专利名称：：一种检测地塞米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属生物医药
技术领域：
，为食品安全，药物检测试剂。具体而言，本发明利用免疫反应的高灵敏性和特异性，以及酶促反应的放大效应和易检测性，建立起来的一种检测地塞米松的酶联免疫测定试剂盒。技术背景地塞米松(dexamethasone，Dex)是糖皮质激素可的松类的衍生物，也是医学临床运用最广泛的强效皮质激素。可的松类激素通常用来治疗过敏性和严重感染性疾病，具抗炎和抗过敏的作用。这类激素尚有剌激食欲，增加肝糖原合成，高血糖等作用。但这种激素在食物中残留，对人有潜在的危害，故欧盟等国都禁止地米松，氟美松等作为牲畜的促生长剂，在畜牧业中使用。欧盟禁用并且建立最大残留限量(maximumresiduelimits,MRLs)，对地塞米松，为肝脏2ilg/kg;肌肉0.75ilg/kg;牛奶0.3ilg/L。糖皮质激素类常用的检测方法有薄层色谱、免疫分析法、液相色谱、气相色谱、谱或气_质、液_质、多级联用技术等。薄层色谱灵敏度低，仅能检测出微克(yg)级以上的样品。不能满足食品中残留地塞米松的检测要求。气相色谱法(GC):由于糖皮质激素中含有多个极性基团、不挥发、热稳定性差，因此不适于直接进行GC分析。必须对糖皮质激素结构中基团进行的衍生化处理，包括硅烷化、酰化等后，才能测定。液相色谱法(LC):液相色谱对糖皮质激素的检测通常用配有紫外检测器的液相色谱，包括反相色谱和正相色谱，用来检测血浆中的地塞米松。此外，也有用反相和正相色谱，同时检测多种糖皮质激素。最低检出限一般可达10ug/kg。虽然该方法的灵敏度可以基本达到兽药残留检测要求，但仅适用于部分化合物，同时不能进行定性确认。气相色谱-质谱法(GC-MS):在激素的残留检测确认技术中，气相色谱(GC)与质谱(MS)的串联技术是最常选用的技术。从上世纪90年代以后，绝大多数欧盟参考实验室都引入了GC-MS方法，用于监控畜禽产品中类固醇激素残留。该技术集中了气相色谱高的色谱分辨率和质谱技术的特异性、选择性。由于激素类物质的挥发性不够，因此，在选择用GC-MS分析激素类物质时，也必须进行衍生化处理。液相色谱-质谱联用法(LC-MS):液相色谱_质谱联用法(LC-MS)，或多级联用技术(LC-MS-MS)其检测灵敏度高，能对各糖皮质激素微量残留进行检测，是目前检测食品中糖皮质激素残留确证检测的最佳方法之一。气相色谱和气相色谱-质谱技术都要求对样品进行衍生化处理，样品的前处理相对比较麻烦，而液相色谱技术对化合物的定性确认又比较困难。液相色谱_质谱技术，不需要样品衍生化，而且能够定性确认，这已经成为分析糖皮质激素的主要手段。其检测限可达0.5ug/L。气相色谱-质谱联用(GC-MS)，液相色谱_质谱联用(LC-MS)或多级联用技术如LC-MS-MS，其设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高。本发明试剂盒利用酶联免疫测定原理，定量检测动物组织，血液，胆汁，尿液中的地塞米松残留。用该试剂盒测定不需要昂贵的仪器投入，一般中等文化水平的人员，经过短期培训，就可掌握其检测方法。该试剂盒检测多种样品中的地塞米松，其线性范围为0.lng/ml20ng/ml，最低检测限可达0.lng/ml。可满足食品中地塞米松残留的快速监测。为食品中地塞米松残留，提供了一种高效，快速，特异的检测方法
发明内容本发明提供一种快速检测地塞米松的酶联免疫试剂盒。其生产的地塞米松试剂盒，线性范围为0.lng/ml20ng/ml，IC5。为34ng/ml左右，灵敏度为0.lng/ml。稳定期在6个月以上(4t:冰箱保存)。本发明公开免疫原的合成，动物的免疫，特异性抗体的制备，试剂盒的调试和装配，试剂盒各种参数的确定及样品的前处理和测定。地塞米松，化学名9a-氟-lie，17a，21-三羟基-16a-甲基孕甾-l，4-二烯-3，20-二酮。英文dexamethasone，縮写为Dex，分子量392.45，为小分子物质，不具有免疫原性而仅具有免疫反应性，要生产地塞米松的酶联免疫测定试剂盒，必须要制备对地塞米松有高度特异性的抗体。要获得对地塞米松有高度特异性的抗体，首要条件是要有一个能激发动物产生抗体的抗原。因此，免疫原的制备最为重要。其解决的方案是地塞米松共价连接上一个大分子物质，通常是与一种蛋白质交联。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白等，本发明公开一种制备地塞米松免疫原的方法。首先用一羟胺化合物，羧甲基羟胺，修饰地塞米松，生成地塞米松_3-羧甲基肟，Dex-3-CM0，后者与N-羟基丁二酰亚胺反应，用二环己碳二亚胺(DCC)或水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺，N-Ethyl-N'-(3-dimethylami,ropyl)carbodiimide，EDAC;1-环己_3_(2_玛啉-4-乙基)碳二亚胺对甲基苯亚磺酸盐N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate，，CMEC}催化，使之活化，然后与载体蛋白分子中游离胺基相连，生成免疫原。有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫动物，本发明是免疫1.52kg大小的新西兰雌性家兔，获得对地塞米松有特异性反应的多克隆抗体。本发明提供一种能产生高滴度抗体的免疫方案。为了检测特异性抗体，建立直接竞争酶联免疫测定，必须合成地塞米松与一种酶交联的抗原_酶交联物(酶标抗原)，交联的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，P_半乳糖苷酶等。本发明公开一种合成地塞米松与酶交联的方法，是用活化的Dex-3-CM0与酶交联，以制备酶标抗原。在以上基础上，组装检测试剂盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶标板，包被二抗。(选用羊抗兔抗体，有商品供给。一般选用效价高，效价在l:10002000，稳定性好的二抗。)。优化包被浓度，抗体浓度，酶标抗原浓度，使之达到检测要求。本发明提供组成试剂盒相关试剂的配制和组装流程(1)用选购的二抗包被酶标板。(2)孵育后洗涤去未吸附上的多余二抗。(3)用另一种蛋白封闭板上未吸附二抗的多余位点，以减少测定时的非特异性吸附。(4)提供地塞米松抗体和酶标抗原浓縮液。(5)提供抗体和酶标抗原应用稀释液。(6)提供浓縮洗涤液(7)提供地塞米松的标准液，用样品制备液配制7个标准0ng/m1，0.lng/m1，0.5ng/ml，1.0ng/ml，5.Ong/ml，10.0ng/ml，20.Ong/ml(8)提供酶显色缓冲溶液和酶反应底物液，本试4剂盒所用的酶反应底物为H202和四甲基联苯胺(TMP)，H202配于显色缓冲溶液中，四甲基联苯胺(TMP)单独配制。(8)提供酶反应终止液，终止液为2M硫酸。(9)提供样品制备液。为配制地塞米松标准和测定时样品的制备。以上试剂均放4°C冰箱保存。应用本试剂盒检测去甲睾酮的检测步骤(1)按照测定样品数和制作标准曲线所需孔数(每样品和标准均作二个孔)，从冰箱取出所需用的孔条，放置使温度平衡至室温(25°C)。(2)将地塞米松抗体浓縮液用抗体稀释液按1:100稀释后，每孔加100iU，加盖，室温放置30分钟。(3)将浓縮洗涤液用双蒸馏水按1:9稀释后，作为洗涤液，倒去孔中抗体液，用洗涤液洗涤3次，每次每孔250，每次加洗涤液后，静置3分钟，倒掉，甩干，再进行下一次洗涤。最后一次洗涤，尽量甩干。(4)各孔加入标准或样品，各标准和样品各加2孔，每孔加50ill，将酶标抗原浓縮液，用抗体稀释液按i:100稀释后，每孔加50ia，另取2孔，加o标准50ia和抗体稀释液50iU作为空白孔，稍平行振荡酶标板，混匀各孔中液体。加盖，室温放置30分钟。[OO27](5)同(3)洗涤各孔，最后甩干。(6)各孔加显色液100ii1，显色液由显色缓冲液与TMB液，以10:1配制。加入后加盖，室温暗处避光放置15分钟。(7)每孔加终止液50ii1，混匀，于30分钟内，用酶标仪，在波长450nm下，测定其光密度。用各孔的0D45。减去空白孔的0D45。，得各孔的实际测定值。求出二平行孔的平均值，得各标准或样品的测定值。按照下式求出各标准和样品的抑制率各标准或样品的抑制率％=(各标准或样品的测定值/0标准的测定值)X100%用各标准浓度的对数值为X，其相应的抑制率为Y，在坐标轴上作图，得地塞米松浓度的半对数坐标标准曲线，在标准曲线上，找出样品抑制率相对应的X轴上的点，就可计算出样品中地塞米松的浓度。或利用ELISA计算的相关软件，只需输入测定值，立即就可得出结果。本试剂盒所用的检测方法，属直接竞争酶联免疫测定方法。96孔酶标板已预先包被了二抗，加入地塞米松的特异性抗体，此抗体与二抗结合后，固定在酶标板上。然后，加入标准抗原(Dex)或含有地塞米松的样品，和酶标-地塞米松，标准或样品中地塞米松与酶标-地塞米松，共同竞争与地塞米松抗体结合，经孵育后，洗涤去未结合的酶标地塞米松，显色测定。测定值与标准或样品中地塞米松量的对数值呈反比，以此达到定量测定地塞米松的目的。图例说明图1载体蛋白BSA，免疫原地塞米松_BSA，地塞米松三者紫外扫描图。图2用制备的试剂盒测定，所得的地塞米松标准曲线图以下具体实施例子，可进一步了解本发明。此处仅提供一种优选方法，但对本发明5的内容和权利要求不构成任何限制。实施例1主要试剂和主要仪器1.1试剂地塞米松(购自Sigma)，羧甲基羟胺(Sigma)，吡啶；N_羟基丁二酰亚胺(NHS);N，N-二甲基甲酰胺(DMF);二环己碳二亚胺(DCC);(均购自国药上海化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA);卵清蛋白(OVA);四甲基联苯胺(TMP);(购自华美生物工程公司，进口分装产品)。辣根过氧化物酶(R.Z>3)(上海丽珠东风生物技术有限公司).羊抗兔多抗(上海康成生物科技公司购得).S印hadexG-25(Sigma)，其余均为分析纯试剂.1.2主要仪器精密分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司，Sartorius，BS124s，d=O.OOOlg);带扫描PC紫外-可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；高速台式离心机(上海安亭实验仪器厂)；酶标仪，P型可调移液器一套(热电上海公司)；SZ_97自动三重水纯水蒸馏(上海本波仪器有限公司)以及其他实验室常用仪器.实施例2地塞米松免疫原和酶标抗原的合成2.1地塞米松-3-羧甲基肟，Dex-3-CM0，的合成称取Dex118mg(0.3薩o1)溶于2ml无水妣啶，搅拌下，加入45mg(0.45,1)羧甲基羟胺，室温搅拌24小时，最后，减压抽干吡啶，得黄色油状物。加2ml乙酸乙酯溶解，用蒸馏水洗三次，用分离出有机相，无水硫酸钠干燥。加热减压去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。此为地塞米松-3-羧甲基肟，得约53mg。取少量，溶解于O.lmlDMF，用TLC鉴定。薄层层析中，Dex-3-CM0的Rf为0.2。接近原点.Dex则离开原点，随层析液前移.Rf约0.852.2免疫原的制备地塞米松_牛血清白蛋白的合成取上制备的地塞米松-3-羧甲基肟40mg，溶于DMF液2.5ml，加入25mgDCC(约0.23mmol)，4。C搅拌下，加入NHS18mg(约0.15mmo1)，避光4。C搅拌过夜.次日，离心去沉淀.取上清为活化的Dex-3-CMO.称取300mg牛血清白蛋白，加7.5mlpH89的蒸馏水和7.5mlDMF溶解，4。C搅拌下，加入上活化的Dex-3-CM01.8ml.4"搅拌过夜.次日，取出用O.01MPBS(pH7.5透析3日.每天换2次透析液.透析后，定蛋白浓度，并用uv扫描鉴定，计算交联率.此法交联率一般在此15左右.此为地塞米松-牛血清白蛋白(Dex-BSA)，作为免疫原。图1为牛血清白蛋白(BSA)，地塞米松-BSA和地塞米松紫外扫描图。2.3酶标抗原的合成地塞米松_辣根过氧化物酶(Dex-HRP)的合成称取HRP10mg力B500ylpH89的蒸馏水和500y1DMF溶解，4。C搅拌下，加入活化的Dex-CMO100y1.4t:搅拌过夜.次日，取出用0.01MPBS(pH7.5)透析3日.每天换2次透析液.透析后，过S印hadexG25柱，收集有色峰.为Dex-HRP.实施例3地塞米松多克隆抗体的生产用3只新西兰长耳雌兔，每只免4次.首次用Dex-BSA配成lmg/ml浓度，取3ml，加3ml弗氏完全佐剂，充分乳化后.每只兔用2ml(即lmg免疫原)背部，多点皮下注射为首次免疫.以后分别在第21天，51天，91天再免疫3次.第21天，51天，用3mllmg/ml浓度的免疫原，加3ml弗氏不完全佐剂乳化，每只兔用lml，于臀部肌肉二侧注射.第51天免疫后10天，采血检查抗体产生情况.第91天，免疫原用0.9%氯化钠液配成0.5mg/ml溶液，每只免从耳静脉注射lml免疫原.此次后，第IO天，就可从兔耳静脉或心脏收获血液.收集血液让其自然凝结.离心收集血清，此为抗Dex的抗血清.按照此免疫方案，一般都能收获高滴度的抗血清.用二抗包被酶标板，利用合成的Dex-HRP，测定抗血清效价.下为测定结果稀释倍数1!40001:80001:160001:320001:640001:1280001:2360001:472000抗血清0D4503.3082.9842.6122.0231.6310.7870.4200.213阴性血清0D4500.1310.1080.0570.0320.0120.0050.0010.001可见，生产抗血清效价达20万.用则可按1:150001:30000稀释用.实施例4优化试剂盒组成，确定各试剂最终浓度用方阵法确定包被二抗，Dex多抗，Dex-HRP三者的最佳浓度。4.1包被酶标板二抗配成2mg/ml浓度，用0.OIM碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)按i:iooo(ioooiii缓冲液加iiii二抗)稀释后，每孔加iooiii，加盖，放入4t:冰箱过夜。次日用洗涤液洗3次，最后一次甩干后，每孔加200ia封闭液，封闭液为含2X卵清蛋白的O.OIM碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)。加入后，加盖，放入4t:冰箱过夜。次日用洗涤液洗3次，最后一次甩干后，将酶标板放入37t:烘箱30分钟，烘干。取出后用铝箔真空包装。4.2配抗体浓縮液以制备Dex多抗，1:2500稀释(用抗体保存液)。测定时用抗体稀释液按i:ioo稀释应用。4.3配Dex-HRP浓縮液合成的Dex-HRP，用酶保存液，按1:10稀释。测定时用抗体稀释液按l:ioo稀释应用。4.4配浓縮洗涤液0。5MPBS液(pH7.2)+0.5%体积的Tween-20为洗涤液。用时用蒸馏水或去离子水按l:9稀释用。4.5配抗体稀释液为0.1MPBS(pH7.2)加0.1%明胶。4.6配样品配制液为0.1MPBS(pH7.2)力Q0.1%水杨酸钠加0.05%吐温-20。4.7配制Dex标准用样品配制液配。共配制7个标准0ng/m1，0.lng/m1，0.5ng/ml，1.Ong/ml，5.Ong/ml，10.Ong/ml，20.Ong/ml。4.8配制显色液显色液由二部份组成，一是"显色缓冲液"，另一是"TMB"液。显色缓冲液:Na2HP041.84g+柠檬酸0.47g+H20100ml+30%H20250ii1，TMB液用95%的乙醇或用二甲亚砜配成lmg/ml浓度。4.9配终止液2M硫酸。浓硫酸按1:8用水稀释则可。4.10试剂盒组成(1)已包被二抗的96孔或48孔酶标板(真空铝箔包装)(2)地塞米松(Dex)标准(共7个):Ong/ml，0.lng/ml，0.5ng/ml，1.Ong/ml，5.0ng/ml，10.0ng/ml，20.Ong/ml(3)Dex抗体浓縮液(用时按1:100稀释应用)(4)Dex-HRP浓縮液(用时按1:100稀释应用)(5)抗体稀释液(6)显色缓冲液(7)TMB液(8)终止液。(9)10X洗涤液(10)样品制备液。实施5样品处理和测定5.l测定样品的处理尿样2ml新鲜尿液加2ml0.1M醋酸盐缓冲溶液(pH4.8)，加40蜗牛酶液，6ml蒸馏水，37t:保温4小时。酶解。然后，沸水浴加热5分钟。离心，取上清lml加4ml预先用水平衡的三氯甲烷，旋转混合抽提10分钟。离心，取下有机相2ml，N2气吹干，残渣加200y1样品制备液，旋转混合。室温平衡30分钟，作样品测定液。脂肪，肾脂肪样品:10g肾脂肪，在微波炉中加热熔化(低火360W，23分钟)。取lg于玻璃匀浆器中，加5.Oml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心，取下层lml三氯甲烷液，通风橱中，用N2吹干，加200样品制备液，旋转混合，抽提15分钟，为测定样品液。肌肉，香肠10g加10ml含O.1%水杨酸钠的0.15M，氯化钠液，匀浆，沸水浴加热5分钟，离心，取1/10体积上清，加5ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心，取下层三氯烷lml，用N2吹干，加200ill样品制备液，旋转混合抽提15分钟，为测定样品液。饲料10g力B10ml含0.1%水杨酸钠的0.15M氯化钠液，匀浆，沸水浴加热5分钟，取1/10体积上清，加5ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心取下层三氯甲烷lml，用N2吹干，加2001样品制备液，旋转混合抽提15分钟，为测定样品液。饮料(包括牛奶，茶，咖啡等)取5ml饮料，沸水浴加热5分钟，离心上清lml，加5ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心取下层三氯甲烷lml，用N2吹干，加2001样品制备液，旋转混合抽提15分钟，为测定样品液。尿样品稀释系数均为2。其余为1。5.2样品和标准液的测定按照说明书第6，7页所述的检测步骤，用组装好的试剂盒进行测定。测定所得标准品数椐如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>所绘的标准曲线如图2所示。IC5。二2.779ng/ml实施6试剂盒各参数的测定试剂盒的特异性及交叉反应地塞米松100%氟美松80%倍他米松30%孕酮<2%氢化可的松<1%用lng/ml标准做24个孔，重复测定。计算"板内变异"CV=3.8%"板间变异"<15%。"灵敏度"为0.lng/ml。精确度用肝组织做添加试验，分别添加0.lng/ml，0.5ng/ml，lng/ml，其回收率别是71%，85%，及89%分试剂盒稳定性S(ng/ml)00.10.511002.0251.8141.5271.3560.70537度一周2.0051.7641.4811.290.68937度二周1.8821.5271.2891.1020.547837度三周1.6011.2110.9120.7750.298热稳定性试验，37度3周保存，相当于4度保存7.4个月。可见试剂盒的稳定期在半年以上。权利要求本发明公开一种测定地塞米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。其特征包括免疫原的制备，酶标抗原的制备，抗体制备和试剂盒各组份的配制及酶标板的包被。2.根据权利l所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，合成地塞米松免疫原的方法。用地塞米松溶于无水吡啶，搅拌下，加入羧甲基羟胺，地塞米松与羧甲基羟胺的摩尔比为`1:1.52左右，室温搅拌24小时后，减压抽干吡啶，得黄色油状物。加乙酸乙酯溶解，用蒸馏水洗三次，分离出有机相。加热减压去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。为地塞米松-3-羧甲基肟，再与N-羟基丁二酰亚胺反应，用二环己碳二亚胺(DCC)或水溶性碳二亚胺{1-乙基_3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺；1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺_对甲基苯亚磺酸盐}催化，得地塞米松_3-羧甲基肟活化物，该活化物与载体蛋白在碱性条件下，与载体蛋白上氨基相联，为地塞米松的免疫原。载体蛋白如牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白。3.根据权利l-2所述，其特在于，合成一种酶标抗原的方法用地塞米松-3-羧甲基肟活化物，在碱性条件下与酶相联，其酶可为辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，P-半乳糖苷酶。4.根据权利l所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，试剂盒溶液的优化配制标准溶液和样品的配制，是用含O.1%0.5%水杨酸钠和0.05%0.1%吐温_20的O.10.01M的磷酸盐缓冲溶液。抗体稀释液用含0.10.5%明胶的0.1`0.OIM磷酸盐缓冲溶液。显色液为二组份，其中，一组份为显色缓冲液，由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，每毫升含0.20.5iU30%H202;另一组份为四甲基联苯胺(TMB)液。TMB液用95%乙醇或二甲亚砜配制成lmg/ml浓度。5.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，用采用羊抗兔抗体(二抗)包被96或48孔酶标板。用2%卵清蛋白液封闭孔中未吸附二抗的部位。6.—种用直接竞争酶联免疫测定，测定各种样品中地塞米松的方法。其特征在于(1)样品的前处理方法。用溶剂抽提方法，大大简化了测定过程。(2)用权利l-5所述工艺组装的试剂盒测定，检测过程为用包被有羊抗兔抗体的酶标板，加入地塞米松抗体，孵育后洗涤甩干，加入标准或样品溶液和酶标抗原(地塞米松_辣根过氧化物酶)，孵育后洗涤甩干，加显色剂显色，终止，测定。标准或样品地塞米松浓度的对数值与0045。值呈反比。以此达到定量测定地塞米松的目的。此直接竞争酶联免疫测定试剂盒，检测范围为0.120ng/ml，灵敏度可达0.lng/ml。全文摘要本发明属生物医药领域。公开一种检测地塞米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。本发明提供地塞米松抗原合成方案，首先用地塞米松合成地塞米松-3-羧甲基肟，后者在碳二亚胺催化下，用N-羟基丁二酰亚胺活化，与牛血清白蛋白结合，合成免疫原；与辣根过氧化物酶结合，合成酶标抗原。用免疫原，免疫新西兰大白兔，获得地塞米松多抗。测定时，用羊抗兔多抗(二抗)包被酶标板，二抗与地塞米松多抗结合，洗涤后加入样品或标准和酶标抗原，显色测定，就可得出结果。本发明试剂盒中配制的各试剂，使用方便。这为食品安全，药物检测中，地塞米松的检测，提供一个快速，特异，灵敏的检测方法。文档编号G01N33/543GK101769922SQ200810204940公开日2010年7月7日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者徐基芳,王文卓,王武康申请人:王武康