, 片冈健一郎, 近西俊洋, 高木健一郎 申请人:帝人株式会社