光波导型传感器芯片及其制造方法、物质的测定方法、物质测定用试剂盒以及光波导型传感器的制作方法

专利名称：光波导型传感器芯片及其制造方法、物质的测定方法、物质测定用试剂盒以及光波导型传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及光波导型传感器芯片、光波导型传感器芯片的制造方法、 物质的测定方法、物质测定用试剂盒以及光波导型传感器。
背景技术：
现有的利用抗原抗体反应的免疫测定通常将与被测定样品中的蛋白质 等对应的一次抗体固定化在孔状的基材表面。向孔内分别依次滴加规定量 的被测定样品溶液、二次抗体液、显色试剂。各溶液的每次滴加都要分别 进行规定的洗涤液洗涤。这样的免疫测定都需要测定者以一次次地称量、 添加和排出之类的复杂的过程来进行。在这样的免疫测定中，被测定样品
的容量至少需要5mL 25^L左右。
另一方面，本申请人在已申请的专利文献1中的最小必需的被测定样 品的量为1^iL的基础上，公开了即使被测定样品的容量不正确，也可进行 被测定样品的测定对象物质的浓度测定的浓度测定方法，和传感器芯片。
专利文献l: WO2005/022155
但是，在现有的免疫测定系统中， 一次抗体与被测定样品的反应、被 测定样品与二次抗体的反应都分别需要一个小时左右，除此之外，还需要 经过前文所述的复杂的过程，因此存在从被测定样品的采集到获得测定结 果需要几个小时的问题。此外，由于需要的被测定样品的量多，因此在使 用例如大鼠等小动物的血液检査中，为了 1次进行几个种类的检查项目就 需要牺牲1个样品。其结果是难以检查同一样品的随时间的变化。

发明内容
本发明对上述专利文献1的发明进行了进一步的改良，提供以更少的 被测定样品量、在更短的时间内、可定量测定被测定样品的测定对象物质的光波导型传感器芯片、光波导型传感器芯片的制造方法、物质的测定方 ^^以及物质测定用试剂盒、光波导型传感器。
根据本发明的第l方式，提供一种光波导型传感器芯片，其特征在于， 其具有
在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；
和，
分散在上述光波导上、并固定化有与上述测定对象物质特异性反应的 第2物质的微粒。
根据本发明的第2方式，提供一种光波导型传感器芯片，其特征在于，
其具有
在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导； 与上述光波导相向配置的支撑板；禾口，
分散于上述支撑板的与上述光波导相向的表面、并固定化有与上述测
定对象物质特异性反应的第2物质的微粒。
根据本发明的第3方式，提供一种光波导型传感器芯片的制造方法，
其特征在于，包括下述步骤
将与测定对象物质特异性反应的第1物质固定化于光波导表面； 将含有固定化有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒的
浆料涂布于上述光波导上；禾口，
在上述涂布后干燥，将上述微粒分散于上述光波导上。 根据本发明的第4方式，提供一种光波导型传感器芯片的制造方法，
其特征在于，包括下述步骤
将与测定对象物质特异性反应的第1物质固定化于光波导表面； 将含有固定化有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒的
浆料涂布于支撑板表面；
在上述涂布后干燥，将上述微粒分散于上述支撑板；禾口， 将上述支撑板按照使其微粒分散面与上述光波导相向的方式隔开一定
距离地配置。
根据本发明的第5方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，包 括下述歩骤
准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导，和分散在上述光 波导上、且固定化有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒；
向上述传感器芯片的光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波导表面 的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反应，同 时使上述测定对象物质与分散在上述光波导上的微粒的第2物质之间发生 特异性反应；禾口
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于上述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
根据本发明的第6方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，包 括下述步骤
准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定 化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；
向上述传感器芯片的光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波导表面 的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反应；
洗涤上述光波导表面；
向上述光波导表面滴加固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性 反应的第2物质的微粒的分散液，使被测定样品溶液的测定对象物质与微 粒的第2物质之间发生特异性反应；和，
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于光波导表面的微粒所产 生的光学变化。
根据本发明的第7方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，包 括下述步骤
准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定 化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；
预先混合被测定样品溶液和固定化有与被测定样品的测定对象物质特 异性反应的第2物质的微粒，使微粒的第2物质与被测定样品溶液的测定 对象物质发生特异性反应；
向上述传感器芯片的光波导表面滴加上述混合液，使上述光波导表面 的第1物质与已与微粒的第2物质反应的被测定样品溶液的测定对象物质 进行特异性反应；和，
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于上述光波导表面的微粒所产生的光学变化。
根据本发明的第8方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，包
括下述步骤
准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定 化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；
向上述传感器芯片的光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波导表面 的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反应；
向上述光波导表面滴加固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性 反应的第2物质的微粒的分散液，使上述测定对象物质和微粒的第2物质 之间发生特异性反应；和，
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于上述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
根据本发明的第9方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，包
括下述步骤
准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定 化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；
向上述传感器芯片的光波导表面滴加固定化有与被测定样品的测定对
象物质特异性反应的第2物质的微粒的分散液；
向滴加有上述分散液的上述光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波 导表面的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反
应，同吋使上述测定对象物质与上述分散液中的微粒的第2物质之间发生 特异性反应；和，
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
根据本发明的第10方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，包 括下述步骤
准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固 定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导，与上述光波导相 向配置的支撑板，和分散于上述支撑板的与上述光波导相向的表面、且固 定化有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒；
向上述传感器芯片的光波导和上述支撑板之间注入被测定样品溶液，使光波导表面的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特 异性反应，同时使上述测定对象物质与分散于上述支撑板的微粒的第2物 质之间发生特异性反应；和
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
根据本发明的第ll方式，提供一种物质测定用试剂盒，其特征在于， 其组合有光波导型传感器芯片和包装体，
所述光波导型传感器芯片具有光波导和盖，所述光波导在表面上固定 化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质，所述盖配置于 所述光波导表面，在与所述光波导表面之间具有用于形成测定区的凹部， 并开口有与该测定区连通的导入孔和排出孔；
所述包装体收纳有固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应 的第2物质的微粒的分散液。
根据本发明的第12方式，提供一种物质的测定方法，其特征在于，其 中使用上述物质测定用试剂盒，并包括下述步骤
将被测定样品溶液经由光波导型传感器芯片盖的导入孔滴加到测定区 内的光波导表面，使固定化于光波导表面的第1物质与被测定样品溶液的
测定对象物质发生特异性反应；
将微粒的分散液经由上述盖的导入孔导入到测定区内的光波导表面， 同时，在将被测定样品溶液经由排出孔排出的期间，使已发生特异性反应
的被测定样品溶液的测定对象物质与微粒的第2物质之间发生特异性反应； 和，
检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于光波导表面的微粒所产 生的光学变化。
根据本发明的第13方式，提供一种光波导型传感器，其特征在于，其 具有
光波导型传感器芯片，其具有在表面上固定化有与测定对象物质特
异性反应的第i tr质的光波导，和分散在所述光波导上、且固定化有与所
述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒；
使光入射到上述光波导的光源；禾口，
接收从上述光波导射出的光的受光元件。根据本发明的第14方式，提供一种光波导型传感器，其特征在于，其
具有
光波导型传感器芯片，其具有在表面上固定化有与测定对象物质特 异性反应的第1物质的光波导，与所述光波导相向配置的支撑板，以及分 散于所述支撑板的与所述光波导相向的表面、且固定化有与所述测定对象 物质特异性反应的第2物质的微粒；
使光入射到上述光波导的光源；禾口，
接收从上述光波导射出的光的受光元件。
根据本发明，能够提供可以更少的被测定样品量、在更短的时间内、 定量测定被测定样品的测定对象物质的光波导型传感器、光波导型传感器 芯片的制造方法和光波导型传感器。
另外，根据本发明，能够提供可以更少的被测定样品量、在更短的时 间内、定量被测定样品的测定对象物质的物质的测定方法。
进而，根据本发明，能够提供可以更少的被测定样品量、在更短的时 间内、定量测定被测定样品的测定对象物质的物质测定用试剂盒。


图1是表示具有第1实施方式的光波导型传感器芯片的光波导型传感 器的截面图。
图2是表示第1实施方式的被测定样品的测定对象物质的测定工序的 概略图。
图3表示具有第2实施方式的光波导型传感器芯片的光波导型传感器 的截面图。
图4表示第2实施方式的物质的测定工序的概略图。 图5表示第3实施方式的物质的测定方法中使用的光波导型传感器芯 片的截面图。
图6表示第3实施方式的物质的测定工序的概略图。 图7表示第4实施方式的物质的测定工序的概略图。 图8表示第5实施方式的物质测定用试剂盒的光波导型传感器芯片的 截面图。
图9表示第5实施方式的物质的测定工序的概略图。图IO表示在实施例1的胰岛素的浓度测定中随着时间推移激光光强度 变化的特征图。
图11表示在实施例2的胰岛素的浓度测定中随着时间推移激光光强度 变化的特征图。
图12表示在实施例3的胰岛素的浓度测定中随着时间推移激光光强度 变化的特征图。
图13表示在实施例4的胰岛素的浓度测定中随着时间推移激光光强度 变化的特征图。 符号说明
1、 31 玻璃基板 2a、 2b、 32a、 32b 光栅 3、 33 平面光波导 5 反应孔
11 第l物质
12 第2物质
13 微粒
15 测定对象物质
34 盖
35 测定区
37 导入孔
38 排出孔
具体实施例方式
下面，作为本发明实施方式，详细说明光波导型传感器、光波导型传 感器芯片的制造方法、物质的测定方法、物质测定用试剂盒和光波导型传 感器。
(第1实施方式)
第1实施方式的光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定 对象物质特异性反应的第1物质的光波导，和分散于该光波导、并固定化 有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒。这里，测定对象物质例如可列举出血液、血清、血浆、生物试样、食 品等中所含的蛋白质、多肽、基因等。具体而言，可列举出胰岛素、酪蛋
白、P-乳球蛋白、卵清蛋白、降钙素、C-多肽、瘦蛋白(Ieptin)、 (3-2-微球 蛋白、视黄醇结合蛋白、(x-l-微球蛋白、ct-胎甲球蛋白、癌胚抗原、肌钙蛋 白-I 、胰高血糖素样多肽、胰岛素样多肽、转化生长因子、纤维细胞生长 因子、血小板生长因子、表皮生长因子、皮质醇、三碘甲状腺原氨酸、甲 状腺素等半抗原激素，地高辛、茶碱等药物，细菌、病毒等传染性物质， 肝炎抗体、IgE、以及包括荞麦的主要蛋白质复合体、花生的Arah2等的可 溶性蛋白质等，但不限定于这些。另外，在下面第2实施方式到第5实施 方式中的测定对象物质也使用同样的物质。
光波导例如可使用平面光波导。该平面光波导例如可由酚醛树脂、环 氧树脂等的热固化性树脂或无碱玻璃形成。详细地，这里使用的材料是指 具有规定的光的透射性的材料，特别优选是以聚苯乙烯为主要结构的环氧 树脂等。与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质向平面光波 导的固定化，例如在利用硅烷偶联剂等进行了疏水化处理的表面上通过上 述物质的疏水性相互作用而进行固定化。第1物质例如在被测定样品的测 定对象物质为抗原的情况下，可使用抗体。
这里"微粒被分散于光波导"是指微粒直接或间接地被分散于光波导 表面。"微粒被间接地分散于光波导表面"的方式例如可列举出微粒介由封 闭层而被分散于光波导表面的方式。封闭层例如含有聚乙烯醇、牛血清白 蛋白(BSA)、聚乙二醇、磷脂聚合物、明胶、糖类(例如蔗糖、海藻糖) 等的水溶性物质。封闭层可进一步含有蛋白抑制剂。
微粒例如可使用POLYSTYRENE制的LATEX BEAD (商品名)等的 树脂珠粒或胶体金等的金属胶体、或氧化钛粒子等的无机氧化物粒子。微 粒也可使用白蛋白等的蛋白质、琼脂糖等的多糖类、二氧化硅粒子、碳粒 子等的非金属粒子。特别优选LATEX BEAD、金属胶体。LATEX BEAD中， 当在后述光波导中传导的光为红色激光时，优选蓝色LATEX BEAD。
微粒优选具有50nm 10jim的直径。
第2物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用 抗体。
下面，说明第1实施方式的光波导型传感器芯片的制造方法。首先，将与测定对象物质特异性反应的第1物质固定化到光波导表面 上。接着，通过例如物理吸附或者介由羧基或氨基等的化学键将与被测定
样品的测定对象物质特异性反应的第2物质固定化到微粒上。然后，将固 定化有第2物质的微粒分散在含有水溶性物质的生理盐水中，以制备浆料。 将该浆料涂布到光波导后干燥，将上述微粒分散到上述光波导上，从而制 造光波导型传感器芯片。
在这样的制造方法中，水溶性物质例如可使用聚乙烯醇、牛血清白蛋 白(BSA)、聚乙二醇、磷脂聚合物、明胶、糖类(例如蔗糖、海藻糖)。 此外，为了提高微粒的分散性，干燥优选冷冻干燥。
参照图1具体地说明第1实施方式的光波导型传感器芯片。图1是表 示第1实施方式的光波导型传感器芯片的截面图。
在玻璃基板1的主平面的两端部设置入射侧光栅2a和射出侧光栅2b。 这些光栅2a、 2b例如可由氧化钛(Ti02)、氧化锡(Sn02)、氧化锌、铌酸 锂、砷化镓(GaAs)、铟锡氧化物(ITO)、聚酰亚胺等形成。例如由热固 化性树脂构成的平面光波导3在包含光栅2a、 2b的基板1主平面上形成。 低折射率树脂膜4覆盖在平面光波导3上。低折射率树脂例如可使用市售 的旭硝子株式会社制的CYTOP (注册商标)的聚(全氟丁烯基乙烯基醚)等。 在低折射率树脂膜4上开口，以使位于光栅2a、 2b之间的平面光波导3的 一部分露出，例如形成长方形的反应孔5。框状的槽壁6按照包围使平面光 波导3露出的反应孔5的方式形成在低折射率树脂膜4上。
与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质11，通过例如利 用硅垸偶联剂的疏水化处理而固定化到从反应孔(测定区)5露出的平面光 波导3表面上。固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2 物质12的微粒13被分散到固定化有上述物质11的平面光波导3表面上。 该微粒13的分散例如通过将含有微粒和水溶性物质的浆料涂布到平面光波 导3上并冷冻干燥而形成。
第1实施方式的光波导型传感器具有用于使光从上述光波导型传感 器芯片的入射侧光栅2a入射到平面光波导3的光源(例如红色激光二极管) 21，和接收从射出侧光栅2b射出的光的受光元件(例如光电二极管)22。
下面，参照图2 (A) (C)说明使用上述光波导传感器进行物质测 定的方法。首先，准备图2 (A)所示的光波导型传感器芯片。该传感器芯片包括
具有光栅2a、 2b的基板1。平面光波导3在包含光栅2a、 2b的基板1主平 面上形成。低折射率树脂4覆盖在平面光波导3上，并按照使位于光栅2a、 2b之间的平面光波导3的一部分露出的方式开口，例如形成长方形的反应 孔5。与被测定样品的测定对象物质(例如抗原)特异性反应的第1物质(例 如第l抗体)11被固定化到从反应孔5露出的平面光波导3表面上。固定 化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2物质(例如第2抗体) 12的多个微粒13被分散在平面光波导3上。
接着，向包括反应孔5内的上述微粒13的分散区域的平面光波导3表 面滴加被测定样品溶液。此时，若滴加的被测定样品溶液中不存在与平面 光波导3表面的第1抗体11和与微粒13的第2抗体12发生特异性反应的 抗原，则如图2 (B)所示，微粒13的第2抗体12没有与平面光波导3表 面的第1抗体11结合，而是分散在被测定样品溶液14中。在此状态下， 使来自红色激光二极管21的红色激光从入射侧光栅2a入射到平面光波导 3，即使在该平面光波导3中传导而在表面(反应孔5处的露出表面)附近 发出瞬逝光(evanescent light)，由于反应孔5内的被测定样品溶液14中的 微粒13分散，微粒13在瞬逝光区域内也几乎不存在。也就是说，微粒13 与瞬逝光的吸收或散射基本无关，因此也几乎不发生瞬逝光的强度的衰减。 其结果是，从射出侧光栅2b射出的红色激光在光电二极管22处接收光时， 其激光光强度几乎没有变化。
另一方面，若滴加的被测定样品溶液14中存在抗原，则如图2 (C) 所示，抗原15与平面光波导3表面的第1抗体11发生抗原抗体反应而结 合，进而微粒13的第2抗体12与抗原15发生抗原抗体反应而结合。艮P， 在平面光波导3表面的第1抗体11与微粒13的第2抗体12之间介由抗原 15发生抗原抗体反应，因此微粒13被固定化到平面光波导3表面上。
在上述被测定样品溶液刚滴加后，使来自红色激光二极管21的红色激 光从入射侧光栅2a入射到平面光波导3上，如果在该平面光波导3中传导 而在表面(反应孔5处的露出表面)附近发出瞬逝光，则由于微粒13被固 定化在平面光波导3表面上，因此微粒13在瞬逝光区域内存在。也就是说， 微粒13与瞬逝光的吸收或散射相关，因此发生瞬逝光的强度的衰减。其结 果是，从射出侧光栅2b射出的红色激光在光电二极管22处接收光时，其激光光强度由于固定化的微粒13的影响而随着时间降低。
在光电二极管22处接收的激光光强度的降低率与固定化于平面光波导 3表面的微粒13的量、即与抗原抗体反应相关的被测定样品溶液14中的抗 原浓度成比例。因此，制作在抗原浓度已知的被测定样品溶液中随着时间 推移激光光强度的降低曲线，求出该曲线在规定时间处激光光强度的降低 率，预先制作表示抗原浓度与激光光强度的降低率之间关系的标准曲线。 从用上述方法测定的时间和激光光强度的降低曲线求出在规定时间处激光 光强度的降低率，将该激光光强度的降低率与上述标准曲线对照，从而能 够测定被测定样品溶液中的抗原浓度。
另外，在上述浓度测定中通过使微粒与水溶性物质共同分散于平面光 波导，从而提高微粒的分散性。此外，向平面光波导滴加被测定样品溶液 时，与微粒共存的水溶性物质溶解，使得微粒能够移动，从而能够使被测 定样品溶液中的测定对象物质与微粒的第2物质的反应顺利进行。
以上，根据第1实施方式，能够提供最小必需的被测定样品量少(例 如10pL以下)，且通过将被测定样品滴加到测定区的一次操作即可对被测 定样品的测定对象物质的浓度进行定量的光波导型传感器芯片，其制造方 法以及光波导型传感器。
此外，根据第1实施方式，能够提供最小必需的被测定样品量少(例 如10pL以下)，且将被测定样品滴加到测定区的一次操作即可对被测定样 品的测定对象物质的浓度进行定量的物质的测定方法。
(第2实施方式)
第2实施方式的光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定 对象物质特异性反应的第1物质的光波导，与该光波导相向配置的支撑板， 以及分散于该支撑板的与上述光波导相向的表面、并固定化有与上述测定 对象物质特异性反应的第2物质的微粒。
光波导例如可使用平面光波导。该平面光波导与第1实施方式中说明 的同样，可由热固化性树脂或无碱玻璃形成。
将与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质用第1实施方 式中说明的同样的方法固定化到平面光波导上。第1物质例如在被测定样 品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用抗体。微粒与第1实施方式中说明的同样，例如可使用LATEXBEAD等的树 脂珠粒或胶体金等的金属胶体、或氧化钛粒子等的无机氧化物粒子等。微 粒也可使用白蛋白等的蛋白质、琼脂糖等的多糖类、二氧化硅粒子、碳粒 子等的非金属粒子。特别优选LATEX BEAD、金属胶体。微粒优选具有50nm 10,的直径。
第2物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用 抗体。
下面，说明第2实施方式的光波导型传感器芯片的制造方法。
首先，将与测定对象物质特异性反应的第1物质固定化到光波导表面 上。接着，通过例如物理吸附或者介由羧基或氨基等的化学键将与被测定 样品的测定对象物质特异性反应的第2物质固定化到微粒上。然后，将固 定化有第2物质的微粒分散到含有水溶性物质的生理盐水中，以制备衆料。 将该浆料涂布到支撑板表面后干燥，将上述微粒分散到支撑板上。其后， 通过将支撑板按照使其微粒分散面与光波导相向的方式隔开一定距离地配 置，从而制造光波导型传感器芯片。
在这样的制造方法中，水溶性物质例如可使用聚乙烯醇、牛血清白蛋 白(BSA)、聚乙二醇、磷脂聚合物、明胶、糖类(例如蔗糖、海藻糖)。 此外，为了提高微粒的分散性，干燥优选冷冻干燥。
参照图3具体地说明第2实施方式的光波导型传感器。图3是表示第2 实施方式的光波导型传感器芯片的截面图。
在玻璃基板1的主平面的两端部设置例如由氧化钛构成的入射侧光栅 2a和射出侧光栅2b。例如由热固化性树脂构成的平面光波导3在包含光栅 2a、 2b的基板1主平面上形成。低折射率树脂4覆盖在平面光波导3上。 在低折射率树脂膜4上开口，以使位于光栅2a、 2b之间的平面光波导3的 一部分露出，例如形成长方形的反应孔5。例如由合成树脂构成的支撑板7 在低折射率树脂膜4上按照覆盖反应孔5的方式形成。被测定样品溶液的 滴加用孔(未图示)从支撑板7表面向着反应孔5贯穿地设置。
与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质11，通过例如利 用硅垸偶联剂的疏水化处理而固定化在从反应孔5 (测定区)露出的平面光
波导3表面上。固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2 物质12的微粒13被分散到向反应孔5露出、且与平面光波导3相向的支撑板7表面(下表面)上。该微粒13的分散例如通过将含有微粒和水溶性
物质的浆料涂布于上述支撑板表面并冷冻干燥而形成。
第2实施方式的光波导型传感器具有用于使光从上述光波导型传感
器芯片的入射侧光栅2a入射到平面光波导3的光源(例如红色激光二极管) 21，和接收从射出侧光栅2b射出的光的受光元件(例如光电二极管)22。 下面，参照图4 (A) (C)说明使用上述光波导传感器进行物质测 定的方法。
首先，准备图4 (A)所示的光波导型传感器芯片。该传感器芯片包括 具有光栅2a、 2b的基板1 。平面光波导3在包含光栅2a、 2b的基板1主平 面上形成。低折射率树脂4覆盖在平面光波导3上，并按照使位于光栅2a、 2b之间的平面光波导3的一部分露出的方式开口，例如形成长方形的反应 孔5。与被测定样品的测定对象物质(例如抗原)特异性反应的第1物质(例 如第1抗体)11被固定化在从反应孔5露出的平面光波导3表面上。支撑 板7在低折射率树脂膜4上按照覆盖反应孔5的方式形成。固定化有与被 测定样品的测定对象物质特异性反应的第2物质(例如第2抗体)12的多 个微粒13被分散到向反应孔5露出的支撑板7下表面上。
接着，经由被测定样品溶液的滴加用孔(未图示)向反应孔5内滴加 被测定样品溶液。此时，若滴加的被测定样品溶液中不存在与平面光波导3 表面的第1抗体11和与微粒13的第2抗体12发生特异性反应的抗原，则 如图4 (B)所示，微粒13的第2抗体12没有与平面光波导3表面的第1 抗体11结合，而是分散在被测定样品溶液14中。在此状态下，使来自红 色激光二极管21的红色激光从入射侧光栅2a入射到平面光波导3，即使在 该平面光波导3中传导而在表面(反应孔5处的露出表面)附近发出瞬逝 光，由于微粒13分散在被测定样品溶液14中，因此微粒13在瞬逝光区域 内几乎不存在。也就是说，微粒13与瞬逝光的吸收或散射基本无关，因此 几乎不发生瞬逝光的强度的衰减。其结果是，从射出侧光栅2b射出的红色 激光在光电二极管22处接收光时，其激光光强度几乎没有变化。
另一方面，若滴加的被测定样品溶液14中存在抗原，则如图4 (C) 所示，抗原15与平面光波导3表面的第1抗体11发生抗原抗体反应而结 合，进而微粒13的第2抗体12与抗原15发生抗原抗体反应而结合。艮P， 在平面光波导3表面的第1抗体11与微粒13的第2抗体12之间介由抗原15发生抗原抗体反应，因此微粒13被固定化到平面光波导3表面上。
在上述被测定样品溶液刚滴加后，使来自红色激光二极管21的红色激 光从入射侧光栅2a入射到平面光波导3，如果在该平面光波导3中传导而 在表面(反应孔5处的露出表面)附近发出瞬逝光，则由于微粒13被固定 化到平面光波导3表面上，因此微粒13在瞬逝光区域内存在。也就是说， 微粒13与瞬逝光的吸收或散射相关，因此发生瞬逝光的强度的衰减。其结 果是，从射出侧光栅2b射出的红色激光在光电二极管22处接收光时，其 激光光强度由于固定化的微粒13的影响而随着时间降低。
在光电二极管22处接收的激光光强度的降低率与固定化于平面光波导 3表面的微粒13的量、即与抗原抗体反应相关的被测定样品溶液14中的抗 原浓度成比例。因此，制作在抗原浓度己知的被测定样品溶液中随着时间 推移激光光强度的降低曲线，求出该曲线在规定时间处的激光光强度的降 低率，预先制作表示抗原浓度与激光光强度的降低率之间的关系的标准曲 线。从用上述方法测定的时间和激光光强度的降低曲线求出在规定时间处 激光光强度的降低率，将该激光光强度的降低率与上述标准曲线对照，从 而能够测定被测定样品溶液中的抗原浓度。
另外，在上述浓度测定中，通过使微粒与水溶性物质共同分散在平面 光波导上，从而提高微粒的分散性。此外，向平面光波导滴加被测定样品 溶液时，与微粒共存的水溶性物质溶解，使得微粒能够移动，从而能够使 被测定样品溶液中的测定对象物质与微粒的第2物质的反应顺利进行。
以上，根据第2实施方式，能够提供最小必需的被测定样品量少(例 如10pL以下)，且通过将被测定样品滴加到测定区的一次操作即可对被测 定样品的测定对象物质的浓度进行定量的光波导型传感器芯片，其制造方 法以及光波导型传感器。
此外，根据第2实施方式，能够提供最小必需的被测定样品量少(例 如10pL以下)，且通过将被测定样品滴加到测定区的一次操作即可对被测 定样品的测定对象物质的浓度进行定量的物质的测定方法。
(第3实施方式)
以下说明第3实施方式的物质的测定方法。
首先，准备光波导型传感器芯片，其具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导。接着，向光波导表面滴加被测定 样品溶液，使光波导表面的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质 之间发生特异性反应。接着，洗涤光波导表面。然后，向光波导表面滴加 固定化有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒的分散液，使 被测定样品溶液的测定对象物质与微粒的第2物质之间发生特异性反应； 其后，通过检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于光波导表面的微 粒所产生的光学变化，从而测定被测定样品溶液中的测定对象物质的浓度。 光波导例如可使用平面光波导。该平面光波导与第1实施方式中说明 的同样，可由热固化性树脂或无碱玻璃形成。将与被测定样品的测定对象 物质特异性反应的第1物质用第1实施方式中说明的同样的方法固定化到 平面光波导上。第1物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况 下，可使用抗体。
洗涤例如可使用由组合有缓冲液和表面活性剂等的溶液、含有表面活
性剂的磷酸缓冲生理盐水(PBS)、 Tris-盐酸缓冲生理盐水、Good buffer缓 冲生理盐水、磷酸缓冲液等组成的洗涤液来进行。
微粒与第1实施方式中说明的同样，例如可使用LATEXBEAD等的树
脂珠粒或胶体金等的金属胶体、或氧化钛粒子等的无机氧化物粒子等。微 粒也可使用白蛋白等的蛋白质、琼脂糖等的多糖类、二氧化硅粒子、碳粒 子等的非金属粒子。特别优选LATEX BEAD、金属胶体。微粒优选具有50nm 10[im的直径。
将第2物质用与第1实施方式中说明的同样的方法固定化到微粒上。 第2物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用抗体。
微粒的分散液包括在含有例如磷酸、三羟甲基氨基甲烷、硼酸、乙 酸、柠檬酸、碳酸等的缓冲液或者Good buffer中添加牛血清白蛋白(BSA)、 酪蛋白、聚乙二醇等稳定剂、Tween、 Triton-X等非离子表面活性剂而成的 溶液，或磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。
参照图5所示的光波导型传感器芯片和图6 (A) (C)来具体说明 第3实施方式的物质的测定方法。
首先，准备图5和6 (A)所示的光波导型传感器芯片。该传感器芯片 除了不具有第1实施方式中说明的图1的微粒的分散层以外，具有同样的 结构。也就是说，包括具有光栅2a、 2b的基板l。平面光波导3在包含光栅2a、 2b的基板1主平面上形成。低折射率树脂4覆盖在平面光波导3上、 并按照使位于光栅2a、 2b之间的平面光波导3的一部分露出的方式开口， 例如形成长方形的反应孔5。与被测定样品的测定对象物质(例如抗原)特 异性反应的第1物质(例如第1抗体)11被固定化在从反应孔5露出的平 面光波导3表面上。在图5中，为了测定位于反应孔5的平面光波导3处 的瞬逝光的变化，设置使光入射到入射侧光栅2a的激光振荡器(例如红色 激光二极管)21，并设置接收从射出侧光栅2b射出的光的光电转换元件(光 电二极管)22。
接着，向反应孔5内滴加被测定样品溶液。此时，如图6 (B)所示， 滴加的被测定样品溶液中的抗原15与平面光波导3表面的第i抗体11发 生抗原抗体反应而结合。
然后，进行洗涤处理以冲洗掉未与平面光波导3表面的第1抗体11反 应的抗原15。接着，向反应孔5内滴加固定化有与测定对象物质即抗原特 异性反应的第2物质(例如第2抗体)的微粒的分散液。此时，如图6 (C) 所示，在分散液16中，已与平面光波导3表面的第1抗体11发生抗原抗 体反应的测定对象物质即抗原15与微粒13的第2抗体12发生抗原抗体反 应而结合。也就是说，平面光波导3表面的第1抗体11与微粒13的第2 抗体12之间介由抗原15发生抗原抗体反应，从而微粒13被固定化到平面 光波导3表面。
微粒的分散液刚滴加后，使来自红色激光二极管21的红色激光从入射 侧光栅2a入射到平面光波导3，如果在该平面光波导3传导中而在表面(反 应孔5处的露出表面)附近发出瞬逝光，则由于微粒13被固定化到平面光 波导3表面上，因此微粒13在瞬逝光区域内存在。也就是说，微粒13与 瞬逝光的吸收或散射相关，因此发生瞬逝光的强度的衰减。其结果是，从 射出侧光栅2b射出的红色激光在光电二极管22处接收光时，其激光光强 度由于固定化的微粒13的影响而随着时间降低。
在光电二极管22处接收的激光光强度的降低率与固定化于平面光波导 3表面的微粒13的量、即与抗原抗体反应相关的被测定样品溶液14中的抗 原浓度成比例。因此，制作在抗原浓度已知的被测定样品溶液中随着时间 推移激光光强度的降低曲线，求出该曲线在规定时间处的激光光强度的降 低率，预先制作表示抗原浓度与激光光强度的降低率之间的关系的标准曲线。从用上述方法测定的时间和激光光强度的降低曲线求出在规定时间处 的激光光强度的降低率，将该激光光强度的降低率与上述标准曲线对照， 从而能够测定被测定样品溶液中的抗原浓度。
以上，根据第3实施方式，能够提供最小必需的被测定样品量少(例
如10pL以下)，且通过被测定样品溶液滴加到测定区、洗涤以及微粒分散 液滴加到测定区的3次操作即可对被测定样品的测定对象物质的浓度进行 定量的被测定样品的测定对象物的测定方法。
特别是，第3实施方式中，由于被测定样品溶液滴加到测定区后进行 洗涤，因此在被测定样品溶液的测定对象物质(例如抗原)的浓度高的情 况下，是有效的。
(第4实施方式)
以下说明第4实施方式的物质的测定方法。
首先，准备光波导型传感器芯片，其具有在表面上固定化有与测定对 象物质特异性反应的第1物质的光波导。首先，将被测定样品溶液和固定 化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒在例如微 管的容器内混合，使微粒的第2物质与被测定样品溶液的测定对象物质之 间发生特异性反应。接着，将上述混合液滴加到上述传感器芯片的光波导 表面，使光波导表面的第1物质与己与微粒的第2物质反应的被测定样品 溶液的测定对象物质发生特异性反应。然后，通过检测介由第1物质和测 定对象物质而固定化于光波导表面的微粒，即固定化于光波导表面的微粒 所产生的光学变化，从而测定被测定样品溶液中的测定对象物质的浓度。
光波导例如可使用平面光波导。该平面光波导与第1实施方式中说明 的同样，可由热固化性树脂或无碱玻璃形成。将与被测定样品的测定对象 物质特异性反应的第1物质用第1实施方式中说明的同样的方法固定化到 平面光波导上。第1物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况 下，可使用抗体。
微粒与第i实施方式中说明的同样，例如可使用LATEXBEAD等的树 脂珠粒或胶体金等的金属胶体、或氧化钛粒子等的无机氧化物粒子等，特 另U优选LATEX BEAD、金属胶体。
微粒优选具有50nm 10pm的直径。将第2物质用与第1实施方式中说明的同样的方法固定化到微粒上。
第2物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用抗体。
将微粒分散于在含有例如磷酸、三羟甲基氨基甲烷、硼酸、乙酸、拧 檬酸、碳酸等的缓冲液或Good buffer中添加牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、 聚乙二醇等稳定剂、Tween、 Triton-X等非离子表面活性剂而成的溶液，或 者磷酸缓冲生理盐水(PBS)等中，可制备微粒的分散液。
在被测定样品溶液和固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反 应的第2物质的微粒的混合中，微粒可以为分散液的状态，也可以为固体 (例如干固物、冻结物或粉末)的状态。具体而言，预先制备微粒的分散 液，然后该分散液与被测定样品溶液在例如微管的容器内混合。此外，在 将被测定样品溶液和固定化有第2物质的微粒在例如微管的容器内混合时， 也可先向容器内加入含有水溶性物质的微粒的分散液并干燥、例如冷冻干 燥，将微粒通过水溶性物质分散到容器内表面，其后向容器内加入被测定 样品溶液并混合。水溶性物质例如可使用聚乙烯醇、牛血清白蛋白(BSA)、 聚乙二醇、磷脂聚合物、明胶、糖类(例如蔗糖、海藻糖)。
参照上述图5所示的光波导型传感器芯片和图7 (A)、 (B)来具体说 明第4实施方式的测定方法。
首先，如图5和7 (A)所示，准备在从反应孔5露出的平面光波导3 表面上固定化有与被测定样品的测定对象物质(例如抗原)特异性反应的 第1物质(例如第1抗体)11的光波导型传感器。
首先，将被测定样品溶液和固定化有与测定对象物质即抗原特异性反 应的第2物质(例如第2抗体)的微粒的分散液在例如微管内混合，使被 测定样品溶液的抗原与微粒的第2抗体发生抗原抗体反应。
接着，向反应孔5内滴加上述混合液。此时，如图7 (B)所示，混合 液中已与第2抗体发生抗原抗体反应的被测定样品溶液中的抗原15与平面 光波导表面的第l抗体ll发生抗原抗体反应而结合。也就是说，预先已与 微粒13的第2抗体12结合的抗原15与平面光波导3表面的第1抗体11 发生抗原抗体反应而结合，其结果是微粒13被固定化到平面光波导3表面。
在上述被测定样品溶液和微粒的分散液刚滴加后，使来自红色激光二 极管21的红色激光从入射侧光栅2a入射到平面光波导3，如果在该平面光 波导3中传导而在表面(反应孔5处的露出表面)附近发出瞬逝光，则由于微粒13被固定化到平面光波导3表面上，因此微粒13在瞬逝光区域内 存在。也就是说，微粒13与瞬逝光的吸收或散射相关，因此引起瞬逝光的 强度的衰减。其结果是，从射出侧光栅2b射出的红色激光在光电二极管22 处接收光时，其激光光强度由于固定化的微粒13的影响而随着时间降低。
在光电二极管22处接收的激光光强度的降低率与固定化于平面光波导 3表面的微粒13的量、即与抗原抗体反应相关的被测定样品溶液14中的抗 原浓度成比例。因此，制作在抗原浓度已知的被测定样品溶液中随着时间 推移激光光强度的降低曲线，求出该曲线在规定时间处的激光光强度的降 低率，预先制作表示抗原浓度与激光光强度的降低率之间的关系的标准曲 线。从用上述方法测定的时间和激光光强度的降低曲线求出在规定时间处 的激光光强度的降低率，将该激光光强度的降低率与上述标准曲线对照， 从而能够测定被测定样品溶液中的抗原浓度。
以上，根据第4实施方式，能够提供最小必需的被测定样品量少(例 如10pL以下)，且通过将被测定样品溶液和微粒分散液滴加到测定区的1 次操作即可对被测定样品的测定对象物质的浓度进行定量的被测定样品的 测定对象物的测定方法。
另外，在上述第4实施方式中，被滴加到光波导表面的被测定样品溶 液和微粒的分散液预先混合，作为替代，也可以将被测定样品溶液和微粒 的分散液同时滴加到光波导表面。
在上述第4实施方式中，将被测定样品溶液和微粒的分散液混合后滴 加到光波导表面，但也可以是滴加被测定样品溶液后滴加微粒的分散液的 顺序，也可以是滴加微粒的分散液后滴加被测定样品溶液的顺序。不管是 以何种顺序的物质的测定方法，都与第4实施方式同样，能够以最小必需 的被测定样品量少(例如10pL以下)对被测定样品的测定对象物质的浓度 进行定量。
(第5实施方式) 下面说明第5实施方式的物质测定用试剂盒。
物质测定用试剂盒，由组合光波导型传感器芯片和包装体而构成上 述包装体收纳有固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2 物质的微粒的分散液。光波导型传感器芯片具有光波导和盖，所述光波导在表面上固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质， 所述盖配置于该光波导上，具有用于与光波导相向地形成测定区的凹部， 并开口有与该测定区连通的导入孔和排出孔。
将与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质用与第1实施 方式中说明的同样的方法固定化到平面光波导。第1物质例如在被测定样 品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用抗体。
收纳于包装体的微粒与第1实施方式中说明的同样，例如可使用
POLYSTYRENE制的LATEX BEAD等的树脂珠粒或胶体金等的金属胶体、 或氧化钛粒子等的无机氧化物粒子等。微粒也可使用白蛋白等的蛋白质、 琼脂糖等的多糖类、二氧化硅粒子、碳粒子等的非金属粒子。特别优选 LATEX BEAD、金属胶体。微粒优选具有50nm l(Vm的直径。
将第2物质用与第1实施方式中说明的同样的方法固定化到微粒上。 第2物质例如在被测定样品的测定对象物质为抗原的情况下，可使用抗体。
微粒的分散液包括在含有例如磷酸、三羟甲基氨基甲垸、硼酸、乙 酸、柠檬酸、碳酸等的缓冲液或Good buffer中添加牛血清白蛋白(BSA)、 酪蛋白、聚乙二醇等稳定剂、Tween、 Triton-X等非离子表面活性剂而成的 溶液，或者磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。
包装体可以由例如聚乙烯膜或聚乙烯与聚对苯二甲酸乙二醇酯的层叠 膜制作。另外，包装体可使用微管、塑料瓶、玻璃瓶。
参照上述图8的(a)、 (b)具体说明第5实施方式的物质测定用试剂 盒。图8 (a)为表示光波导型传感器芯片的俯视图，图(b)为上述图(a) 的截面图。
在玻璃基板31的主平面的两端部设置例如由氧化钛形成的入射侧光栅 32a和射出侧光栅32b。例如由热固化性树脂构成的平面光波导33在包含 光栅32a、 32b的基板31主平面上形成。由例如丙烯酸树脂制作的盖34按 照覆盖平面光波导33的主平面和侧面的方式配置。另外，这里，盖34的 材料也可用具有规定的低折射率的其它树脂等代替。盖34在与平面光波导 33表面之间具有用于形成例如长方形的测定区35的长方形凹部36。此外， 盖34上开口有从其表面到测定区35的导入孔37和排出孔38。与被测定样 品的测定对象物质特异性反应的第1物质11通过采用硅烷偶联剂的疏水化 处理而固定化到从测定区35露出的平面光波导33表面上。由这样的平面光波导33、盖34等构成光波导型传感器芯片。
固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒 的分散液例如被收纳在聚乙烯制的包装体(未图示)中，与上述光波导型 传感器芯片组合而构成测定用试剂盒。
下面，参照图9 (A) (C)说明使用上述试剂盒进行物质测定的方 法。另外，为了测定从测定区露出的平面光波导处的瞬逝光的变化，设置 使光入射到入射侧光栅32a的激光振荡器(例如红色激光二极管)21，并 设置接收从射出侧光栅32b射出的光的光电转变元件(光电二极管)22。
首先，如图8和图9 (A)所示，准备在从测定区35露出的平面光波 导33表面上固定化有与被测定样品的测定对象物质(例如抗原)特异性反 应的第1物质(例如第1抗体)11的光波导型传感器芯片。
接着，经由导入孔37向测定区35内滴加被测定样品溶液。此时，如 图9 (B)所示，滴加的被测定样品溶液14中的抗原15与平面光波导33 表面的第1抗体11发生抗原抗体反应而结合。
然后，将包装体中的微粒的分散液经由盖34的导入孔37导入到测定 区35内的平面光波导33表面，同时将被测定样品溶液经由排出孔38排出 到外部。在这期间，被测定样品液中的未反应的抗原与分散液一同被冲洗 掉。同时，如图9(C)所示，分散液16中的微粒13的第2抗体12与已 与平面光波导33表面的第1抗体11发生抗原抗体反应的测定对象物质即 抗原15发生抗原抗体反应而结合。也就是说，平面光波导33表面的第1 抗体11与微粒13的第2抗体之间介由抗原15发生抗原抗体反应，从而使 微粒13固定化到平面光波导33表面。
在上述微粒的分散液刚导入后，使来自红色激光二极管21的红色激光 从入射侧光栅32a入射到平面光波导33，在该平面光波导33中传导而在表 面(测定区35处的露出表面)附近发出瞬逝光的情况下，由于分散液16 中的微粒13被固定化到平面光波导33表面上，因此微粒13在瞬逝光区域 内存在。也就是说，微粒13与瞬逝光的吸收或散射相关，因此引起瞬逝光 的强度的衰减。其结果是，从射出侧光栅32b射出的红色激光在光电二极 管22处接收光时，其激光光强度由于固定化的微粒13的影响而随着时间 降低。
在光电二极管22处接收的激光光强度的降低率与平面光波导33表面固定化的微粒13的量、即与抗原抗体反应相关的被测定样品溶液4中的 抗原浓度成比例。因此，制作在抗原浓度已知的被测定样品溶液中随着时 间推移激光光强度的降低曲线，求出该曲线在规定时间处的激光光强度的 降低率，预先制作表示抗原浓度与激光光强度的降低率之间的关系的标准 曲线。从用上述方法测定的时间和激光光强度的降低曲线求出在规定时间 处的激光光强度的降低率，将该激光光强度的降低率与上述标准曲线对照， 从而能够测定被测定样品溶液中的抗原浓度。
以上，根据第5实施方式的物质测定用试剂盒，由于是组合下述部件
而构成的光波导和向测定区滴加被测定样品溶液及导入、排出微粒的分 散液可以进行的结构的光波导型传感器芯片，以及收纳微粒分散液的包装
体，因此能够以最小必需的被测定样品量少(例如lO)iL以下)，且通过将
被测定样品溶液滴加到测定区和将微粒的分散液向测定区导入和从测定区
排出的2次操作中，即可对被测定样品的测定对象物质的浓度进行定量。
特别是，在使用物质测定用试剂盒进行的被测定样品的测定对象物的 测定方法中，在将被测定样品溶液滴加到测定区后进行将微粒的分散液向 测定区导入和从测定区排出，因此在被测定样品溶液的测定对象物质(例 如抗原)的浓度高的情况下，也是有效的。
下面，参照上述附图详细说明本发明的实施例。 (实施例1)
将折射率为2.2 2.4的氧化钛溅射到折射率为1.52的无碱玻璃基板上， 形成厚度为50nm的氧化钛膜，然后利用光刻法和干刻法在玻璃基板1上形 成光栅2a、 2b。接着，将环氧树脂溶液旋涂到包含光栅2a、 2b的玻璃基板 l上，然后通过煅烧形成厚度约为30pm的平面光波导3。煅烧后的平面光 波导3的折射率为1.56。然后，通过将低折射率树脂、市售的旭硝子株式 会社制的CYTOP (注册商标)的聚(全氟丁烯基乙烯基醚)网板印刷到平面 光波导3上，形成开口有长方形的反应孔(测定区)5的低折射率树脂4。
接着，利用硅垸偶联剂将从反应孔5露出的平面光波导3表面疏水化， 通过疏水性相互作用将抗胰岛素抗体ll固定化到其上。其后，在低折射率 树脂4上按照包围反应孔5的方式形成框状的槽壁6。
此外，将Blocking One (Nacalai Tesque株式会社制)按照被稀释到2.5倍的方式加入到磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，以制备溶液。接着，将 固定化有抗胰岛素抗体的平均粒径为760nm的蓝色LATEX BEAD分散到 该溶液中，从而制备珠粒分散浓度为4重量％的珠粒分散液。其中，Blocking One为用于抑制非特异性吸附的封闭剂，其是含有4 8重量％的三(羟甲 基)氨基甲烷、1 2重量％的白蛋白、2 6重量％的酪蛋白、10重量％以 下的高分子化合物、1重量％以下的防腐剂和约3重量％的4M-氢氧化钠溶 液的水溶液。
将10pL该固定化有抗胰岛素抗体的珠粒分散液滴加到上述反应孔5 中，在-80"C下预冷冻，然后通过冷冻干燥约l天，制造预先配置有珠粒的 如图1所示的光波导型传感器芯片。在该冷冻干燥时，向上述组成的珠粒 分散液中添加二糖类海藻糖3重量％、表面活性剂TweenO.l重量％。添加
这些成分的目的是提高珠粒分散液的再分散性。
向得到的传感器芯片的反应孔内分别滴加被测定样品溶液即浓度为 1.6ng/mL和6.4ng/mL的胰岛素溶液，使之发生抗原抗体反应。在被测定样 品溶液刚滴加后，将来自红色LED21的波长为655nm的红色光经由入射侧 光栅2a入射到平面光波导3，在该平面光波导3中发生传导而在表面(反 应孔5处的露出表面)附近发生瞬逝光，在光电二极管22处接收从射出侧 光栅2b射出的红色光，测定其光强度。也就是说，测定随着时间推移的光 强度的变化。
对于6.4ng/mL的胰岛素溶液，进行3次(共计4次)同样的操作，测 定随着时间推移光强度的变化。这些结果示于图10。
在图10中，以被测定样品溶液刚滴加后的光强度为100%，表示其随 着时间推移的光强度的变化。图10中，浓度为1.6ng/mL的胰岛素溶液的 结果表示为Sl，浓度为6.4ng/mL的4个胰岛素溶液的结果表示为S2-l、 S2-2、 S2-3、 S2-4。此外，用仅为胰岛素的稀释溶剂作为被测定样品溶液(空 白)进行同样的操作，测定的随着时间推移的激光光强度的变化的结果在 图IO中表示为B。
从图IO可知，规定时间处的激光光强度的降低率与被测定样品溶液中 的胰岛素浓度相关。此外可知，在胰岛素浓度相同(6.4ng/mL)的4个被 测定样品溶液中，规定时间处的激光光强度的降低率近似，因此可进行重 现性好的浓度测定。(实施例2)
将折射率为2.2 2.4的氧化钛溅射到折射率为1.52的无碱玻璃基板1 上，形成厚度为50nm的氧化钛膜，然后利用光刻法和干刻法在玻璃基板1 上形成光栅2a、 2b。接着，将环氧树脂溶液旋涂到包含光栅2a、 2b的玻璃 基板1上，然后通过煅烧形成厚度约为30jam的平面光波导3。煅烧后的平 面光波导3的折射率为1.56。然后，通过将低折射率树脂、市售的旭硝子 株式会社制的CYTOP (注册商标)的聚(全氟丁烯基乙烯基醚)网板印刷到 平面光波导3上，形成开口有长方形的反应孔(测定区)5的低折射率树脂 4，从而制造如图5所示的光波导型传感器芯片。
向得到的传感器芯片的反应孔内分别滴加被测定样品溶液即浓度为 1.6ng/mL和6,4ng/mL的胰岛素溶液10pL，在37'C下进行10分钟抗原抗体 反应。接着，用由Tris缓冲生理盐水(TBS)组成的洗涤缓冲液洗涤反应 孔内剩余的胰岛素。向洗涤后的反应孔内滴加与实施例1同样的珠粒分散 液20pL。从珠粒分散液刚滴加时开始，与实施例1同样地用红色LED21 和光电二极管22测定光强度的变化。
对于6.4ng/mL的胰岛素溶液，进行3次(共计4次)同样的操作，测 定随着时间推移光强度的变化。以被测定样品溶液刚滴加后的光强度为100 %，其随着时间推移的光强度的变化如图11所示。图11中，浓度为1.6ng/mL 的胰岛素溶液的结果表示为Sl，浓度为6.4ng/mL的4个胰岛素溶液的结果 表示为S2-1、 S2-2、 S2-3、 S2-4。此夕卜，用仅为胰岛素的稀释溶剂作为被测 定样品溶液(空白)进行同样的操作，测定的随着时间推移的激光光强度 的变化的结果在图11中表示为B。
从图ll可知，规定时间处的激光光强度的降低率与被测定样品溶液中 的胰岛素浓度相关。此外可知，在胰岛素浓度相同(6.4ng/mL)的4个被 测定样品溶液中，规定时间处的激光光强度的降低率近似，因此可进行重 现性好的浓度测定。
(实施例3)
向与实施例2同样的光波导型传感器芯片的反应孔内滴加与实施例1 同样的珠粒分散液10pL，其后立即分别滴加被测定样品溶液即浓度为1.6ng/mL和6.4ng/mL的胰岛素溶液10pL，通过吸液进行搅拌。从搅拌后 立即开始，与实施例1同样地用红色LED21和光电二极管22测定光强度 的变化。
对于6.4ng/mL的胰岛素溶液，进行3次(共计4次)同样的操作，测 定随着时间推移光强度的变化。以被测定样品溶液刚滴加后的光强度为100 %，其随着时间推移的光强度的变化如图12所示。图12中，浓度为1.6ng/mL 的胰岛素溶液的结果表示为Sl，浓度为6,4ng/mL的4个胰岛素溶液的结果 表示为S2-1、 S2-2、 S2-3、 S2-4。此外，用仅为胰岛素的稀释溶剂作为被测 定样品溶液(空白)进行同样的操作，测定的随着时间推移的激光光强度 的变化的结果在图12中表示为B。
从图12可知，规定时间处的激光光强度的降低率与被测定样品溶液中 的胰岛素浓度相关。此外可知，在胰岛素浓度相同(6.4ng/mL)的4个被 测定样品溶液中，规定时间处的激光光强度的降低率近似，因此可进行重 现性好的浓度测定。
另外，在实施例3中，即使珠粒分散液与胰岛素溶液的滴加顺序互调， 或同时滴加，均可与实施例3同样地确认激光光强度的降低率与被测定样 品溶液中的胰岛素浓度相关。
(实施例4)
首先，将与实施例l同样的珠粒分散液50^iL加入微管内并冷冻干燥。 在冷冻干燥时，与实施例1同样地向上述珠粒分散液中添加二糖类海藻糖3 重量％、表面活性剂TweenO.l重量％。接着，向微管内分别滴加被测定样 品溶液即浓度为1.6ng/mL和6.4ng/mL的胰岛素溶液50pL，混合并进行抗 原抗体反应。然后，将微管内的混合液2(HiL滴加到与实施例2同样的如图 5所示的光波导型传感器芯片的反应孔内，在滴加后立即与实施例1同样地 开始用红色LED21和光电二极管22测定光强度的变化。
对于6.4ng/mL的胰岛素溶液，进行3次(共计4次)同样的操作，测 定随着时间推移光强度的变化。以被测定样品溶液刚滴加后的光强度为100 %，其随着时间推移的光强度的变化如图B所示。图13中，浓度为1.6ng/mL 的胰岛素溶液的结果表示为Sl，浓度为6.4ng/mL的4个胰岛素溶液的结果 表示为S2-1、 S2-2、 S2-3、 S2-4。此夕卜，用仅为胰岛素的稀释溶剂作为被测定样品溶液(空白)进行同样的操作，测定的随着时间推移的激光光强度
的变化的结果在图13中表示为B。
从图13可知，规定时间处的激光光强度的降低率与被测定样品溶液中 的胰岛素浓度相关。此外可知，在胰岛素浓度相同(6.4ng/mL)的4个被 测定样品溶液中，规定时间处的激光光强度的降低率近似，因此可进行重 现性好的浓度测定。
权利要求
1. 一种光波导型传感器芯片，其特征在于，其具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；和，分散在所述光波导上、并固定化有与所述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒。
2. —种光波导型传感器芯片，其特征在于，其具有 在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导； 与所述光波导相向配置的支撑板；禾口，分散在所述支撑板的与所述光波导相向的表面上、并固定化有与所述 测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒。
3. 如权利要求1或2所述的光波导型传感器芯片，其特征在于，所述 光波导为片状的玻璃。
4. 如权利要求1或2所述的光波导型传感器芯片，其特征在于，所述 光波导是厚度为3 300pm的有机类树脂膜。
5. 如权利要求1或2所述的光波导型传感器芯片，其特征在于，所述 微粒为树脂珠粒。
6. 如权利要求1或2所述的光波导型传感器芯片，其特征在于，所述 微粒为金属胶体。
7. 如权利要求1或2所述的光波导型传感器芯片，其特征在于，所述 测定对象物质为抗原，与固定化在所述光波导表面和所述微粒上的所述测 定对象物质发生特异性反应的第1、第2物质分别为抗体。
8. 如权利要求1所述的光波导型传感器芯片，其特征在于，所述微粒 介由封闭层分散在所述光波导表面上。
9. 一种光波导型传感器芯片的制造方法，其特征在于，包括下述步骤 将与测定对象物质特异性反应的第1物质固定化于光波导表面； 将含有固定化有与所述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒的浆料涂布于所述光波导上；禾口，在所述涂布后干燥，将所述微粒分散于所述光波导上。
10. —种光波导型传感器芯片的制造方法，其特征在于，包括下述步骤 将与测定对象物质特异性反应的第1物质固定化于光波导表面； 将含有固定化有与所述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒的浆料涂布于支撑板表面；在所述涂布后干燥，将所述微粒分散于所述支撑板上；禾口， 将所述支撑板按照使其微粒分散面与所述光波导相向的方式隔开一定距离地配置。
11. 如权利要求9或10所述的光波导型芯片的制造方法，其特征在于， 所述浆料含有水溶性物质。
12. —种物质的测定方法，其特征在于，包括下述步骤 准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导，和分散在所述光 波导上、且固定化有与所述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒；向所述传感器芯片的光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波导表面 的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反应，同时使所述测定对象物质与分散在所述光波导上的微粒的第2物质之间发生 特异性反应；禾口，检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
13. —种物质的测定方法，其特征在于，包括下述步骤 准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；向所述传感器芯片的光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波导表面 的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反应；洗涤所述光波导表面；向所述光波导表面滴加固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性 反应的第2物质的微粒的分散液，使被测定样^溶液的测定对象物质与微 粒的第2物质之间发生特异性反应；禾口，检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于光波导表面的微粒所产 生的光学变化。
14. 一种物质的测定方法，其特征在于，包括下述步骤 准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；预先混合被测定样品溶液和固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒，使微粒的第2物质与被测定样品溶液的测定 对象物质发生特异性反应；向所述传感器芯片的光波导表面滴加所述混合液，使所述光波导表面 的第1物质与己与微粒的第2物质反应的被测定样品溶液的测定对象物质 发生特异性反应；和，检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
15. —种物质的测定方法，其特征在于，包括下述步骤 准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；向所述传感器芯片的光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波导表面 的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反应；向所述光波导表面滴加固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性 反应的第2物质的微粒的分散液，使所述测定对象物质与微粒的第2物质之间发生特异性反应；禾口，检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
16. —种物质的测定方法，其特征在于，包括下述步骤 准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导；向所述传感器芯片的光波导表面滴加固定化有与被测定样品的测定对 象物质特异性反应的第2物质的微粒的分散液；向滴加有所述分散液的所述光波导表面滴加被测定样品溶液，使光波 导表面的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特异性反 应，同时使所述测定对象物质与所述分散液中微粒的第2物质之间发生特 异性反应；禾口，检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
17. —种物质的测定方法，其特征在于，包括下述步骤 准备光波导型传感器芯片，该光波导型传感器芯片具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导，与所述光波导相 向配置的支撑板，以及分散于所述支撑板的与所述光波导相向的表面、且 固定化有与所述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒；向所述传感器芯片的光波导和所述支撑板之间注入被测定样品溶液， 使光波导表面的第1物质与被测定样品溶液中的测定对象物质之间发生特 异性反应，同时使所述测定对象物质与分散于所述支撑板的微粒的第2物 质之间发生特异性反应；和，检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于所述光波导表面的微粒 所产生的光学变化。
18. —种物质测定用试剂盒，其特征在于，其组合有光波导型传感器芯 片和包装体，所述光波导型传感器芯片具有光波导和盖，所述光波导在表面上固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第1物质；所述盖配置于 所述光波导表面，在与所述光波导表面之间具有用于形成测定区的凹部，并开口有与该测定区连通的导入孔和排出孔；所述包装体收纳有固定化有与被测定样品的测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒的分散液。
19. 一种物质的测定方法，其特征在于，其中使用权利要求18所述的 物质测定用试剂盒，并包括下述步骤将被测定样品溶液经由光波导型传感器芯片盖的导入孔滴加到测定区 内的光波导表面，使固定化于光波导表面的第1物质与被测定样品溶液的 测定对象物质发生特异性反应；将包装体内的微粒的分散液经由所述盖的导入孔导入到测定区内的光 波导表面，同时，在将被测定样品溶液经由排出孔排出的期间，使已发生 特异性反应的被测定样品溶液的测定对象物质与微粒的第2物质之间发生 特异性反应；和检测介由第1物质和测定对象物质而固定化于光波导表面的微粒所产 生的光学变化。
20. 如权利要求12~17或19任一项所述的物质的测定方法，其特征在 于，所述被测定样品溶液的测定对象物质为抗原，与该测定对象物质发生 特异性反应的所述第l、第2物质为抗体。
21. 如权利要求18所述的物质测定用试剂盒，其特征在于，所述被测 定样品溶液的测定对象物质为抗原，与该测定对象物质发生特异性反应的 所述第1、第2物质为抗体。
22. —种光波导型传感器，其特征在于，其具有-光波导型传感器芯片，其具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导，和分散于所述光波导上、且固定化有与所 述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒； 使光入射到所述光波导的光源；和，接收从所述光波导射出的光的受光元件。
23. —种光波导型传感器，其特征在于，其具有光波导型传感器芯片，其具有在表面上固定化有与测定对象物质特 异性反应的第1物质的光波导，与所述光波导相向配置的支撑板，以及分 散于所述支撑板的与所述光波导相向的表面、且固定化有与所述测定对象 物质特异性反应的第2物质的微粒；使光入射到所述光波导的光源；和接收从所述光波导射出的光的受光元件。
全文摘要
本发明的目的是提供一种可以更少的被测定样品量、在更短的时间内、定量测定被测定样品的测定对象物质的光波导型传感器。该目的是通过下述手段实现的一种光波导型传感器，其特征在于，具有在表面上固定化有与测定对象物质特异性反应的第1物质的光波导，和分散于上述光波导表面、且固定化有与上述测定对象物质特异性反应的第2物质的微粒。
文档编号G01N33/543GK101451995SQ20081017605
公开日2009年6月10日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者东野一郎, 大宫可容子, 小山由利子, 本庄勉, 植松育生, 绳田功, 葛西晋吾, 高濑智裕 申请人:株式会社东芝