专利名称：无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测 定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡， 血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆 中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积 为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时， 可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶 解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生 素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐 阴离子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合 法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定 性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是 比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离 子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定 的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二 醇基苯棊醚(TritonX-lOO)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物， 方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做 标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性 范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法 (Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长 处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，同时，本发明还将给 出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以 在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷酸根)浓度测 定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢丙酮酸氧化酶磷酸根+
丙酮酸+氧+水
丙酮酸+精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶
N2-(D-l-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水 这种方法应用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)酶(偶)联丙酮 酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3)、章鱼碱脱氢酶(Octopine dehydrogenase; EC 1.5.1.11)酶促反应连续监测法。丙酮酸羧化酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸根)酶解产生二氧化碳。丙酮酸氧化酶作为循环酶丙酮酸氧化酶的酶促 作用使二氧化碳再次变回无机磷(磷酸根)，使无机磷(磷酸根)不断地被重复 循环利用，从而不断地产生丙酮酸。章鱼碱脱氢酶作为显色酶，将还原型辅酶(在
340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以 测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降 的速度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试 剂盒较为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶6000 U/L
丙酮酸氧化酶8000 U/L
章鱼碱脱氢酶10000U/L
腺苷二磷酸6 mmol/L
草酰乙酸8 mmol/L
乙酰磷酸4 mmol/L
过氧化氢9 mmol/L
精氨酸3 mmol/L
本发明的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱 氢酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、 过氧化氢、精氨酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶。 还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直
接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、 过氧化氢、精氨酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。 还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷二磷酸、
草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其
还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶6000 U/L
丙酮酸氧化酶8000 U/L
章鱼碱脱氢酶10000U/L
腺苷二磷酸6 mmol/L
草酰乙酸8 mmol/L
乙酰磷酸4 mmol/L
过氧化氢9 mmol/L
精氨酸3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大 小。
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
腺苷二磷酸
草酰乙酸
乙酰磷酸
过氧化氢
50 mmol/L 0.25 mmol/L 6 mmol/L
8 mmol/L 4 mmol/L
9 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸羧化酶 丙酮酸氧化酶
500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8
10，被测无机磷(磷酸根)样品与 试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间 大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大 小。
实施例三
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
还原型辅酶
腺苷二磷酸
草酰乙酸
乙酰磷酸
过氧化氢
50 mmol/L 0.25 mmol/L 6 mmol/L
8 mmol/L 4 mmol/L
9 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸氧化酶
500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L
试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
丙酮酸羧化酶 6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定无机磷(磷酸根)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反 应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反 应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得 出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001;吸光度时间反 应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线形范围可达15 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±4%;试剂测试的精密度(重 复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.0016 ± 0.0008 AA/mmo1 /L;试剂在2—8'C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好， 线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢 丙酮酸氧化酶 磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸+精氨酸+还原型辅酶 章鱼碱脱氢酶N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小测定结果。
2. —种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20-——500 mmol/L稳定剂l一—4000 mmol/L还原型辅酶0.1 ———0.35 mmol/L丙酮酸羧化酶1000———80000 U/L丙酮酸氧化酶1000——-80000 U/L章鱼碱脱氢酶1000——-80000 U/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸卜50 mmol/L乙酰磷酸1-50 mmol/L过氧化氢1—50 mmol/L精氨酸 1——50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围 夕卜，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱 氢酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱 氢酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸组成双剂试剂； 试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷 酸、过氧化氢、精氨酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、 丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧 化酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨 酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱 氢酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸组成多剂试剂； 试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷 酸、过氧化氢、精氨酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、 章鱼碱脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶组成。还原 型辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。
6.根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、精氨酸、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101620140SQ20081012297
公开日2010年1月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司