专利名称：：磺胺甲噁唑单克隆抗体试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明涉及兽药残留检测分析
技术领域：
中一种检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒及检测方法。
背景技术：
：磺胺甲噁唑是应用广泛的磺胺类抗生素之一，它有效地控制了动物疾病，促进动物生长，在降低动物源性病原菌排放改进公共卫生方面，发挥了及其重要的作用，取得了良好的经济效益和社会效益；但长期和大剂量使用，使得磺胺药在体内蓄积，造成药物在人体和动物组织内残留，从而潜在危害人体健康。人体中磺胺药的蓄积会导致磺胺药抗药性的产生，且具有潜在的致癌、致突变性。因此，联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定，食品和饲料中磺胺甲噁唑等磺胺类物质单个含量均不得超过100ng/kg。检测磺胺甲噁唑残留量的方法主要有微生物法、仪器检测法、免疫化学法。其中仪器检测法包括荧光光度法、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GM)、气-质联机法(GC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联机法(HPLC/MS)、毛细管电泳法(CE)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛査。发明创造内容本发明的目的是提供一种检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测磺胺甲噁唑的单克隆抗体试剂盒，包括磺胺甲噁唑特异性单抗、包被的磺胺甲噁唑与载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中，所述磺胺甲噁唑特异性抗体为磺胺甲噁唑单克隆抗体，为优选的磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体，该单抗按常规方法制备；所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白，所述磺胺甲噁唑与载体蛋白的偶联物可通过将磺胺甲噁唑和载体蛋白用戊二醒法或重氮化法进行偶联得到；所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸钠法交联在二抗上；所述二抗优选为抗鼠或抗兔抗抗体。为了更为方便现场监控和大量样本筛查，上述试剂盒还包括磺胺甲噁唑标准溶液、显色剂、显色稀释液、浓縮洗涤液、终止液。所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢，所述B液为四甲基联苯胺(TMB)，所述显色稀释液为醋酸钠溶液；所述浓縮洗涤液为0.05%-1.2%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述终止液为l-2mol/L的硫酸溶液。本发明的检测原理为将磺胺甲噁唑与载体蛋白的偶联物做为包被原吸附于固相载体上，加入样品和磺胺甲噁唑单克隆抗体，加入酶标二抗，显色后终止，测样品吸光值，该值与样品中磺胺甲噁唑残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出磺胺甲噁唑的含量，根据酶标板上样品颜色的深浅能得出大致浓度范围。本发明的检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织、血清、尿样、牛奶及饲料等样品中磺胺甲噁唑的残留量；对样品前处理要求低、样品前处理过程简单、能同时快速检测大批样品；采用高特异性的磺胺甲噁唑单克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，检测方法简便易行；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在食品和词料磺胺甲噁唑残留量的检测中发挥重要作用。图1为检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒的结构示意图图2为磺胺甲噁唑标准曲线具体实施方式实施例1抗原及抗体的制备1.磺胺甲噁唑-载体蛋白偶联物的制备(1)参照1999年FmakeM,etal.报道的方法合成SMZ-HSA全抗原，具体步骤如下首先取20mgSMZ加到300nl二甲基甲酰胺溶液中，再缓慢加到lml0.5mol/LH2SO4中，然后在磁力搅拌下将lmllmol/LNaN02缓慢加到SMZ溶液中，反应10min，形成重氮盐。(2)磁力搅拌下，分别取100mgHSA和100mgOVA各加到4ml磷酸盐缓冲液中。(3)将上述形成的重氮化盐溶液在磁力搅拌下缓慢加到HSA溶液和OVA溶液中,用1MNaOH将pH维持在8-10，4。C反应lh;(4)将反应液放在生理盐水中透析3d，每天更换2次生理盐水，以除去未反应的小分子物质及SMZ等。(5)将橙色的SMZ-HSA和SMZ-OVA溶液分成两部分，一部分于4'C下保存供紫外和液相测试用，另一部分于-20。C下保存。2.抗磺胺甲噁唑单克隆抗体的制备(1)免疫利用申请人所制备的磺胺甲噁唑-人血清白蛋白(HSA)偶联物免疫Balb/C小鼠(购自中国军事科学院实验动物中心)，免试程序是选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠4只，体重18-22g，取免疫抗原100mg(以蛋白含量计算)，加等体积完全弗氏佐剂乳化，用注射器在安培瓶中反复抽吸搅拌，直至乳化药液在水中呈不溶液滴(水包油状态)。于Balb/C小鼠颈背部皮下多点注射进行一免，每只小鼠0.5ml;间隔两周后，抗原量减半用弗氏不完全佐剂混合，方法同上，进行第二次免疫，再过两周后，进行第三次免疫，方法同前次。三免后10d免疫鼠尾静脉采血，通过间接ELISA方法测定免疫鼠血清抗体效价。选择抗体效价较高者用于细胞融合，融合前二天给小鼠脾内注射含30吗免疫抗原水剂进行加强免疫。(2)单抗制备免疫鼠眼眶取血后，脊椎脱臼处死，消毒后置于超净工作台上的消毒表面皿中，小心取出经免疫已肿大的脾脏，用DMEM培养基冲洗2次，每次3ml。经计数细胞共有5.6"08个，在37。C水浴中，将SP2/0细胞(由北京大学生命学院单抗室提供)和脾细胞按10:1比例混合于50ml离心管中，轻轻搅匀，1000rpm离心5min，弃上清，弹击管底使细胞混匀成糊状。将离心管置于37'C水浴中，吸管吸取37'C预热的0.8ml50%PEG1500(购自Sigma公司)，将吸管插入离心管的底部，左手慢慢旋管，右手边搅边加，lmin内加完，将融合液缓缓吸入吸管中，保持0.5min，然后慢慢放出，lmin内完全放出，并于离心管中静置lmin。静置之后，立即沿管壁滴加5mlIDMEM不完全培养基(配方DMEM(袋装)13.5g，青霉素钠(注射用)10万单位，硫酸链霉素(注射用)IO万单位，NaHC033.7g，用重蒸水稀释至1000ml，并用O.lmol/LNaOH或HC1调节pH为7.4)终止融合反应，边加边缓慢搅拌，前0.5min加入2ml，后0.5min加入3ml，然后在lmin内加完5ml。补加IDMEM培养基至40ml，1000rpm离心5min，弃上清。吸管吸取lmlHAT(配方20ml胎牛血清，lmlHAT,79mlDMEM配成100ml)选择培养基后，插入离心管底部，边轻轻搅拌边加入，使细胞悬浮，不能吹，然后补加HAT至40ml，并轻轻混匀细胞，每孔O.lml加入已铺好饲养细胞的96孔板中，共铺4块板。融合后隔日更换HAT培养液。融合3-4天后，可见有小量细胞克隆，在融合10天后，换用HT培养基(配方20ml胎牛血清，lmlHT'80mlDMEM配成1OOml)，大约在12-16天左右，杂交瘤细胞克隆生长至孔底1/4，采用间接ELISA检测培养液上清中的特异性抗体，统计有杂交瘤细胞生长和阳性杂交瘤细胞生长的孔数，计算融合率和阳性率。采用磺胺甲噁唑-卵清蛋白作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗磺胺甲噁唑的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法按每孔10、5、2个细胞的比例，将细胞放入预先铺好饲养细胞的培养板中培养。观察克隆化细胞数目及状态，并及时测定每孔上清液阳性，直至找到阳性的单克隆细胞株，最终筛选出分泌抗磺胺甲噁唑的单克隆杂交瘤细胞系，该细胞系编号为A-7-l，于2008年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCCNo.2411。对该细胞系进行染色体计数，结果显示SP2/0骨髓瘤细胞的染色体数为36对，Balb/C小鼠脾脏细胞的染色体数为20对，而该杂交瘤细胞染色体数目为96-102条之间，可见本试验所得的单克隆抗体细胞株的染色体数与两亲本细胞的染色体数之和基本相似，证明此细胞为两亲本细胞融合的产物。将该细胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生产出单克隆抗体。采用购自Sigma公司的鼠单抗定型ImmunotypeTM试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG,亚类。3、抗磺胺甲噁唑单克隆抗体的纯化具体步骤如下4ml0.06mol/LpH4.8的HAc-NaAc缓冲液分为两部分，大部分与lml腹水混合，并轻轻搅拌均匀；另有少量的HAc-Aac缓冲液与辛酸(共需辛酸33pL)混合成乳浊液。将辛酸乳浊液慢慢滴加入腹水溶液中，边加边轻轻搅拌，加完后持续搅拌30min,此时有大量的白色沉淀。室温下12000rpm离心30min，留上清液弃掉沉淀，滴加等体积4°CpH7.4的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，用1.0mol/LNaOH溶液调pH为7.4，溶液析出大量沉淀，溶液4。C静置2h后，4。C12000卬m离心30min。去上清，将沉淀溶解于0.01mol/LpH7.4PBS中，对PBS透析除盐4次，最后抗体溶液中滴加0.02%NaN3，分装置于-2(TC保存。测定蛋白浓度为8.25mg/ml。用MbaTrapTMG亲和层析柱纯化抗体，腹水经平衡缓冲液(PB，0.02mol/LpH7.0)适当稀释后，上样用于平衡缓冲液平衡好的MbaTarpTMG亲和柱，用平衡缓冲液彻底洗去杂蛋白后，换洗脱液(Gly-HCI，0.01mol/L，pH2.7)将抗体洗下，洗下的抗体立即用中和缓冲液(Tris-HCI，lmol/L，PH9.0)中和，使pH恢复至7.0左右，以免失去活性。4、磺胺甲噁唑兔多克隆抗体的制备新西兰大白兔3只，平均体重2.5kg，单笼饲养。首免取适量合成的免疫原，用灭菌生理盐水稀释后与等量的弗氏完全佐剂混匀，用无菌注射器充分乳化。每只兔子注射抗原量为lmg/mL，经背部皮内多点注射；二免和三免时将弗氏完全佐剂更换为弗氏不完全佐剂，颈背部皮下多点注射，三免后第7天，兔耳缘静脉采lmL全血，取血清，用间接ELISA测定血清效价。效价达到要求后，进行加强免疫，加强免疫后第7天颈动脉采血。经饱和硫酸铵沉淀法得到纯化的多克隆抗体。5、二抗的制备以羊作为免疫动物，以鼠或兔IgG为免疫原进行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗体实施例2检测磺胺甲噁唑单克隆抗体试剂盒组装1.磺胺甲噁唑单克隆抗体试剂盒的结构试剂盒的结构如图l所示，主要包括l盒体，2铝膜真空包装96孔酶标板，3标准磺胺甲噁唑抗原，4酶结合物工作液，5磺胺甲噁唑单克隆抗体工作液，6显色液A液，7显色液B液，8显色液稀释液，9浓縮洗涤液，IO终止液，ll泡沬托架，泡沫托架上有凹孔，上述试剂瓶均放在凹孔内，泡沫托架和酶标板放在盒体内。其中酶标板由塑料支架和可拆分的塑料条组成。2.所用试剂的配制A标准磺胺甲嗞唑抗原磺胺甲噁唑标准溶液6瓶，其浓度范围在l-1000Mg/L。B包被液PH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。C封闭液10%的小牛血清。D浓縮洗涤液0.05°/。-1.2%吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M,PH7.4)，是正常使用浓度的15倍，l瓶。E磺胺甲噁唑单克隆抗体工作液将抗体进行104倍稀释使用，即含有0.3-30mg/L的磺胺甲噁唑鼠源单克隆抗体，6-10ml/瓶，l瓶。F酶结合物工作液酶标记抗鼠的抗抗体稀释液，6-10ml/瓶，l瓶。G底物显色液A液过氧化氢，6-10ml/瓶，l瓶。H底物显色B液四甲基联苯胺(TMB)lml/瓶，1瓶。I显色液稀释液0.2mol/L醋酸钠溶液，10ml/瓶，1瓶。J终止液l-2M硫酸溶液，6-10ml/瓶，l瓶。3.酶标板的制备磺胺甲噁唑和卵清蛋白偶联物包被的酶标板，制备方法如下用包被缓冲液将磺胺甲噁唑和卵清蛋白偶联物稀释成lug/ml，每孔100yl，4'C过夜，倒去包被液，用洗涤液洗三次，每次3min，拍干，然后每孔中加200ul封闭液，37'C温育2h，倒去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。4.酶标二抗的制备用改良的过碘酸钠法来标记辣根过氧化物酶。实施例3检测样品中残留的磺胺甲噁唑l.样品前处理(1)猪尿的预处理将供试尿液3000卬ra离心lOmin，取上清液体蒸干或在氮气流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)(配方NaC18g,KC10.2g，Na2HPO4'12H2O2.9g,KH2PO40.2g)溶解残留物。(2)牛奶样品的预处理牛奶样品经3500rpm离心10min，取3ml加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min，室温3000rpm离心10min，取2ml上层液体蒸干或在氮气流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。(3)组织样品的预处理将待检组织样品匀浆，取3g待检组织样品加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min，室温3000rpm离心10min，取2ml上层液体蒸干或在氮气流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。(4)鸡蛋样品的预处理吸取3ml蛋黄加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min，室温3000rpm离心10min，取2ml上层液体蒸干或在氮气流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。(5)饲料样品的预处理称取饲料lg，加甲醇-水溶液，超声波提取30min，取3ml上层液氮气吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。2.检测方法；(1)向96孔酶标板各孔中预孵育30min的样品或孵育30min的不同浓度标准抗原5(^1然后加磺胺甲噁唑单克隆抗体工作液5(Hi1，37'C孵育30min，洗涤三次，拍干。(2)加酶标二抗每孔加入5000^羊抗鼠酶标二抗100pl,37T:孵育30min，洗涤五次，拍干。(3)加底物加底物溶液，每孔100nl，室温放置5min。(4)终止反应加终止液5(V1,轻轻振荡混匀。(5)读数酶标仪测定每孔的吸光光度值(OD值)。3.结果分析(1)计算每个标准样品，待测样和参照样的OD450值。(2)以标准样品的浓度为X轴，以抑制率为Y轴作图，此图为线性图，其中，抑制率=(参照OD450-待测OD450)/参照孔x100。/。(3)利用标准曲线计算出待测样品中的抗原量如图2所示。相对应的每个样品的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法，计算出样品溶液浓度，利用计算机专业软件，更利于大批量样品的快速分析。根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的标准溶液颜色的比较，可判断出样品浓度大致范围。实施例4试剂盒的灵敏度，特异性，精密度的测定和保存期实验(1)灵敏度的测定最低检测限的定义有多种，本试验采用抑制率的10%表示最低检测限。根据试验结果，确定最低检测限为10ng/mL。(2)特异性的测定选择7种磺胺药物，将不同浓度的磺胺药代替SMZ标准溶液，测定其标准曲线，并计算抑制浓度，计算交叉反应率。公式交叉反应率=50%抑制的SMZ浓度/50%竞争物浓度X100%。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>图中结果表明，试剂盒对其他7中磺胺药的交叉反应率均低于0.1%，说明该试剂盒针对磺胺甲噁唑特异性很高，可保证对动物食品及饲料中磺胺甲噁唑残留检测结果的可靠性。(3)精密度试验精密度又可称为可重复性，反映测定方法对某一特定样本的多次测定所得结果的重复程度，这是质量评价的基本参数，可以用变异系数表示。板内变异系数从众多的样品中随机抽取6个样本按照试剂盒检测模式进行检测，每个样本8个重复。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>板间变异系数:本试验共选择5块板，每块板3个重复。随机抽取2个样品进行板间变异系数的检测。样品酶标板123'45NO.70.42'10.4100.4200.420NO.70.'1180.3750.3790.'Ill0.他肌70.4380.4080.4390.4000.380Ms3110.42670.4010.41570.41030.柳平均依:0.41342标准港0.02186变异系数5.1$NO.80.8230.8350.7910.7790.795肌80.7970.8080.7860.7890.813肌80.8310.7820.807.0.7920.802Ms3n0.8170.80830.79670.7900.8033f-均但:0.80818:0.01892变异系数2.3%_总的板问变异系数3.7%_(4)保存期实验试剂盒保存条件为2-8°C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值、磺胺甲噁唑添加实际测定值、50%浓度均在正常范围之内。同时做加速老化试验，将试剂盒放在37'C状态下6天，测定结果表明试剂盒各项指标完全符合要求，再将试剂盒放入-2(TC冷冻6天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得到试剂盒可以在2-8'C至少可以保存6个月以上。尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围。权利要求1.一种检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒，包括磺胺甲噁唑特异性抗体、包被了抗原的固相载体、磺胺甲噁唑标准溶液、酶结合物工作液、显色剂、显色剂稀释液、浓缩洗涤液、终止液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液，所述显色液A液为过氧化氢，所述B液为四甲基联苯胺(TMB)；所述显色稀释液为醋酸钠溶液；所述洗涤液为0.05％-1.2％吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述终止液为1-2M的硫酸溶液；所述包被抗原过程中所用的包被缓冲液为PH9.6的碳酸盐缓冲液，所用的封闭液为10％小牛血清。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述磺胺甲噁唑特异性抗体为磺胺甲噁唑单克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述二抗为抗鼠或抗兔抗抗体。4.根据权利要求1，2或3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶结合工作液是通过改良的过碘酸纳法来标记辣根过氧化物酶。全文摘要本发明公开了一种检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法。本发明所提供的检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒，包括磺胺甲噁唑特异性单抗及包被的磺胺甲噁唑与载体蛋白的偶联物和酶标二抗。该单克隆抗体由杂交瘤细胞系(保藏号为CGMCCNo.2411)所分泌得到的。本发明的的检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒能同时快速检测大批样品；主要试剂以工作液形式提供，检测方法方便易行；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在动物性食品和饲料磺胺甲噁唑残留量的检测中发挥重要作用。文档编号G01N33/543GK101275947SQ20081009741公开日2008年10月1日申请日期2008年5月26日优先权日2008年5月26日发明者吴国娟,吴红军,张中文,红沈,王彦英,王星星,玮郭,彦陆申请人:北京农学院