一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针及其制备和检测方法

专利名称：一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针及其制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针，还涉及该探针的制 备和检测方法。
背景技术：
环境中病原微生物的存在，严重威胁着人类的身体健康，无论在发展中国家还是发达 国家，生物性危害所占的比率均大于化学性等其他因素的危害。环境中细菌病原体的检测 和鉴定凸现重要。
当前对病原微生物进行检测的方法有聚合酶链式反应(PCR， polymerase chain reaction)、荧光分析法、荧光原位杂交法(FISH， fluorescence in site hybridization)和基因 芯片(genechip)法。PCR反应能被自然界中一些物质所抑制，例如胡敏酸、富里酸。同 样，环境样品在浓縮、保存和提纯过程中可能从环境及中间处理环节带来一些潜在的PCR 反应抑制剂，例如EDTA、十二烷基磺酸钠和一些胍基化合物等，另外还有一些共存物质 抑制PCR反应，这些物质一方面可能抑制PCR反应，另一方面还可能造成假阳性结果。 PCR法需要得到纯化的DNA或RNA片段进行扩增，步骤较多，对仪器和人员的要求高。 荧光标记法中荧光探针容易受到生物体系内源荧光背景干扰。对于环境中常见的病原微生 物的检测来说，FISH法是应用广泛、最为有效的技术之一，但FISH法中荧光探针容易受 到生物体系内源荧光背景和用于固定微生物基质背景的干扰，检测时灵敏度的提高受到限 制。基因芯片法技术还不是很完善，仍有一些关键问题有待解决，如特异性、样品制备、 基因扩增、灵敏度等方面还存在许多问题，而且成本较高。如何采用更好的方法或较为简 单的仪器进行高灵敏度检测是目前研究的热门课题。
长寿命发光技术可以有效消除生物体系内源荧光和背景信号的千扰，纳米生物探针技 术具有生物敏感物的高选择性、纳米材料增强的高灵敏度、稳定性与信号转换功能以及纳 米技术赋予的微型化特征，使得纳米生物探针技术已逐渐成为解决复杂生命、环境等体系 分析问题的关键技术，利用长寿命发光纳米生物探针技术构建选择性好、灵敏度高、快速、 简便的环境中病原微生物的检测技术具有重要的理论与实际意义。

发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针。 本发明的第二个目的是提供长寿命发光纳米生物探针的制备方法。 本发明的第三个目的是提供长寿命发光纳米生物探针的检测方法。 本发明的目的之一是通过下述方案实现的。
所述探针采用了捕获探针DNA卜识别探针DNA2及待检测病原微生物基因片段的目 标探针DNA3，其中捕获探针、识别探针均能与病原微生物基因片段的目标探针互补杂交， 捕获探针固定在玻璃片上；识别探针连接有核壳型结构的稀土配合物长寿命发光纳米颗 粒，其中壳成分为二氧化硅，内核材料为长寿命发光稀土配合物。
所述的核壳型结构的稀土配合物长寿命发光纳米颗粒中的稀土配合物是以噻吩甲酰 三氟丙酮(TTA)， 1，10-邻菲啰啉(phen)为配体的稀土铕长寿命发光配合物Eu(TTA)3phen，
结构式<formula>formula see original document page 6</formula>
所述的核壳型结构的稀土配合物长寿命发光纳米颗粒中的稀土配合物是以噻吩甲酰 三氟丙酮(TTA)， 1，10-邻菲啰啉(phen)为配体的稀土铽长寿命发光配合物Tb(TTA)3phen，
本发明的目的之二是通过下述方案实现 1、稀土配合物的合成
将稀土氧化物溶于浓盐酸或高氯酸中，加热除去多余的浓盐酸或高氯酸，加乙醇稀释
得透明溶液，另以乙醇溶解噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)，将稀土氧化物的乙醇溶液和TTA
结构式:<formula>formula see original document page 6</formula>
的乙醇溶液徐徐加入混合，水浴加热，磁力搅拌，控制温度为55~65匸，用NaOH调节pH 值为5.5~6.5，反应30 50分钟，以乙醇溶解1,10-邻菲罗琳(phen),滴加至反应体系中， 控制反应温度在55 65'C继续反应4 6h，搅拌冷却，静置过夜，抽滤；先用乙醇水溶液洗 涤，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，重结晶数次，得长寿命发光稀土配合物； 2、稀土配合物长寿命发光纳米颗粒的合成'
在含有表面活性剂曲拉通X-100 (TritonX-lOO)、环己垸和正己醇的体系中，以水为 分散相，加入稀土配合物固体，制备油包水的微乳液，与氨水催化正硅酸乙酯水解所形成 的二氧化硅共聚，以上混合液在常温下持续搅拌20 30小时后停止反应，加入丙酮破乳， 离心，先后用无水乙醇和二次蒸馏水洗多次至上清液无发光为止，得到稀土配合物的长寿 命发光纳米颗粒；
3、 根据常见病原微生物的特异性片段设计合成捕获探针DNAi、识别探针DNA2及 病原微生物基因片断的目标探针DNA3;
4、 玻璃芯片的制备
修饰玻片，将捕获探针连接到玻片上构成玻璃芯片；
5、 连有长寿命发光纳米颗粒的识别探针的制备
将稀土配合物的长寿命发光纳米颗粒分散到戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡2.5~3.5h， 离心并用二次蒸馏水洗，得到的醛基修饰的颗粒重新悬于pH=7.0-7.5的PBS溶液中备用； 将识别探针DNA2用二次蒸馏水稀释成15pmol/L;将识别探针DNA2加入到纳米颗粒悬浮 的PBS溶液中，35-40。C下于震荡培养箱中反应2.5-3.5h，反应完成后，离心，洗涤；然后 将连接有DNA2的纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，备用。
将稀土氧化物氧化铕EU203溶于浓盐酸中或稀土氧化物氧化铽Tb407溶于高氯酸中。
本发明的目的之三是通过下述方案实现的
a、 杂交，连有长寿命发光纳米颗粒的识别探针DNAi与待检测的病原微生物基因片 段目标探针DNA3在玻璃芯片杂交；
b、 杂交处理，清洗后，带有长寿命发光纳米颗粒标记的识别探针DNA2，待检测的 病原微生物基因片段目标探针DNA3和捕获探针DNA,形成杂交体，检测在激光激发下产 生的光信号。
所述的a步杂交是首先将目标探针DNA3用二次蒸馏水稀释到15nmol/L;将上述 DNAd彦饰的玻璃芯片放入杂交盒中，在玻片周围滴加10nl 3xSSC来维持湿度；将DNA2
和DNA3样品滴加到玻片上，盖上盖玻片，赶走气泡；盖上杂交盒，将其放入震荡培养箱 中恒温箱G8.3。C)中杂交24h;用配制好的杂交后清洗液l (lxSSC/0.03%SDS)、洗液 2 (0.2xSSC)和洗液3 (0.05xSSC);让玻片一直留在洗液里轻轻从洗液中提起玻片， 放入，再提起，来回上下清洗几次；
所述b步是杂交清洗后，带有纳米颗粒标记的识别DNA2，目标DNA3和捕获DNA！ 探针形成一个杂交体，在激光激发下产生一个光信号，检测出了玻片上的稀土长寿命发光 配合物纳米颗粒的光信号激发和发射狭缝分别为8.0nm，延迟时间O.lms，门时间1.0 ms; 从而根据检测的光信号检测样品中待测病原微生物的存在与否。
本发明优越于传统检测方法的特点在于，长寿命发光纳米生物探针技术具有有效消除 生物体系内源荧光和背景信号的干扰以及生物敏感物的高选择性等优点，故有可能做到更 低浓度病原微生物的检测，且纳米材料增强了灵敏度、稳定性与信号转换功能以及纳米技 术赋予的微型化特征。同时，根据已发表的专利(姚志建，于勇，马立人等，检测多种常 见细菌病原体的基因芯片、制备方法、试剂盒，中国专利，
公开日2007年10月3日，公 开号CN 101045945 A)中常见病原微生物的特异性片段中的金色葡萄球菌和大肠杆菌的片 段。根据所得到的特异性序列，我们用软件Primer Premier 5.0，选择出合适的玻璃芯片上 的捕获探针DNA"连接在长寿命发光纳米颗粒上的识别探针DNA2及病原微生物基因片 断的目标探针DNA3，采用了纳米探针的三明治杂交方法，大大提高了杂交特异性和检测 灵敏度。构建了一种具有高稳定性、高选择性、高灵敏度、快速、简便的环境中病原微生 物的检测技术。


图1为以配合物Eu(TTA)3phen为核的长寿命发光纳米颗粒透射电镜图； 图2为Eu(TTA)3phen纳米颗粒的长寿命发光发射光谱aex=337nm，延迟时间O.lms， 门时间1.0ms);
图3为三明治结构的检测模型杂交示意图4为玻片上检测长寿命发光光谱(延迟时间0.1ms，门时间1.0ms)
具体实施例方式
现结合附图对本发明作出进一步说明。以下旨在说明本发明而不是对本发明进一步限
定，本发明可以按发明内容所述任一方式实施。
一、 以噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)， 1,10-邻菲啰啉(phen)为配体的稀土铕配合物 EuCTTA)3phen的制备。
合成步骤称取0.25mmolEu2O3于0.5ml浓盐酸中，加热溶解，除去多余的浓盐酸， 加水稀释得透明溶液。另以15ml乙醇溶解1.52mmo1 TTA。将氯化铕的乙醇溶液和TTA 的乙醇溶液徐徐加入到三口瓶中，水浴加热，磁力搅拌，控制温度为60'C，用NaOH调节 pH值6.0左右。(加碱时有固体析出，体系出现混浊)，反应40min。以10ml乙醇溶解phen， 滴加至反应体系中。随着phen的加入，先前生成的沉淀逐渐溶解。控制反应温度在55-60°C 继续反应5h，搅拌冷却。静置过夜，有白色的固体析出，抽滤。先用24ml乙醇-水(1: 1) 溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，于50'C下干燥，以甲醇-氯仿混合溶液重结晶数次，得白色 固体一稀土铕长寿命发光配合物Eu(TTA)3phen,其结构式如附图1所示。红外光谱检测 Eu (TTA)3phen数据自由配体TTA中1637 cm"的v(c^o)特征峰，在配合物Eu(TTA)3phen 中蓝移到了 1626 cm";自由配体phen位于1587cm'1处v(c = N)的特征峰，在配合物 Eu(TTA)3phen中蓝移到了 1543 cm-1。元素分析EuC36H23N2F9S3:测量值Eu， 15,33; C， 42.98; H， 2.35; N， 2.76;计算值Eu， 15.21; C， 43.26; H， 2.30; N， 2.80;
二、 反相微乳液法制备稀土配合物Eu(TTA)3phen的长寿命发光纳米颗粒。 分别量取1.8ml正己醇，1.77ml TritonX-100和7.5ml环己垸加入三口烧瓶，再加入34(V1
二次蒸馏水和15mg Eu(TTA)3phen形成微乳液体系搅拌5min;随后加入10(^1正硅酸乙酯 (TEOS)和100^128%氨水作为反应体系催化剂；并设置搅拌器转速为600rpm,在常温 下反应24h;反应完毕后，加入丙酮破乳，离心，分别用乙醇、二次蒸馏水洗涤至上清液 无发光，得到了稀土配合物Eu(TTA)3phen的长寿命发光纳米颗粒。如附图2所示，得到的 纳米颗粒粒径都在20nm左右，取固体Eu(TTA)3phen纳米颗粒，在激发波长^x=337nm时， 激发和发射狭缝分别为8.0nm，延迟时间0.1ms，门时间lms，其发射光谱如附图3所示， 该配合物在611nm处出现了很强的发射峰，在591nm处出现了一个小的发射峰。
三、 病原微生物基因片断检测的三明治模型。
该病原微生物基因片断检测的三明治模型是由病原微生物的基因DNA3片断、联接有 互补基因DNA2的硅壳长寿命发光纳米颗粒、与玻璃芯片相联的另一段互补基因DNAJ且 成。如附图4所示，将病原微生物基因DNA3同时与联接在硅壳长寿命发光纳米颗粒上的 DNA2，以及玻璃芯片上的DNAt片断在适当的条件下杂交反应，形成类似三明治结构的杂
交复合物。
四、 设计对病原微生物进行检测的各探针序列和检测序列。
根据已发表的专利(姚志建，于勇，马立人等，检测多种常见细菌病原体的基因芯片、 制备方法、试剂盒，中国专利，
公开日2007年10月3日，公开号CN 101045945A)中金 色葡萄球菌和大肠杆菌的特异性片段。该专利是通过文献检索及美国国家生物信息中心 (NCBI)的对比，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列输入软件PrimoMultiplex 3.4 Multiplex PCR Primer Design,设定好参数，运行程序，最终获得病原体基因探针。它们的 具体序列如下
(1) 金色葡萄球菌("*****"代表十个A碱基)
捕获探针DNA!: 5，- CACTT TTTCT TAAAT GTTGTTC *****-3，-NH2 识别探针DNA2: NH2-5，- *****ATTTT CTCTT TTTTC GCTT-3， 目标探针DNA3: GAAC AACAT TTAAG AAAAA GTGAA GCACA AGCGA AAAAA GAGAAAAT
(2) 大肠杆菌
捕获探针DNAi: 5，-ACATT GACGC AGGTG ATCGGACG *****-3，- NH2 识别探针DNA2: NH2-5，- ***** GTATCGGTGTGAGCGTCGCAGAA-3， 百标探针DNA3: 5'隱CGTCC GATCA CCTGC GTCAATGTAATGTTC TGCGA CGCTC ACACC GATAC-3，
五、 制备玻璃芯片和核壳长寿命发光纳米探针(以金色葡萄球菌为例)。 玻璃芯片的制备根据文献报道的方法来修饰玻片。正方形玻片(直径13mm)浸入
铬酸洗液中浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入25%氨水中过夜，二次蒸馏水水洗，浸入2%的氨 基硅垸95%乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至4.5，室温作用30min,用乙醇超声清洗，用 二次蒸馏水超声清洗，室温晾干。室温下2.5%戊二醛的0.1mol/L， PBS (pH=7.2)溶液与 氨基玻片作用2h， PBS冲洗，二次蒸馏水水洗(lmin/次)，晾干。将探针DNA,用二次蒸 馏水稀释到15pmol/L，将DN&样品滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用0.2% 的SDS洗2次，水洗两次，室温晾干备用。
长寿命发光纳米探针的制备称取100mg表面氨基化的Eu(TTA)3phen纳米颗粒分散 到6ml2.5n/。的戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡3h。离心并用二次蒸馏水洗，得到的醛基修 饰的颗粒重新悬于6mlpH=7.2的PBS溶液中备用。将识别探针DNA2用二次蒸馏水稀释
成15nmol/L。将DNA2样品加入到纳米颗粒悬浮的PBS溶液中,37°C下于震荡培养箱中 反应3h，反应完成后，离心，洗涤。然后将标记好DNA2的纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，
备用c
六、杂交及信号检测。
首先将目标探针DNA3用二次蒸馏水稀释到15陴ol/L。将上述DNA!修饰的玻璃芯片 放入杂交盒中，在玻片周围滴加10pl3xSSC来维持湿度。将DNA2和DNA3样品滴加到玻 片上，盖上盖玻片，赶走气泡。盖上杂交盒，将其放入震荡培养箱中恒温箱(38.3°C)中 杂交24h。用配制好的杂交后清洗液l (lxSSC/0.03%SDS)、洗液2 (0.2xSSC)和洗液3 (0.05xSSC)见下表所示清洗。让玻片一直留在洗液里轻轻从洗液中提起玻片，放入， 再提起，来回上下清洗几次。
杂交及清洗后，带有纳米颗粒标记的识别DNA2，目标DNA3和捕获DNAi探针形成 一个杂交体，在激光激发下产生一个光信号，如图5所示，检测出了玻片上的Eu(TTA)3phen 纳米颗粒的光信号激发和发射狭缝分别为8.0nm,延迟时间0.1ms，门时间1.0ms。因此 可以根据检测的光信号检测样品中金色葡萄球菌的存在与否。
权利要求
1、一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针，其特征在于，所述探针采用了捕获探针DNA1、识别探针DNA2及待检测病原微生物基因片段的目标探针DNA3，其中捕获探针、识别探针均能与病原微生物基因片段的目标探针互补杂交，捕获探针固定在玻璃片上；识别探针连接有核壳型结构的稀土配合物长寿命发光纳米颗粒，其中壳成分为二氧化硅，内核材料为长寿命发光稀土配合物。
2、 根据权利要求1所述的一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针，其 特征在于，所述的核壳型结构的稀土配合物长寿命发光纳米颗粒中的稀土配合物是以噻吩 甲酰三氟丙酮TTA， 1,10-邻菲啰啉phen为配体的稀土铕长寿命发光配合物:Eu(TTA)3phen。
3、 根据权利要求1所述的一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针，其 特征在于，所述的核壳型结构的稀土配合物长寿命发光纳米颗粒中的稀土配合物是以噻吩 甲酰三氟丙酮TTA， 1,10-邻菲喂啉phen为配体的稀土铽长寿命发光配合物:Tb(TTA)3phen。
4、 根据权利要求1或2或3所述的一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物 探针，其特征在于，捕获探针、识别探针及待检测病原微生物基因片段的目标探针呈长寿 命发光纳米颗粒标记的三明治杂交体。
5、 一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤a、 稀土配合物的合成将稀土氧化物溶于浓盐酸或高氯酸中，加热除去多余的浓盐酸或高氯酸，加乙醇稀释 得透明溶液，另以乙醇溶解噻吩甲酰三氟丙酮TTA，将稀土氯化物的乙醇溶液和噻吩甲酰 三氟丙酮TTA的乙醇溶液徐徐加入混合，水浴加热，磁力搅拌，控制温度为55 65。C，用 NaOH调节pH值为5.5~6.5，反应30 50分钟，以乙醇溶解l，lO-邻菲罗琳phen，滴加至反 应体系中，控制反应温度在55 65。C继续反应4 6h，搅拌冷却，静置过夜，抽滤；先用乙 醇水溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，重结晶数次，得长寿命发光稀土配合物；b、 稀土配合物长寿命发光纳米颗粒的合成在含有表面活性剂曲拉通TritonX-lOO、环己烷和正己醇的体系中，以水为分散相，加 入稀土配合物固体，制备油包水的微乳液，与氨水催化正硅酸乙酯水解所形成的二氧化硅 共聚，以上混合液在常温下持续搅拌20 30小时后停止反应，加入丙酮破乳，离心，先后 用无水乙醇和二次蒸馏水洗多次至上清液无发光为止，得到稀土配合物的长寿命发光纳米 颗粒；c、 根据常见病原微生物的特异性片段设计合成捕获探针DNA^识别探针DNA》及病 原微生物基因片断的目标探针DNA3;d、 玻璃芯片的制备修饰玻片，将捕获探针连接到玻片上构成玻璃芯片；e、 连有长寿命发光纳米颗粒的识别探针的制备将稀土配合物的长寿命发光纳米颗粒分散到戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡2.5~3.511， 离心并用二次蒸馏水洗，得到的醛基修饰的颗粒重新悬于pH=7.0-7.5的PBS溶液中备用； 将识别探针DNA2用二次蒸馏水稀释成15nmol/L;将识别探针DNA2加入到纳米颗粒悬浮 的PBS溶液中，35-40'C下于震荡培养箱中反应2.5-3.5h，反应完成后，离心，洗涤；然后 将连接有DNA2的纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，备用。
6、 根据权利要求5所述的一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针的制备方法，其特征在于，将稀土氧化物氧化铕EU203溶于浓盐酸中或稀土氧化物氧化铽Tb407溶于高氯酸中。
7、 权利要求1或2或3所述的一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针 的检测方法，其特征在于a、 杂交，连有长寿命发光纳米颗粒的识别探针DNAi与待检测的病原微生物基因片 段目标探针DNA3在玻璃芯片杂交；b、 杂交处理，清洗后，带有长寿命发光纳米颗粒标记的识别探针DNA2，待检测的 病原微生物基因片段目标探针DNA3和捕获探针DNAi形成杂交体，检测在激光激发下产 生的光信号。
8、 根据权利要求7所述的一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针的检 测方法，其特征在于，所述的a步的杂交步骤的过程为首先将目标探针DNA3用二次蒸馏水稀释到15^mol/L;将上述DN^修饰的玻璃芯片 放入杂交盒中，在玻片周围滴加l(M 3xSSC来维持湿度；将DNA2和DNA3样品滴加到玻 片上，盖上盖玻片，赶走气泡；盖上杂交盒，将其放入震荡培养箱中恒温箱38.3。C中杂交 24h;用配制好的杂交后清洗液1: lxSSC/0.03% SDS、洗液2: 0.2xSSC和洗液3: 0.05xSSC; 让玻片一直留在洗液里轻轻从洗液中提起玻片，放入，再提起，来回上下清洗几次。
9、 根据权利要求7或8所述的纳米长寿命发光生物探针的检测方法，其特征在于，所述的6步的步骤为杂交处理，清洗后，带有纳米颗粒标记的识别DNA2,目标DNA3 和捕获DNA探针形成一个杂交体，在激光激发下产生一个光信号，检测出了玻片上的稀 土长寿命发光配合物纳米颗粒的光信号激发和发射狭缝分别为8.0nm，延迟时间0.1ms， 门时间1.0ms;从而根据检测的光信号检测样品中待测病原微生物的存在与否。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测病原微生物的长寿命发光纳米生物探针及其制备和检测方法。制备了用于纳米探针制备的长寿命发光纳米颗粒，设计合成玻璃芯片上的捕获探针DNA₁、连接在长寿命发光纳米颗粒上的识别探针DNA₂及病原微生物基因片段的目标探针DNA₃，构建了类似三明治结构的检测模型。利用了长寿命发光纳米颗粒能有效消除生物体系内源荧光和背景信号的干扰，以及纳米技术的高灵敏性、稳定性与信号转换功能等优点，本发明的检测方法操作简便、成本低、灵敏度和特异性高、稳定性好。
文档编号G01N21/64GK101382491SQ20081014328
公开日2009年3月11日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者博 彭, 曾光明, 琳 汤, 牛承岗, 秦品珠, 敏 阮 申请人:湖南大学