专利名称：：一种药用乳酸钠溶液质量的测定方法一种药用乳酸钠溶液质量的测定方法所属领域本发明涉及一种药物的分析测定方法。具体来说，本发明涉及一种对药用乳酸钠溶液中成分的测定方法。
背景技术：
：乳酸钠溶液是由药用稀乳酸加氢氧化钠(或碳酸钠)溶液中和而制得(中国药典二部注释1990:358)。由于乳酸分子中具有手性结构，在发酵生产及后处理纯化、精制、中和等过程中又未经外削旋体拆分处理，因而药用乳酸钠中含有D-乳酸钠和L-乳酸钠两种光学异构体。中国药典乳酸钠溶液项下含量测定采用酸碱滴定法(中国药典二部2005:348)，测得的是D-乳酸钠、L-乳酸钠的总含量，不能测定具有生物活性的L-乳酸钠含量以及人体不能利用的D-乳酸钠含量。现有的各种化学分析方法包括滴定法、比色法、高效液相色谱法均无法专一测定乳酸钠溶液中L-乳酸钠或D-乳酸钠含量。酶电极分析法是将卨度立体专一性的生物催化剂酶蛋白分子通过物理化学交联作用固定化做成固定化酶膜，然后与电化学传感器结合构成酶电极(enzymeelectrode)用于分析的一项技术，酶电极分析法集酶反应的高专一性、固定化酶的长期稳定性、电化学分析快速灵敏的特点T一体。我国的乳酸酶电极研究始于20世纪80年代末，1990年国产的固定化乳酸酶膜达到实用化水平，主要应用于运动医学的周期性耐力项目运动员血液中L-乳酸测定，以控制训练量。后L-乳酸分析又逐歩应用于发酵工业生产。本文采用固定化D-乳酸氧化酶结合HA电极构成D-乳酸酶电极生物传感分析仪，用于药用乳酸钠中D-乳酸钠分析只需将样品稀释50倍即可测定，25秒自动显示、打印结果。
发明内容为克服现有分析方法的不足，本发明提供一种药用乳酸钠溶液质量的测定方法，具体是采用酶电极型生物传感器法定量测定药用乳酸钠溶液中D-乳酸钠含量，用固定化酶技术将D-乳酸氧化酶(EC1.1.1.26)制成固定化酶膜，结合过氧化氢型电极构成D-乳酸酶电极生物传感器，用于乳酸钠溶液中D-乳酸钠的含量测定，从而方便、准确、快速地对乳酸钠溶液的质量进行测定。技术方案本发明提供的乳酸钠溶液质量的测定方法，包括下述顺序的步骤.1固定化D-乳酸钠酶膜的制备1.1载体膜圈制备取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mra的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。1.2载体膜圈表面处理将载体膜圈置20%甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸馏水冲净、晾干。1.3固定化复合酶膜制备取D-乳酸氧化酶O.l单位、20%牛血清白蛋白5^1、2。/。戊二醛2pl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。2固定化D-乳酸酶膜参数基础活性>50，线性l~270mg/L;各点偏差小于lmg，响应30s测定值大于60s测定值的90%,膜完整性亚铁氢化钾测定值-26范围内，工作寿命>25&3过氧化氢电极制备两电极均为长20咖的圆柱体，铂电极表面积4mm2，银电极表面积60mm2，用专用模具置备。两电极之间填充环氧树脂，电极套头端与醇膜圈应嵌合良好，铂电极与酶膜须紧密接触(见图1),铂电极为正极；银电极为负极。两电极之间极化电压0.65V,酶电极输出电流0500nA。4D-乳酸酶电极生物传感器结构D-乳酸酶电极生物传感器由生化反应系统(一次仪表)和电信号处理系统(二次仪表)组成(见图2)。5.测定方法仪器定标采用0.l誦cl'L—'pH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含D-乳酸钠500rag'L—',取25u1标准液注入反应池，20s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键定标500mg'L—'，自动清洗后即可测定样品。样品制备取药用乳酸钠溶液lml，置50ml量瓶中加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得，进样量25^1。有益效果用固定化D-乳酸氧化酶复合11202电极测定乳酸钠溶液中D乳酸钠含量是目前该分析领域最先进的测试手段，其先进性表现为(l)与紫外分光光度法相比具有方法简单、分析专一性好的优点，能测出单一D-乳酸钠组分，而不是具有紫外吸收的多个组分；(2)与常规酶法分析相比较，因为采用固定化技术将可溶性酶固定在电极头部反复使用，在测定过程中不会造成酶的流失，从而减低了酶法测定的成本；(3)采用HA电极为基础电极，较之pH电极和氧电极其基线电流更加稳定，分析精度高于其它方法。(4)采用酶电极法测定乳酸钠溶液中的D-乳酸钠含量，由于酶促反应专一性高、样品不需分离直接稀释50倍即可进样分析、处理条件温和、反应时间短暂结果较为可靠。图1是D-乳酸酶电极结构示意图；其中l铂电极；反应(2),2银电极；反应(3)，3内膜，4固定化D-乳酸氧化酶；反应(1)，5核微孔膜，6密封圈，7底物图2是D-乳酸酶电极生物传感器结构示意图；其中l进样器，2光电开关，3信号处理器，4酶电极，5搅拌子，6电磁搅拌器，7泵1，8缓冲液，9泵2，10废液具体实施例方式1仪器与试药D-乳酸氧化酶(EC1.1.1.26):美国Sigma公司；D-乳酸钠美国Sigma公司戊二醛上海化学试剂采购供应站进口分装；核微孔膜美国Nucleopore公司(d>0.2uni);铂、银中国人民银行济南分行(纯度为99.999%);其他试剂均为分析纯，药用乳酸钠溶液(规格乳酸钠不低于40%，批号070812、070817、070928):无锡某制药厂。仪器SBA-40型乳酸生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)。2测定原理固定化D-乳酸氧化酶结合HA电极测定D-乳酸钠原理0-乳酸钠+02貼化乳酸氧化酵>HA+丙酮酸钠铂电极、HA+2H+02+2e-+H20银电极、AgCl+e^Ag+C丄3D-乳酸钠对照品溶液制备精密称取D-乳酸钠对照品50mg置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解、定容，作为对照品溶液。4酶电极专一性试验取可能的干扰物配成浓度500mg/L的溶液，以500mg/l,的D-乳酸钠标准液在D-乳酸酶电极上的响应为500，测定干扰物溶液在问一酶电极上的相对响应。结果见表l表1酶电极专"性试验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果L-乳酸钠等其它有机酸(盐)在D-乳酸氧化酶HA电极上的响应为0，表明D-乳酸酶电极具有高度的专一性。5酶电极最适pH不同pH磷酸盐缓冲液对肌苷酶电极响应的影响见表2所示，在pH7.2时酶电极响应值最高，所以本研究釆用PH7.2的磷酸盐缓冲液。表2不同PH缓冲液对乳酸酶电极响应的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6精密度试验取D-乳酸钠标准液50mg*L_1、250mg'L—'、500mg'L/'照"仪器定标"项下操作，对同一标准液连续测定20次，每次进样25ix1，结果如下50mg.L—'组RSDW.22呢、250mg'L—'组RSD=0.36%、500mg.L—'组RSD=1.0%。7线性关系试验用乳酸酶电极分别测定50、100、200、300、400、500mg'L—1D-乳酸钠标准液，以浓度为X，响应值为Y，进行回归分析得线性回归方程Y=0.23+0.995X,r=0.9989。8加样回收试验取稀释的乳酸钠样品溶液分为5份加己知浓度的D乳酸钠标准液进行回收试验。结果见表3表3肌苷回收试验结果Tab3RecoveryresultsforD-lactate(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>9酶电极法与酸碱滴定法对比试验药用乳酸钠样品测定药用乳酸钠溶液中乳酸钠含量测定按照中国药典药用乳酸钠溶液项下含量测定要求操作；D-乳酸钠测定照"技术方案5.测定方法"项下操作，采用对照品法结果见表4。表4药用乳酸钠样品测定结果(n=5，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表4数据可见同一厂家不同批号的药用乳酸钠溶液中D—乳酸钠含量约占乳酸钠总量的90y。。权利要求1固定化D-乳酸氧化酶膜的制备载体膜圈制备取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mm的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。载体膜圈表面处理将载体膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸馏水冲净、晾干。固定化复合酶膜制备取D-乳酸氧化酶0.1单位、20％牛血清自蛋自5μl、2％戊二醛2μl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化复合酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。全文摘要本发明涉及一种药用乳酸钠溶液质量的测定方法，属生物传感器
技术领域：
。制备方法是将D-乳酸氧化酶固定化后与H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>电极结合构成D-乳酸酶电极生物传感器，采用0.1mmol.L<sup>-1</sup>pH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含D-乳酸500mg.L<sup>-1</sup>，取标准液25μl注入反应池20s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标500，自动清洗后即可测定样品。文档编号G01N27/327GK101349668SQ20081013842公开日2009年1月21日申请日期2008年7月22日优先权日2008年7月22日发明者史建国,孙士青,孟庆军,张利群,李雪梅,艳杨,杨俊慧,王丙莲,赵晓华,马耀宏申请人:山东省科学院生物研究所