专利名称：一种幽门螺旋杆菌抗体的免疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及传染病免疫分析技术领域，特别涉及一种幽门螺旋杆菌抗体检 测试剂盒及其纟企测方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(HP)是人体胃粘膜内的一种螺旋状的革兰阴性细菌。HP菌体 光滑，呈S形，有4 6条鞭毛，易粘附在幽门附近的胃窦部及胃体部的粘膜上， 位于胃粘液的深层，不与胃酸直接接触。HP在人与人之间通过经口途径传播， 具有活力的HP在河水中可存活1周，是慢性胃炎消化性溃疡和非溃疡性消化不 良的重要致病因素，临床上可分为两种类型I型和II型，其中I型菌抹致病 性极强易引起胃部疾病，II型感染后无一般临床症状。
近年来的综合研究证实该菌的感染率与胃炎及十二指肠溃疡密切相关。 幽门螺旋杆菌感染胃入十二指肠后，在正常粘膜上不断繁殖，逐渐侵害粘膜、 出现皱褶和肥厚；抑制胃液及十二指肠液的正常分泌，破坏了粘膜正常的防御 功能。本菌能迅速水解尿素后又产生大量氨，氨能直接或间接的使粘膜细胞受 损，这些因素导致了胃及十二指肠的病变，HP可产生多种酶类如尿素酶、过氧 化酶、蛋白酶、磷脂酯等。其中尿素酶可分解尿素产生氨，氨即保护细菌不受 胃酶侵袭，又对胃粘膜细胞有直接毒性作用。过氧化酶能抑制一些杀菌物质的 形成。而蛋白酶、脂肪酶等可破坏胃粘膜的完整性。HP产生的空泡毒素可导致 胃粘膜空泡变性。HP是慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病原因之一，并且和胃 癌的发病也有着密切的关系。1986年世界胃肠病学会第八届会议上便提出了 HP 感染是慢性胃炎的重要病因之一 。
临床上十二指肠溃疡患者中有95%呈幽门螺^走杆菌感染阳性，80%胃癌患者感染幽门螺旋杆菌。在我国普通人群中，成年人幽门螺旋杆菌感染率在60%
以上，儿童感染率也高达50%,我国人群感染率比发达国家高出20~40个百分 点。幽门螺旋杆菌感染率高的根本原因是人们缺乏对幽门螺旋杆菌危害的认识， 并在很大程度上不了解幽门螺旋杆菌还会传染。同时，胃病患者应及时到医院 进行无创的幽门螺旋杆菌检测， 一旦发现有感染，只要接受为期两周的规范化 治疗，即可使90%以上幽门螺旋杆菌感染者得到根治，而且复感染率极低。 目前检测幽门螺旋杆菌(HP)的方法可归纳为两大类
(1) 非侵入性的方法
①以免疫学法检测血清中的HP抗体已有多种方法检测，但公认以酶联免 疫吸附试验和免疫印迹试验为优，优点是特异高，可接近100%,且能进行定量 分析，缺点是不能鉴别既往感染及现疫病人，主要适用于流行病学调查。
a尿素呼气试验原理是HP在体内产生尿素酶，用13C或14C标记的尿素 由受试者服下后，即分解产生带同位素标记的二氧化碳，收集呼气标本，用液 体闪烁计数器或用气体核素质谱仪检测标记的二氧化碳，灵敏度极高，可定量， 患者无痉，方法简单快速，对检测HP是否根治十分可靠。因"C有少量放射性 物质，目前均用13(3尿素呼气试验。
Q)PCR4全测测胃液、粘膜中HP的尿素酶(UReA)基因和毒素相关蛋白 A (CagA)基因。
(2) 侵入性的方法
这类方法主要需要通过内镜采取胃粘膜组织来检测HP。 M夬速尿素酶法原理是HP具有丰富的尿素酶，分解尿素产生氨，使反应 变成碱性，由PH指示剂显色，该法简便，快速，灵敏，但有些细菌亦会有尿素 酶，因此有假阳性可能。
0细菌培养法取胃粘膜活组织作HP培养，该法准确可靠，但培养费时。 。病理学检测法胃粘膜组织切片染色检查，以银染色法最佳，检测率高， 结果可靠。
目前，检测幽门螺旋杆菌的方法繁多，但还没有一种快速不需要任何i殳备且可区分弱毒林和强毒林的检测方法的报道。如能建立该种方法，则能使检测 过程中的样品处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说 明书即可操作，并可迅速观察结果，易于在中小型企业、基层普及与推广应用 及现场快速检测，并能区分弱毒林和强毒林，对于幽门螺旋杆菌的防治具有重 大的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种幽门螺旋杆菌抗体的免疫 检测试剂盒及其检测方法。该方法筒单快速不需要任何设备，易于在中小型医 院、基层普及与推广应用，且可以区分弱毒抹和强毒株。
为实现本发明的目的，采用如下的技术方案
本发明的一种幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒，包括盒体、印迹膜、酶 标二抗、标准条带卡、显色底物、显色剂、终止液、洗液、反应槽，其特征在
于，在印迹膜上有质控线和检测线，并在检测线上固定有幽门螺杆菌抗原。
所述印迹膜为具有蛋白吸附能力的膜载体。优选的，印迹膜为硝酸纤维素 膜或聚偏氟乙烯膜。
所述幽门螺杆菌抗原包括细胞毒素蛋白(CagA )、空泡细胞毒素蛋白(VacA) 和幽门螺旋杆菌尿素酶A单位蛋白和幽门螺旋杆菌尿素酶B单位蛋白。
通过检测空泡细胞毒素蛋白(VacA)的抗体确定是弱毒抹还是强毒株感染。 检测到空泡细胞毒素蛋白(VacA)的抗体就是强毒林感染，没有检测到空泡细 胞毒素蛋白(VacA)的抗体的就是弱毒林感染。
所述酶标二抗为酶标i己抗人IgG。
所述的标准条带卡上标注了对应于所述印迹膜相应位置上的抗原和质控线 的蛋白及其分子量。
所述的显色底物为过氧化氢或过氧化脲；显色剂为四曱基联苯胺或二氨基 联苯胺。
所述的终止液为能够使酶促反应终止的物质，强酸(硫酸、盐酸)、强碱(氢氧化钠、氢氧化钟)、络合剂(乙二胺四乙酸钠)或表面活性剂(十二烷基磺酸 钠)。
所述的洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓沖液或者三羟基氨基曱烷-盐酸緩 冲液。
印迹膜为整张或者整巻的膜，尺寸不定，经过转印或者喷涂后干燥，经过 封闭处理，干燥后按所需规j格切成条状。
标准条带卡由电脑模拟制作，印迹线使用相应的设备喷涂而成或者经电泳 转印而成。
反应槽为非天然材料的人工聚合材料制备而成，宽度和容量根据印迹膜条 的尺寸制定。
上述幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒的^r测方法是先将样品用稀释液稀 释，稀释后的样品滴加在印记膜上，与印迹膜上相应的抗原结合形成"抗原-抗体" 复合物，经过洗液洗涤去除非特异性的抗体，加入酶标二抗，形成"抗原-抗体-酶标二抗"复合物，经过洗液洗涤去除未结合的酶标二抗，加入显色底物和显色 剂，反应后加入终止液，然后与标准条带卡对比确定抗体的种类。
本发明的优点是利用该试剂盒检测幽门螺杆菌筒单快速，不需要任何设 备，易于在中小型医院、基层普及与推广应用，且可以区分弱毒抹和强毒抹。
图l是幽门螺杆菌抗体的免疫检测试纸的示意图2是幽门螺杆菌抗体的免疫检测的一个优选实施例的检测结果图。
具体实施例方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应
实施例一幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒的制备 1.印迹膜的制备A喷涂法将细胞毒素蛋白(CagA)、空泡细胞毒素蛋白(VacA)、幽门 螺旋杆菌尿素酶A单位蛋白和幽门螺;5走杆菌尿素酶B单位蛋白使用划膜緩冲液 稀释至所需浓度，使用划膜仪在特定的位置上将所需的蛋白划上，固定后经过 封闭、干燥切条，加干燥剂密封保存。
B转印法将所有的抗原经过含十二烷基磺酸钠(SDS)、巯基乙醇的样品 处理液稀释后沸水煮沸至一定时间，上样至电泳槽，经过浓缩胶的浓缩和分离 胶的分离成不同的条带，电泳后的胶经过转印技术转印至印迹膜上，转印后的 印迹膜经含1%牛血清白蛋白、5/万叠氮钠2。/。蔗糖的0.01M PH7.2 PBS溶 液封闭处理后干燥，干燥的印迹膜按需要的规^各切成膜条加干燥剂密封保存即 可。
如图l所示，是幽门螺杆菌抗体的免疫检测试纸的直观示意图，由上到下， 膜上的蛋白条带依次为细胞毒素蛋白(CagA)、空泡细胞毒素蛋白(VacA)、 幽门螺旋杆菌尿素酶A单位蛋白和幽门螺旋杆菌尿素酶B单位蛋白以及质控蛋 白。
2. 酶标二抗的制备
纯化的人IgG经过弗氏佐剂乳化后形成油包水的乳化物，该乳化物经皮下 或皮内免疫哺乳动物，产生特异性的抗人IgG特异性抗体，经过亲和纯化后制 得纯化的抗人IgG，纯化的IgG经过化学反应与具有催化活性的酶形成偶联物， 经过沉淀法纯化去除没有偶耳关的的酶，然后经过ConA-agrose 4B亲和层析柱去 除没有和酶结合的抗人IgG,即得纯化的酶标抗人IgG二抗，加等量的中性甘油 -20匸冻存。
3. 标准条带卡的制备
根据印迹膜上各个条带的位置和质控条带的位置及颜色深浅经过电脑模拟 颜色后打印而成，宽度长度与印迹膜条相同。
4. 过氧化脲-DAB显色底物的制备
称取0.3g过氧化脲溶于1000ml 0.005M PH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸緩 冲液中，充分溶解即制得过氧化脲底物，称取0.3g 二氨基联苯胺(DAB )干粉溶解于1000ml 0.005MPH2.8的三羟基氨基甲烷-盐酸緩冲液中，充分溶解即 制得DAB显色剂。
5. 纟冬止液的制备
称取5g EDTA 二钠盐溶解于1000ml水中即得终止液。
6. 洗液的制备
称取28.65g十二水磷酸氢二钠，3.12g磷酸二氢钠，100g氯化钠，lg硫 柳汞，20ml吐温-20加水1 OOOml充分溶解即得浓缩洗液。
实施例二幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒的检测方法
1. 洗液配制将整瓶浓缩洗液按照稀释至一定体积；
2. 在含有印迹膜条的反应槽中加入稀释好的洗液lml和待检血清10ul;
3. 置摇床上室温下(25。C左右)摇动至一段时间弃去槽内液体，加入洗液lml, 一分钟后弃去槽内液体，如此反复4次，最后在吸水纸上拍干液体；
4. 在有膜条的反应槽内加入酶标二抗溶液l毫升置摇床上室温下(25。C左右) 摇动至说明书规定的时间弃去槽内液体，加入洗液lml, —分钟后弃去槽内液体， 如此反复4次，最后在吸水纸上拍干液体；
5. 分别加入显色底物和显色剂一定体积，摇床上摇动至质控带和^r测区域有清 晰显色时加入终止液然后再摇动两分钟；
6. 用自来水冲洗掉槽内液体，取出印迹膜条，置吸水纸上待吸干水后和标准条 带卡进行比对判断结果；
7. 将印迹膜上起始线与标准条带起始线对齐，观察阳性显色条带和对应的标准 带位置比对即可判断显色区带是幽门螺旋杆菌的何种抗体。
图2是幽门螺杆菌抗体的免疫检测的一个优选实施例的检测结果图，用该 试剂盒检测空泡细胞毒素抗体阳性、尿素酶A抗体阳性和尿素酶B抗体阳性的 样本，检测结果如图2,将该检测结果条带与标准卡比对，表明，该样品为空泡 细胞毒素抗体阳性、尿素酶A抗体阳性、尿素酶B抗体阳性的样本。实施例三幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒的特异性、敏感性、均一行、 稳定性检测试验
1. 特异性
取4每毒抗体、乙肝抗体、丙肝抗体、艾滋病抗体、类风湿因子、大肠杆菌 抗体、金黄色葡萄球菌抗体阳性的血清使用试剂盒进行检测无交叉反应。
2. 每i:感性
经过与进口酶免试剂盒比对，该试剂盒达到酶免试剂盒同等水平。
3. 均一性
取同 一 阳性标本使用同 一批号试剂盒进行二十次检测无肉眼可见的差异， 使用不同批号的试剂盒冲企测二十次也无肉眼可见的明显差异。
4. 稳定性
试剂盒稳定性采用生物制品检定所推荐的37 。C加速破坏试验进行考核， 37。C加速破坏六天相当于4。C一年，经过加速破坏后与4。C保存的试剂盒比对无 肉眼可见差异，该试剂盒有效期暂定为一年。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1、一种幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒，包括盒体、印迹膜、酶标二抗、标准条带卡、显色底物、显色剂、终止液、洗液、反应槽，其特征在于，在所述印迹膜上有质控线和检测线，并在所述检测线上固定有幽门螺杆菌抗原。
2、 根据权利要求l所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述印迹膜为具 有蛋白吸附能力的膜载体。
3、 根据权利要求2所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述印迹膜为硝 酸纤维素膜(NC)或聚偏氟乙烯膜(PVDF)。
4、 根据权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌 抗原包括细胞毒素蛋白CagA、空泡细胞毒素蛋白VacA、幽门螺旋杆菌尿素酶A 单位蛋白和幽门螺旋杆菌尿素酶B单位蛋白。
5、 根据权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为 酶标记抗人IgG。
6、 根据权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的标准条带 卡上标注了对应于所述印迹膜相应位置上的所述幽门螺杆菌抗原和所述质控线 上的蛋白及其分子量。
7、 根据权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的显色底物 为过氧化氢或过氧化脲；所述的显色剂为四曱基联苯胺或二氨基联苯胺。
8、 根据权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为 硫酸、盐酸、氢氧化钠、氬氧化钾、乙二胺四乙酸钠或十二烷基磺酸钠。
9、 根据权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的洗液为磷 酸二氢钠-磷酸氢二钠緩冲液或者三羟基氨基甲烷-盐酸緩冲液。
10、 权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体的免疫检测试剂盒的检测方法，其 特征在于，样品稀释后，将所述印迹膜浸泡在稀释后的样品中孵育，然后洗涤， 再加入所述的酶标二抗孵育，再次洗涤，加入所述的显色底物和所述的显色剂， 反应后加入所述的终止液，然后与所述的标准条带卡对比确定抗体的种类。
全文摘要
本发明公开了一种幽门螺旋杆菌抗体的免疫检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括盒体、印迹膜、酶标二抗、标准条带卡、显色底物、显色剂、终止液、洗液、反应槽，在印迹膜上有质控线和检测线，并在检测线上固定有细胞毒素蛋白(CagA)、空泡细胞毒素蛋白(VacA)和幽门螺旋杆菌尿素酶A单位蛋白和幽门螺旋杆菌尿素酶B单位蛋白。检测时，先将样品与印迹膜上相应的抗原结合形成“抗原-抗体”复合物，洗涤后，加入酶标二抗，再洗涤，加入显色底物和显色剂，反应后加入终止液，然后与标准条带卡对比确定抗体的种类。该方法简单快速不需要任何设备，易于在中小型医院、基层普及与推广应用，且可以区分弱毒株和强毒株。
文档编号G01N33/569GK101435821SQ20081022016
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者周炬华, 李绍旭 申请人:周炬华;李绍旭