专利名称：：一种加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于药物残留分析和免疫
技术领域：
，涉及喹诺酮类的酶联免疫检测试剂盒，特别涉及一种加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
：加替沙星(GAT)是一种喹诺酮类的广谱抗生素，价格低廉，杀菌效果好，被广泛用于治疗人体和动物体的感染。但是，加替沙星在食物链中会累积残留，并引起患者体内血糖代谢异常，所以越来越多的国家设定了喹诺酮类的最高检出限。鉴于此，为了保障人民身体健康，保证进出口动物源性产品的质量，需要寻求一种快速、灵敏、方便的加替沙星残留的检测方法。己经报道的检测加替沙星残留的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)和酶联免疫法。HPLC和LC-MS都有高灵敏度、高特异性的特点，但是它们均为昂贵笨重且难以携带的仪器，并需大量的有机溶剂及费时的样品处理过程。ELISA分析与其它方法相比，优势在于灵敏度高，特异性强，仪器设备要求不高，测定成本低，方法快速、简便，试剂保存时间较长，自动化程度高，无放射性同位素污染，可现场操作且检测批量大。故研究开发一种快速、灵敏、方便的加替沙星的酶联免疫检测试剂盒具有直接的经济效益和社会效益。
发明内容针对现有检测技术的不足，本发明的目的是提供一种检测加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒。本发明所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由加替沙星与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括加替沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、加替沙星系列标准溶液、浓縮磷酸盐缓冲液、浓縮洗涤液、发光液。其中所述酶标板优选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。所述包被抗原浓度优选5wg/mL。所述包被抗原制备具体由加替沙星通过EDC(碳二亚氨活化酯)法与分子量范围是6.7KDa6.8KDa的卵清蛋白(0VA)偶联制成。上述加替沙星的多克隆抗体的工作浓度优选1:4000。所述加替沙星的多克隆抗体是由加替沙星通过EDC法与分子量范围是6.7KDa6.8KDa的牛血清蛋白(BSA)偶合制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其涉及的反应方程式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>上述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒中所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度优选1:1000。所述加替沙星系列标准溶液浓度分别为0.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL禾口2ng/mL。所述浓縮磷酸盐缓冲液是每升含NaCl80g、KH贝2.0g、N&HTO,.12H2029.0g、KC12.Og的水溶液。所述浓縮洗涤液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5、0.lmol/L的磷酸盐缓冲液。所述发光液是O.01M鲁米诺与pH=8.8、O.OOIM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比浓度为3/10000&02的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。用对甲苯酚作为增强发光反应，其机理为自由基机理。其中涉及的发光反应式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>DMFEDCGAT4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒最低检测限可达0.01ng/ml，线性检测范围在0.05-2ng/ml，板内变异系数在4-19%以内，尿样品中回收率在83-113°/。之间。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具备如下的特点(1)所制备的抗体对于加替沙星有着很高的特异性，能够实现对尿样中加替沙星的残留进行专一的检测和评定。(2)样品前处理简单，无需过柱净化。(3)结果灵敏度高，性能稳定，比传统的比色酶联免疫检测法，有着更高的灵敏度和更低的检测下限。图1为本发明加替沙星抗体的抑制率曲线。图2为本发明加替沙星抗体的工作曲线。具体实施方式实施例1加替沙星免疫原、包被抗原、及多克隆抗体的制备(1)免疫原的制备A，分别称取GAT(加替沙星)15.0mg(40wmol)，EDC(碳二亚氨活化酯，76.5mg，400Pmol)，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，22.5mg，200wmol)依次溶于5mLDMF(N-N二甲基甲酰胺)中，避光、室温搅拌反应24小时；B，将90.0mg(1.3wmol)cBSA(活化的牛血清蛋白)溶于10mLPBS(磷酸盐缓冲液，O.OIM，pH7.4)中；C，将"A"反应液缓慢加入到"B"反应液中，室温搅拌反应3小时；反应完毕后，将反应液转移到半透膜中，在0-4°C用PBS透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得白色絮状固体即为加替沙星的免疫原，-20°C保存，备用。(2)包被抗原的制备称取13mg(35wmol)GAT以500DMF促溶，加入到10mLPBS(0.01M，pH7.4)中，再将OVA(卵清蛋白，40mg，0.887pmol)、EDC67mg(350wmol)、NHS20rag(175/mol)依次溶于上述GAT溶液中，室温搅拌反应3小时。反应完毕后，将反应液转移到半透膜中，在0-4°C用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得白色絮状固体即为包被抗原，-20°C保存，备用。(3)多克隆抗体的制备合成的免疫原被用来免疫两只雄性新西兰大白兔。首次免疫，用注射器对抽法将弗氏完全佐剂与免疫原按1:1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射0.5mg免疫原，进行背部皮下多点注射(5-IO点)。首免两周后第一次加强免疫用弗氏不完全佐剂与同样量的抗原混合，进行第二次免疫，剂量、方法同首免。以后每隔两周加强免疫一次，剂量减半。第五次不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，注射七天后进行心脏采血。血液在4°C静置过夜，次日10000g/min离心15分钟，分离出抗血清，得到多克隆抗体。实施例2化学发光酶联免疫吸附检测法(CL-ELISA)的建立(一)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)酶标板纵向用100z/L/孔的，浓度梯度按80.0//g/mL、40.Owg/mL、20.0//g/raL、10.Owg/mL、5.Owg/mL、2.5wg/mL、1.25//g/mL、和O.625wg/mL的包被抗原溶液包被，4。C放置过夜，用280/iL/孔的洗涤液洗板三次，再用250wL/孔封闭液封闭，室温放置2.5小时，洗涤三次；横向加入100/iL/孔，稀释梯度按l:100、1:2001:51200的抗体溶液，室温放置2小时，洗漆三次；加入100^L/孔的1:IOOO的辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，室温放置l小时，洗涤三次；加入100^L/孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。(二)抗体灵敏度的测定(见图l)经上述方阵法优选，申请人选择包被抗原浓度为5;ig/mL，抗体浓度为1:4000，进行抗体的灵敏度的测定(1)包被过程用0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，将加替沙星的包被抗原配成g/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加lOOwL，4。C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，280wL/孔，每次5分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。(2)封闭过程用250;/L/孔的封闭液封闭上述已包被的酶标板，室温孵育2.5小时，洗涤。(3)竞争过程加稀释抗体(1:2000)50wL/孔与不同浓度的药物50wL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育2-4小时，洗涤。(4)酶标过程于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体(1:1000)100wL/孔，室温孵育1.5小时，洗涤。(5)发光过程于各反应孔中加入IOO^L/孔临时配制的发光液，立即用化学发光免疫分析仪检测。(6)计算过程检测结果以抑制率计算，％抑制率=%B/Bo，B是加入竞争者的发光值，Bo是没有竞争者的发光值。计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。以加替沙星的浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到抑制率曲线(图l)。(三)工作曲线的建立(见图2)(1)包被过程用0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，将加替沙星的包被抗原配成g/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加IOOaL，4。C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，280wL/孔，每次5分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。(2)封闭过程用250wL/孔的封闭液封闭上述已包被的酶标板，室温孵育2.5小时，洗涤。(3)竞争过程:加稀释抗体(1:2000)50^L/孔与浓度梯度为0.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL和2ng/raL的加替沙星溶液50#L/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育2-4小时，洗漆。(4)酶标过程于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体(1:1000)100wL/孔,室温孵育1.5小时，洗涤。(5)发光过程于各反应孔中加入IOO^L/孔临时配制的发光液，立即用化学发光免疫分析仪检测。(6)计算过程检测结果以抑制率计算，％抑制率=%B/Bo，B是加入竞争者的发光值，Bo是没有竞争者的发光值。以加替沙星的浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到工作曲线(图2)。实施例3、本发明的检测加替沙星的化学发光酶联免疫试剂盒的组装(1)检测加替沙星的化学发光酶联免疫试剂盒的组成a、包被有包被抗原(AOZ与卵清蛋白的偶联物)的固相载体(乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板)；b、加替沙星抗体工作液(体积比浓度为1:4000);c、加替沙星标准溶液6瓶，浓度分别为O.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL禾口2ng/mL;d、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(工作浓度为1:1000);e浓縮磷酸盐缓冲溶液是每升含NaC180g、KH2PO42.0g、Na2HPO4.12H2O29.0g、KC12.0g的水溶液；f浓縮洗涤液是上述浓縮磷酸盐缓冲液加入体积比浓度为0.05%的吐温20(Tween20);g、发光液0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液(pH8.8)十体积比浓度为3/10000的HA。(2)酶标板的制备将包被抗原溶于包被液中，配成5ug/mL的溶液，酶标板的每孔加入100iiL，4'C孵育过夜，倾去包被液，每孔加入280uL洗涤液洗涤3次，拍干，然后加入250uL/孔的封闭液,37'C孵育2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封在4'C下保存。实施例4、本发明的加替沙星的酶联免疫试剂盒的测定程序(一)试剂盒使用的注意事项1)使用之前将所有试剂温度升至室温，使用后立刻将所有试剂放回冰箱，4'C下保存。2)在使用过程中务必不能让微孔干燥。3)按照推荐的洗板顺序操作。4)使用中避免光线直射,在孵育过程中用锡箔纸遮光。(二)试剂的准备1)样品稀释液将试剂盒中提供的浓縮磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。2)洗涤液将试剂盒中提供的浓縮洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。3)发光液0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(体积比)H202。(三)样品前处理(1)水样将水样经过0.45um的滤膜抽滤，然后加入体积比浓度为0.05%的吐温-20。得到待测样品。(2)牛奶将牛奶样品在4'C、10000转/分钟离心15分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。(3)尿样将尿样品在4°C，10000转/分钟离心15分钟，去掉沉淀，将剩余的猪尿用洗涤液稀释成1:10。得到待测样品。(4)动物组织取样品与4mL0.1M的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20rnin，然后10000转/分钟离心15min，取上清液用10MNaOH调pH至9.5±0.5，旋涡振荡5min，然后10000转/分钟离心15min。取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000转/分钟离心10min，分出有机相，水相再用异丁醇(每次lOmL)萃取两次，三次萃取的有机相合并在一起，50-6CTC水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成l:IO的溶液，得到待测样品。(四)检测步骤1)加样向酶标板中加入50yL/孔的加替沙星系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入加替沙星抗体工作液50yL/孔，室温(25°C)恒温孵育2.5h;2)洗涤倾出孔中液体，向酶标板中加入280yL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；3)加酶标二抗每孔加入酶标二抗工作液100uL，室温恒温孵育1.5h;4)洗涤倾出孔中液体，向酶标板中加入280yL/孔的洗漆液，静置5min后拍干，重复三次；5)加发光液每孔加入发光液100nL;6)检测用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。(五)结果判断以所测得的标准品发光值，除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(B/BO)，以抑制率为纵坐标，加替沙星浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。%抑制率二％标准品发光值(或样品)/0标准品发光值。实施例5试剂盒特异性的试验判定试剂盒特异性的指标是交叉率，将加替沙星以及其他沙星类药物配成浓度梯度，用试剂盒测定各药物的ICs。值，每个药物4个复孔，结果列于下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例6试剂盒精密度和准确度试验取0.05，0.1，0.2，0.5，1，2ppb的加替沙星标样，添加到水样品中，来检测加替沙星回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上述测定结果看，变异系数低于19%，回收率在83-113%之间。表明本试剂盒的回收率比较吻合理论值，有着可靠的准确度；而且变异系数较小，重复性好。9添加浓度(ppb)批内回收率检测结果变异回收率系数(ppb)(%)(%)批间回收率检测结果变异回收率系数(ppb)(%)(%)检测次数检测次数权利要求1、一种加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由加替沙星与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括加替沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、加替沙星系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。2、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。3、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述包被抗原浓度为5//g/mL。4、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述卵清蛋白的分子量范围是6.7KDa6.8KDa。5、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述加替沙星的多克隆抗体是由加替沙星与分子量范围是6.7KDa6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述加替沙星的多克隆抗体的工作浓度为1:4000。6、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度为1:1000。7、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述加替沙星系列标准溶液浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL禾口2ng/mL。8、根据权利要求l所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述浓縮磷酸盐缓冲液是每升含NaCl80g、KH2P042.0g、Na2HP04.12H2029.0g、KCl2.0g的水溶液。9、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述浓縮洗涤液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。10、根据权利要求1所述加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述发光液是0.01M鲁米诺与pH=8.8、O.OOIM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比浓度为3/10000&02的混合液。全文摘要本发明公开了一种加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其中所述酶标板的各孔包被有包被抗原，包被抗原由加替沙星与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括加替沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、加替沙星系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。本发明的试剂盒具有灵敏度高、重复性好、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级，有望在动物源性食品(如奶样、动物组织样)和尿样的加替沙星残留检测中发挥重要作用。文档编号G01N21/76GK101403752SQ20081015863公开日2009年4月8日申请日期2008年11月4日优先权日2008年11月4日发明者锴丁,伟刘,刘中秋,尹伟伟,李伟华,郗日沫申请人:山东大学