表达epha2和erbb2的细胞的协同治疗的制作方法

专利名称：表达epha2和erbb2的细胞的协同治疗的制作方法
技术领域：
本发明提供治疗表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞的方法。本发明还提供选择 接受治疗的患者群体的方法。
背景技术：
癌症瘤或肿瘤是细胞不受控制地异常生长产生的瘤块，可以是良性或恶性。良性肿瘤 通常保持在局部。恶性肿瘤统称为癌症。术语“恶性”通常指肿瘤可侵袭和破坏周围的身 体结构，并散布到远端部位引起死亡(综述参见Robbins和Angell，1976，《基础病理学》 (Basic Pathology)，第 2 版，费城 WBS 公司(W. B. Saunders Co. ,Philadelphia)，第 68-112 页)。癌症可出现在许多身体部位，其行为因其来源而不同。癌细胞会破坏产生其来源的身 体部位，然后散布到其他身体部位，开始新的生长并引发更多的破坏。美国每年有超过一百二十万人患上癌症。癌症是美国的第二大死因，如果这种趋 势继续下去，预计到2010年癌症会成为第一大死因。对美国男性而言，肺癌和前列腺癌是 最主要的癌症杀手。对美国女性而言，肺癌和乳腺癌是最主要的癌症杀手。在美国，两名男 性中就有一名在其毕生的某个时间被诊断患有癌症。在美国，三名女性中就有一名在其毕 生的某个时间被诊断患有癌症。目前的治疗手段，如手术、化疗和放疗常常无效或产生严重 的副作用。肿瘤细胞群获得在身体的远端和外部部位形成集落的能力时，常常产生对生命威 胁最大的癌症形式。这些转移细胞通过超越正常情况下限制细胞在不同组织内形成集落的 限制因素而存活。例如，通常情况下如果将典型的乳腺上皮细胞移植到肺中，它不会生长或 存活，但肺转移是乳腺癌发病和致死的主要原因。近年来有证据提示，在原发肿瘤出现临床 表现之前很长时间，转移细胞可能就已经在身体中散布。在检测到和去除原发肿瘤后的许 多个月或许多年，这些微量转移细胞可能保持休眠状态。因此，更好地理解转移细胞在外部 微环境中生长和存活的机制对改进设计对抗转移性癌症的治疗方法以及早期检测和定位 转移灶的诊断方法至关重要。癌症是信号传导异常的疾病。异常的细胞信号传导超越细胞生长和存活的锚定 依赖性限制(Rhim等，《癌发生的重要综述》(Critical Reviews in oncogenesis) 8 :305， 1997 ;Patarca，《癌发生的重要综述》(Critical Reviews in oncogenesis) 7 :343，1996 ；
3Malik Biochimica et Biophysica Acta 1287 73,1996 ；Callahan Breast Cancer Res Treat 35:105,1995)。酪氨酸激酶活性由ECM锚定诱导，实际上，恶性细胞中酪氨酸 激酶的表达或功能通常会增强(Rhim等，《癌发生的重要综述》8 :305，1997 ；CalIahan等， Breast Cancer Res Treat 35 105,1995 ；Hunter, Cell 88:333,1997)。根据酪氨酸激酶 活性为恶性细胞生长所必需的证据，用新治疗剂靶向酪氨酸激酶(Levitzki等，Science 267 :1782，1995 ；Kondapaka 等，Molecular 禾口 Cellular Endocrinology 117 :53，1996 ；Fry 等，Current Opinionin BioTechnology 6 :662，1995)。不幸的是，与特异性靶向肿瘤细胞 有关的障碍常常限制了这些药物的应用。具体说，酪氨酸激酶活性常常对良性组织的功能 和存活至关重要(Levitzki等，Science 267 :1782，1995)。为了最大程度降低伴随的毒性， 鉴定和靶向在肿瘤细胞中选择性过度表达的酪氨酸激酶靶点非常重要。实体瘤的恶性进展是一个复杂过程，其包括激活癌信号传导和下调肿瘤抑制途 径。此外，通过，例如新血管形成调节肿瘤微环境能提高肿瘤细胞的生长和存活，促进侵袭 和转移散布[综述见(Hahn 和 Weinberg，2OO2 ；Hanahan 和 Weinberg，2OOO ；Vogelstein 和KinZler，2004)]。在人癌症中常常观察到原癌基因，例如编码细胞表面受体酪氨酸激酶 (RTK)如EGF受体家族成员ErbB2的基因的癌基因转化或过度表达，它们促进恶性肿瘤的 形成。其它途径，如P53转录因子/基因组监督因子负向调节生长，这些途径组分的丢失 导致癌症[综述见(Blume-Jensen 和 Hunter，2001 ；Vogelstein 和 Kinzler，2004)]。近 年来有证据表明，Eph RTK在若干癌症类型中促进肿瘤在肿瘤实质和基质微环境(包括内 皮)中的进展[综述见(Brantley-Sieders 等，2004a ;Brantley-Sieders 和 Chen，2004)； (Brantley-Sieders 等，2005)]。受体酪氨酸激酶受体酪氨酸激酶(RTK)是由胞外配体结合域和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构 域构成的跨膜蛋白(Surawska 等，2004，Cytokine Growth Factor Rev. 15 :419_433)。这一 蛋白质家族含有超过五十种不同成员，根据结构组织可将它们分为至少19种不同类型，包 括生长因子受体(如EGF、PDGF、FGF)和胰岛素受体(Grassot等，2003，Nucl Acids Res.， 31(1) 353-358 ；Surawska等，2004，Cytokine Growth Factor Rev. 15 :419_433)。I 类RTK 包括例如，EGFR、ERBB2、ERBB3 和 ERBB4 ；II 类 RTK 包括例如，INSR、IRR 禾口 IGlR ；III 类 RTK 包括例如，PDGFa、PDGFb、Fms、Kit 和 Flt3 ；IV 类 RTK 包括例如，FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4 和 BFR2 ；V 类 RTK 包括 Fltl、Flt2 和 Flt4 ；VI 类 RTK 包括 EphAl_EphA8 和 EphBl_EphB6 ； VII 类 RTK 包括 TrkA、TrkB 和 TrkC (Grassot 等，2003，Nucl Acids Res. ,31 (1) :353_358)。 配体与胞外结合域结合后诱导胞内(胞浆)结构域中酪氨酸残基的自身磷酸化，进而导致 形成信号传导复合物并激活下游信号传导级联反应(Surawska等，2004，Cytokine Growth FactorRev. 15 :419_433)。EphA2Eph RTK家族是在基因组中鉴定到的最大的RTK家族，在脊椎动物中鉴定到至 少 15 种受体和 9 种配体[综述见(Brantley-Sieders 和 Chen，2004 ；Murai 和 Pasquale， 2003)]。根据同源性和对锚定于膜的两种不同类型肝配蛋白配体的结合亲和力，将该家族 细分为A类和B类。B类受体通常结合通过跨膜结构域附连于细胞膜的B类肝配蛋白，而 A类受体通常与糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接的A类肝配蛋白相互作用，但在某些家族成
4员中观察到一些类间结合[综述见(Brantley-Sieders和Chen，2004 ；Murai和Pasquale， 2003)]。Eph亚家族的受体通常具有一个激酶结构域以及含有富Cys区域和2个纤连蛋白 III型重复的胞外区。Eph受体及其膜结合性肝配蛋白配体是调节细胞粘附、形状和运动的 胞间通讯的重要介导物。Eph RTK信号传导事件控制着胚胎发育的多个方面，特别是神经系 统发育(综述见 Kullander 等，2002，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 :473 和 Mamling 等，2002， Trends Biochem Sci 27:514-520。这些分子在胚胎发生期间的作用是调节血管形成重塑 过程、轴突导向和组织边界形成[综述见(Pasquale，2005 ；Poliakov等，2004)]。Eph受体的许多成员被鉴定为癌症发生和进展的重要标记物和/或调节物(参 见例如 Thaker 等，2004，Clin. Cancer Res. 10 5145 ；Fox BP 等，2004，Biochem. Biophys. Res. Commun. 318 882 ；Nakada 等，2004，Cancer Res. 64 3179 ；Coffman 等，2003，Cancer Res. 63 :7907 ；也参见 Dodelet 等，2000，Oncogene 19:5614)。在已知与癌症有关的 Eph 受 体中，对EphA2和EphA4的作用和表达模式了解得最清楚。EphA2(上皮细胞激酶)是受体酪氨酸激酶Eph家族中的一个130kDa成员(Zantek N.等，1999，Cell Growth Differ. 10 :629_38 ；Lindberg R.等，1990，Mol. Cell. Biol. 10 6316-24)。虽然仍在研究EphA2的功能，但有证据提示它能调节结肠上皮的增殖、分化和 屏障功能(Rosenberg I.等，1997，Am. J. Physiol. 273 :G824_32)，血管网络组装、内皮迁 移、肿瘤血管新生和血管新生(D. M. Brantley，J. Caughron, D. Hicks, A. Pozzi, J. C. Ruiz 和J. Chen (2004) “EphA2受体酪氨酸激酶通过PI3K介导的Racl活化调节内皮细胞迁 移禾口组装(EphA2 receptortyrosine kinase regulates endothelial cell migration and assembly viaPI3K_mediated Racl activation) "J.Cell Sci. 117 :2037_3049, D. Brantley, N. Cheng, E. Thompson, Q. Lin, R. A. Brekken, P. E. Thorpe, R. S. Muraoka,, D. Cerretti, A. Pozzi, D. Jackson, C. Lin 和 J. Chen. (2002)可溶性 EphA 受体在体内 抑制月中瘤进展禾口血管新生(Soluble EphA receptor inhibit tumorprogression and angiogenesis in vivo). Oncogene 21 :7011_7026, N. Cheng, D.Brantley, H. Liu, A. Lin, M. Enriquiz, D. Ceretti, N. Gale, G. Yancouplous, T. Daniel 禾口 J. Chen. (2002)阻断 EphA 受体酪氨酸活化能抑制VEGF依赖性血管新生(Blockade of EphA receptor tyrosine activation inhibits VEGF-dependentangiogenesis. ). Mol. Cancer Res.(以前禾尔为 《细胞生长和分化》(Cell Growth andDifferentiation)) 1 :2_11，N. Cheng, D. Brantley, H. Liu, W. Fanslow,D. Cerretti，D. Jackson，和 J. Chen. (2003)用可溶性EphA 受体抑制 VEGF 依赖性多阶段癌发生(Inhibition of VEGF-dependent multi-stage carcinogenesis by soluble EphAreceptors). Neoplasia 5 445~456, D. Μ. Brantley-Sieders, W. B. Fang, D. Hicks, T. Koyama, Y. Shyr，和J. Chen. (2005)EphA2缺陷型小鼠中肿瘤微环境破坏会抑 制肿瘤血管新生和转移性进展(Impaired tumor microenvironment inEphA2-deficient mice inhibits tumor angiogenesis and metastatic progression). FASEB J. 19 1884-6，D. M. Brantley-Sieders, W. B. Fang, Y. Hwang,和 J. Chen. (2006)在体内肝配蛋 白-Al通过血管新生依赖性机制促进肿瘤转移(Ephrin-Alfacilitates tumor metastasis via an angiogenic-dependent mechanism in vivo). Cancer Res. 66 :10315-10324),神经 系统分割(Segmentation)禾口轴突导向(pathfinding) (Bovenkamp D.禾口 Greer P. ,2001, DNA Cell Biol. 20 :203_13)，肿瘤新血管形成(Ogawa K.等，2000，Oncogene 19:6043-52)和癌症转移(国际专利公开号 WO 01/9411020,WO 96/36713,WO 01/12840,WO 01/12172)。EphA2的天然配体是肝配蛋白Al (Eph命名委员会，1997，Cell90(3) :403_4 ；Gale 等，1997，Cell Tissue Res. 290(2) :227_41)。认为EphA2和肝配蛋白Al的相互作用帮助 使细胞锚定在器官表面上，也通过EphA2自身磷酸化降低EphA2表达，从而下调上皮和/或 内皮细胞的增殖(Lindberg等，1990)。在天然条件下，这种相互作用帮助维持保护器官的 上皮细胞屏障并帮助调节上皮细胞的增殖和生长。然而，有些疾病状态会防止上皮细胞形 成保护性屏障，或引起上皮和/或内皮细胞的破坏和/或脱落，从而阻碍正常的愈合过程。EphA2在成年人上皮中低水平表达，并在胞间粘着部位内富集(Zantek等，1999， Cell Growth and Diff 10 :629 ;Lindberg 等，1990，Mol and Cell Biol 10:6316)。因为 EphA2结合锚定于细胞膜的肝配蛋白A1-A5 (Eph命名委员会，1997，Cell 90 403 ；Gale等， 1997,Cell and Tissue Res 290 :227)，所以这种亚细胞定位很重要。配体结合的主要后果 是EphA2自身磷酸化(Lindberg等，1990)。然而，与其他受体酪氨酸激酶不同的是，EphA2 在不存在配体结合或不含磷酸化酪氨酸时也能保持酶活性(Zantek等，1999)。EphA2和肝 配蛋白-Al在包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、皮肤癌和食道癌在内的各种肿瘤 的转化细胞中上调(Ogawa 等，2000，Oncogene 19 6043 ；Zelinski 等，2001，Cancer Res 61 2301 ；Walker-Daniels 等，1999，Prostate 41 275 ；Easty 等，1995，Int J Cancer 60 129 ；Nemoto 等，1997，Pathobiology 65:195 ；Hess 等，2001，Cancer Res 61(8) :3250_5)。更近期来看，此种RTK家族的成员(包括EphA2)与肿瘤进展和新血管形成有关 联[综述见(Brantley-Sieders等，2004)]。有越来越多的证据表明，EphA2表达可能与 肿瘤进展有因果关系。在包括原发和移植的啮齿动物肿瘤、人肿瘤异种移植物和原发性 人肿瘤活检样品等在内的癌症模型中观察到EphA2受体酪氨酸激酶过度表达[综述见 (Brantley-Sieders 等，2004 ；Brantley-Sieders 禾口 Chen，2004 ；Ireton 禾口 Chen，2005)]。 实验诱导的EphA2过度表达导致未转化的MCF10A乳腺细胞发生恶性转化并提高胰腺癌细 胞的恶性程度(Duxbury等，2004 ；Zelinski等，2001)。相反地，siRNA介导的EphA2表达 抑制会破坏胰腺肿瘤、卵巢肿瘤和间皮瘤细胞系的恶性进展，而显性负EphA2构建物的过 度表达会在体内抑制4T1转移小鼠乳腺腺癌细胞的生长和转移(Duxbury等，2004 ；Landen 等，2005 ；Nasreen等，2006，Fang, 2005)。破坏内源性受体活化的EphA-Fc受体蛋白会在 体内显著抑制肿瘤的生长和新血管形成(Brantley等，2002 ；Cheng等，2003 ；Dobrzanski 等，2004)。结合观察到的EphA2受体信号传导诱导促增殖性P42/44促分裂原活化蛋白激 酶(MAPK)家族成员Erk在肿瘤细胞系中的磷酸化和活化(Pratt和Kinch，2002 ；Pratt和 Kinch, 2003)，这些数据提示EphA2受体是癌基因。然而，其它证据提示EphA2可能是抑癌基因。与对照同窝出生动物相比，EphA2 缺陷型基因陷阱小鼠更易于发生化学致癌物诱导的皮肤癌，并且出现肿瘤细胞增殖增加和 Erk磷酸化水平升高(Guo等，2006)。用可溶性肝配蛋白-Al-Fc配体刺激EphA受体能降低 肿瘤细胞系、成纤维细胞和原代主动脉内皮细胞中的Erk磷酸化，并抑制原代角质形成细 胞和前列腺癌细胞的生长(Guo等，2006 ；Macrae等，2005 ；Miao等，2001)。Macrae等也报 道，用肝配蛋白Al-Fc处理人乳腺癌细胞系会刺激EphA2磷酸化、减轻EGF介导的Erk磷酸 化并抑制表达v-erbB2的NIH3T3细胞转化(Macrae等，2005)。此外，据报道，EphA2是抑 癌基因 p53 的转录靶点(Dohn 等，2001 Jin 等，2006 ；Yang 等，2006 ；Zhang 等，2003)。在肺癌和乳腺癌细胞系中过度表达会负向调节增殖并诱导凋亡(Dohn等，2001 Jin等，2006)。 这些数据表明，EphA2是抑癌基因。RTK 的 HER 家族受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介导物。该受体家 族包括四种不同成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbBl或HER1)、HER2 (ErbB2或ρ 185neu)、HER3 (ErbB3)和 HER4 (ErbB4 或 tyro2)。erbBl基因编码的EGFR与人的恶性肿瘤有因果关系。具体说，在乳腺癌、膀胱癌、 肺癌、头颈癌和胃癌以及胶质母细胞瘤中观察到EGFR的表达增加。EGFR受体表达增加常常 与相同肿瘤细胞的EGFR配体，即转化生长因子α (TGF-α)产量增加相关联，导致通过自分 泌刺激途径活化受体(Baselga 和 Mendelsohn，Pharmac. Ther. ,64 127-154 (1994))。针对 EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体被评价为治疗这类恶性肿瘤的治疗剂。参见例 如，Baselga 和 Mendelsohn. ；Masui 等，Cancer Research, 44 1002-1007 (1984)；和 Wu 等， J.Clin. Invest. ,95 1897-1905(1995)。HER家族的第二个成员pl85neu(也称为HER2和ErbB2)最初鉴定为化学处理大 鼠的神经母细胞瘤的转化基因产物。通过对编码蛋白跨膜区进行点突变(缬氨酸至谷氨 酸)获得neu原癌基因的活化形式。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同源物扩增， 这与预后差相关(Slamon 等，Science, 235 177-182 (1987) ； Slamon 等，Science, 244 707-712(1989)；和美国专利号4，968，603)。迄今为止，在人肿瘤中尚未报道类似neu原癌 基因中的点突变。在胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌等 其它癌症中也观察到HER2过度表达(常常过度表达，但由于基因扩增导致不一致)。参 见 King 等，Science, 229 974(1985) ；Yokota 等，Lancet, 1 :765_767 (1986) ；Fukushige 等，Mol Cell Biol. ,6 955-958 (1986) ；Guerin 等，Oncogene Res.，3 :21_31 (1988)； Cohen 等，Oncogene，4 :81_88 (1989) ；Yonemura 等，Cancer Res. ,51 1034(1991) ；Borst 等，Gynecol. Oncol. ,38 364(1990) ；Weiner 等，Cancer Res. ,50 :421_425 (1990) ；Kern 等，Cancer Res. ,50 5184(1990) ；Park 等，Cancer Res. ,49 6605(1989) ；Zhau 等，Mol. Carcinog.，3 :254_257(1990) ；Aasland 等，Br. J. Cancer, 57 :358_363(1988) ；Williams 等，Pathobiology，59 :46_52(1991)；和 McCann 等，Cancer，65 88-92(1990)等等。HER2 可 能在前列腺癌中过度表达(Gu 等，Cancer Lett. ,99 =185-9(1996) ；Ross 等，Hum. Pathol.， 28 827-33(1997) ；Ross 等，Cancer，79 :2162_70 (1997)；和 Sadasivan 等，J.Urol·，150 126-31(1993))。HER2扩增/过度表达是与侵袭性疾病和预后差相关联的乳腺癌早期事件。在 20-25%原发性乳腺癌肿瘤中发现HER2基因扩增(Slamon等，Science，244 707-12 (1989)； Owens 等，Breast Cancer Res Treat，76 :S68 摘要 236 (2002) )。HER2 阳性疾病与无复发总 体存活率降低相关(Slamon 等，Science, 235 :177_82 (1987) ；Pauletti 等，J. Clin Oncol, 18 =3651-64(2000)) 0在淋巴结阳性疾病中HER2基因扩增与至复发时间明显缩短和存活率 低相关联(Slamon等(1987) ；Pauletti等(2000))，在淋巴结阴性疾病中与后果差相关联 (Press 等，J. ClinOncol, 1997 ；15 :2894_904(1997) ；Pauletti 等(2000))。既然RTK在过度增殖性疾病如癌症的发病和进展中起作用，显然不仅需要治疗这
7些疾病的方法，而且需要选择接受定制治疗的候选群体的方法。不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明 的现有技术。

发明内容
在一个实施方式中，本发明提供一种降低过度增殖细胞增殖的方法，所述方法包 括a)鉴定表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞群体；和b)给予靶向EphA2的药剂。在另 一实施方式中，本发明提供一种降低表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞增殖的方法，所述 方法包括给予靶向EphA2的药剂。在另一实施方式中，本发明提供一种降低表达EphA2和 ErbB2的过度增殖细胞增殖的方法，所述方法包括给予靶向EphA2的药剂，还包括给予靶向 ErbB2的药剂。在又一实施方式中，本发明提供一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括(a)确定EphA2和ErbB2在所述患者癌细胞中的表达水平、存在或含量；(b)确 定步骤(a)中评估的表达水平或含量高于或是低于与患者临床获益提高或降低相关的某 种含量；和(c)如果确定所述患者的癌细胞表达EphA2和ErbB2，则给予抗_EphA2和/或 抗-ErbB2靶向剂。在另一个实施方式中，本发明提供一种预筛选用抗_EphA2和/或抗-ErbB2药剂 治疗的患者群体的方法，所述方法包括(a)确定EphA2和ErbB2在所述患者癌细胞中的表 达水平、存在或含量；(b)确定步骤(a)中评估的表达水平或含量高于或是低于与患者临床 获益提高或降低相关的某种含量。附图简述出于阐述本发明的目的，附图中描述了本发明的某些实施方式。然而，本发明不仅 限于附图中描述的实施方式的精确安排和手段。

图1.在MMTV-Neu小鼠中EphA2_缺陷降低了乳腺的肿瘤发生、转移、增殖和血 管水平。(A)出生后8个月分析时，与杂合(+/-)和野生型(+/+)对照雌性小鼠相比， MMTV-Neu/EphA2-/-雌性小鼠中乳腺上皮增生和肿瘤形成较少见。出生后1年分析时，与 对照相比MMTV-Neu/EphA2-/-雌性小鼠中的肿瘤形成和肺转移频率均有降低。(B)也观 察到与对照相比MMTV-Neu/EphA2-/-雌性的肺表面损伤数量明显降低(ρ < 0. 05 ；单因子 AN0VA)。数据表示为平均值+SEM。(C)由出生后8个月的EphA2+/+、+/-和-/-MMTV-Neu 雌性转基因动物收集的4号腹股沟乳腺的全组织标本包埋苏木精染色说明，相对于对照在 EphA2-/_腺体中增生减少。左上图显示遍布上皮增生的+/+腺体，中图所显示具有局灶 性增生的+/_腺体。*表示腹股沟淋巴结。下图显示的对侧腹股沟乳腺的苏木精和伊红染 色切片揭示出，Neu/EphA2-/-组织样品中的上皮细胞含量低于+/-和+/+对照。比例尺 =250mm。(D)在由出生后8个月的转基因动物收集的乳腺制备的组织切片中，通过定量 测定PCNA核染色(上图，箭头)评估增殖。相对于MMTV-Neu/EphA2+/+对照，MMTV-Neu/ EphA2-/"乳腺中PCNA+核的百分数显著降低(ρ < 0. 05 ；单因子AN0VA)。比例尺=50mm。 与MMTV-Neu/EphA2+/+对照相比，在MMTV_Neu/EphA2-/-乳腺中观察到的TUNEL试验测定 的凋亡核(下图，箭头)百分数未出现显著降低。(E)相对于EphA2+/+细胞，通过BrdU核 掺入(箭头，上图)评估的分离自EphA2-/_动物的原代乳腺上皮细胞增殖水平也降低(ρ< 0. 05 ；双尾、配对斯氏T检验)。有趣的是，相对于对照，EphA2缺陷型原代乳腺上皮细胞 中凋亡(下图中的箭头指出TUNEL+核)也显著减少(ρ <0.05;双尾、配对斯氏T检验)， 这一表型可能被乳腺上皮原位的宿主微环境所掩盖。(F)由出生后1年的转基因雌性动物 收集的MMTV-Neu肿瘤的苏木精和伊红染色切片显示，相对于+/_和+/+对照，EphA2_/_肿 瘤中的囊性变性内腔形成增加。比例尺=250mm。(G)相对于MMTV-Neu/EphA2+/-和+/+ 对照，MMTV-Neu/EphA2-/-肿瘤中PCNA+核(箭头)的百分数显著降低(P < 0. 05 ；单因子 AN0VA)。比例尺=50mm。(H)通过对内皮特异性标记物⑶31进行免疫组化染色评价，相对 于+/-和+/+对照，MMTV-Neu/EphA2-/-肿瘤中的微血管密度显著降低(P < 0. 05 ；单因子 AN0VA) ο箭头指出CD31+血管。比例尺=100mm。图2. EphA2表达缺失会降低MMTV-Neu肿瘤细胞的肿瘤形成和侵袭性。㈧在用表 达EphA2 siRNA序列的逆转录病毒转导的MMTV-Neu肿瘤细胞中EphA2表达显著降低，而在 用携带无关对照序列的逆转录病毒转导的对照肿瘤细胞中没有这种现象。EphA2表达降低 会伴随着磷酸化Erk水平的降低。⑶将细胞接种于生长因子减少的基质胶，产生三维球状 培养物。培养8天后，亲代和对照siRNA肿瘤细胞形成具有侵袭性突出体的形状不规则的大 细胞群(箭头示出突出体)。相反，表达EphA2 siRNA序列的肿瘤细胞形成维持圆形且只有 很少突出体的较小细胞群，这表明侵袭性降低。上图比例尺=200mm，下图为50mm。我们通 过计算单个集落所占的平均像素面积确定，与对照细胞相比，EphA2表达降低的细胞的集落 显著缩小(P < 0. 05 ；单因子AN0VA)。(C)用T0-PR0-3碘化物核染料(蓝色)和抗-E-钙 粘着蛋白(绿色)对三维培养物进行染色，通过共聚焦显微术拍照观察。虽然表达siRNA 的亲代和对照Neu肿瘤细胞均形成具有侵袭性突出体的多腺泡结构(箭头指出突出体)，但 表达EphA2siRNA序列的肿瘤细胞形成的腺泡结构更圆更均一，由围绕中心腔体的单层上 皮细胞构成(箭头指出腔体)。比例尺=20mm。(D)原位植入FVB雌性接受小鼠经清除的 脂肪垫中后5周时，表达对照siRNA序列的肿瘤细胞产生的肿瘤体积与植入亲代MMTV-Neu 肿瘤细胞产生的肿瘤体积相当。然而，表达EphA2siRNA序列的肿瘤细胞无法形成肿瘤，或 者只在一小部分动物中形成非常小的不可触知的肿瘤(P < 0. 05 ；单因子AN0VA)。数据表 示为平均值士 SEM。图3.过度表达ErbB2/HER2的MCFlOA细胞中EphA2表达水平升高能增强体外生长 和侵袭性。(A)用表达EphA2(Ad-EphA2)或对照b_半乳糖苷酶(Ad-bgal)的腺病毒转导亲 代MCFlOA人乳腺细胞和过度表达人ErbB2/HER2的MCF10A，接种到生长因子减少的基质胶 上，产生三维球状培养物。培养10天后，亲代MCFlOA细胞和表达Ad-bgal的细胞形成圆形 小腺泡结构，而MCF10A.HER2细胞形成具有不规则、侵袭性突出体的大集落。在MCFlOA细胞 中表达Ad-EphA2产生较大的不规则集落，这种效果在MCF10A. HER2细胞中放大(ρ < 0. 05 ； 单因子ANOVA ；箭头指出侵袭性突出体)。比例尺=25mm。(B)用T0-PR0-3碘化物核染料 (红色)和抗-Ki67(绿色)对三维培养物进行染色，通过共聚焦显微术拍照观察。共聚焦 分析揭示出，亲代和Ad-bgal转导的MCFlOA形成由围绕中心腔体的单层上皮细胞组成的均 一腺泡结构，而MCF10A.HER2细胞形成具有侵袭性突出体的多腺泡结构(箭头指出突出体) 和边界不清晰的含有若干细胞的内腔。用Ad-EphA2转导的MCFlOA细胞也形成具有边界不 清晰的含有若干细胞的内腔的多腺泡结构。在过度表达EphA2的MCF10A. HER2中，侵袭性 和腔体填充度提高。比例尺=20mm。增殖标记物Ki67阳性核(箭头指出Ki67+核)的百
9分数的定量测定表明，EphA2过度表达显著增强MCFlOA和MCF10A. HER2细胞形成的腺泡结 构内的增殖(P < 0. 05 ；单因子AN0VA)。(C)通过免疫印迹证实MCF10A/HER2细胞中腺病 毒基因产物的表达和ErbB2/HER2的过度表达，通过肌动蛋白免疫印迹验证均一的上样量。图4.在Neu/ErbB2_介导的肿瘤形成中，Ras/Erk活化和增殖需要EphA2。(A)相 对于EphA2+/+细胞，通过BrdU核掺入(箭头)评估的分离自EphA2_/_动物的原代乳腺肿 瘤细胞(PMTC)增殖水平降低(ρ < 0. 05 ；双尾，配对斯氏T检验)。比例尺=20mm。(B)用 GST-Raf Ras结合域免疫沉淀肿瘤细胞中GTP结合的Ras进行测定时，与野生型细胞相比， 在EphA2缺陷型原代肿瘤细胞中，未刺激细胞的Ras活性和Erk磷酸化水平降低。通过对 总Ras、总Erk和肌动蛋白进行免疫印迹证实均一的上样量。对肿瘤细胞裂解物中的EphA2 和ErbB2进行免疫沉淀和免疫印迹，从而证实EphA2-缺陷和Neu/ErbB2的均一表达。在未 刺激的野生型肿瘤细胞中EphA2被磷酸化，与EphA2缺陷型原代肿瘤细胞相比野生型中检 测到的ErbB2磷酸化没有变化。(C)在分离自三个独立的野生型或EphA2缺陷型肿瘤的全 肿瘤提取物中证实Ras和Erk活性降低。(D)在拯救实验中，用表达Erk-I或对照b_半乳 糖苷酶(bgal)的腺病毒转导EphA2缺陷型MMTV-Neu原代肿瘤细胞，48小时后进行BrdU掺 入实验。与表达对照bgal的PMTC相比，EphA2缺陷型PMTC中Erk-I的过度表达显著增强 血清诱导的增殖(-/-Ad-bgal相对于+/+或-/-Ad-Erk-I的ρ < 0. 05 ；单因子AN0VA)。通 过免疫印迹证实腺病毒转基因的表达。图5.在Neu/ErbB2介导的恶性肿瘤中，RhoA活化和肿瘤细胞迁移需要EphA2。(A) 在Transwell迁移实验中，与野生型PMTC相比，EphA2_缺陷型PMTC对补充10 %血清的生长 培养基产生反应而迁移的比例显著降低(p<0. 05 ；双尾、配对斯氏T检验)。(B)用GST-Rho 靶蛋白Rho-结合域免疫沉淀肿瘤细胞裂解物和全肿瘤提取物中GTP结合的RhoA测定时， 与野生型细胞/肿瘤相比，EphA2缺陷型PMTC和完整肿瘤中RhoA活性降低。有趣的是，我 们也观察到与野生型对照相比，EphA2缺陷型MMTV-Neu肿瘤细胞和全肿瘤提取物中总RhoA 蛋白水平降低。观察到EphA2-缺陷型和野生型PMTC的肿瘤细胞裂解物中，结合GTP的活 化Rac或总Rac蛋白水平无改变。(C)在拯救实验中，用表达组成性活性RhoA(Q63L)或对 照b-半乳糖苷酶(bgal)的腺病毒转导EphA2缺陷型MMTV-Neu原代肿瘤细胞，48小时后 进行迁移实验。组成性活性RhoA的表达能将血清诱导的EphA2-缺陷型肿瘤细胞迁移恢复 至与源自野生型动物的肿瘤细胞相当的水平，而对照b-gal无影响(-/-Ad-bgal相对+/+ 或-/-Ad-Rho的ρ < 0. 05 ；单因子AN0VA)。通过免疫印迹和Rho活性实验证实腺病毒转基 因的表达。图6. EphA2在物理上和功能上与ErbB2相互作用。(A)在未经处理或用化学交联 剂DSSTP处理的野生型MMTV-Neu肿瘤细胞中，内源性ErbB2和EphA2分别用抗_EphA2或 抗-ErbB2抗体共同免疫沉淀。所检测的相互作用是特异性的，因为对照IgG不能免疫沉淀 EphA2和ErbB2。通过检测裂解物中EphA2和ErbB2的表达验证均一输入。(B)用质粒转染 C0S7细胞以表达EphA2或ErbB2。由细胞裂解物免疫沉淀EphA2，分析产物中的EphA2和 ErbB2。EphA2和ErbB2共同表达足以进行共同免疫沉淀。通过免疫印迹测定输入裂解物内 EphA2和ErbB2表达，以证实均一的转染效率。在没有刺激的情况下，C0S7细胞中ErbB2和 EphA2的共同表达足以将EphA2磷酸化诱导至单独EphA2过度表达诱导的磷酸化基础水平 之上。(C)在过度表达HER2的MCFlOA细胞中观察到EphA2和人ErbB2 (HER2)之间的相互作用，因为在过度表达HER2的细胞中，用抗_EphA2抗体能共同免疫沉淀EphA2和HER2，但 在亲代MCFlOA没有此种现象。相对于亲代MCFlOA细胞，在过度表达HER2的MCFlOA细胞 中观察到EphA2磷酸化水平升高，用ErbB2激酶抑制剂AG825处理过度表达HER2的MCFlOA 细胞能降低EphA2磷酸化以及ErbB2磷酸化。图7.在MMTV-PyV-mT肿瘤中EphA2_缺陷不影响肿瘤发生、微血管密度或生长调 节信号传导途径。(A)出生后100天分析时，相对于野生型或杂合对照，在MMTV-PyV-mT/ EphA2-/_雌性动物中观察到肿瘤体积或肺转移数量没有显著差异。数据表示为平均值 士SEM。(B)通过免疫组化染色证实EphA2缺陷型PyV_mT肿瘤中不表达EphA2蛋白。比例 尺=50mm。(C)通过对内皮标记物血管假性血友病因子(vWF ；箭头指出vWF+血管)进行免 疫荧光染色，检测到微血管密度没有改变。比例尺=100mm。(D)相对于野生型对照，观察 到EphA2缺陷型MMTV-PyV-mT全肿瘤提取物中结合GTP的活性Ras或磷酸化Erk水平无改 变，RhoA的表达水平也没有任何改变。通过对总Ras、总Erk和微管蛋白进行免疫印迹证实 均一的上样量。(E)相对于分离自MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT雌性小鼠的肿瘤组织，评估分 离自FVB雌性小鼠的正常乳腺组织中EphA2的表达和磷酸化。相对于正常组织，在两种肿瘤 类型中观察到EphA2过度表达和磷酸化水平升高，在MMTV-Neu肿瘤中观察到的水平最高。 观察到ErbB2和肝配蛋白-Al在两种肿瘤类型中过度表达，在MMTV-PyV-mT和MMTV-Neu肿 瘤中肝配蛋白-Al表达相当，在MMTV-Neu肿瘤中ErbB2水平较高。通过对肌动蛋白进行免 疫印迹证实均一的上样量。(F)比较源自MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT小鼠的原代乳腺上皮细 胞(PMEC)裂解物与原代乳腺肿瘤细胞(PMTC)中的EphA2水平，以证实EphA2在上皮中特 异性过度表达。图8.用抗-EphA2抗体治疗能抑制MMTV-Neu的肿瘤生长，但不能抑制 MMTV-PyV-mT肿瘤生长。(A)用抗-鼠EphA2抗体处理能降低源自MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT 小鼠的肿瘤细胞中的EphA2表达。用对照IgG(10mg/ml)或浓度递增的抗_EphA2抗体处理 肿瘤细胞48小时。通过免疫印迹评估肿瘤细胞裂解物中的EphA2表达，通过对肌动蛋白 进行免疫印迹证实均一上样量。除去印迹，用抗_EphA4抗体作为抗体特异性对照再次检 测。(B)将源自野生型MMTV-Neu小鼠的细胞原位植入雌性FVB接受小鼠经清除的脂肪垫 内。植入2周后，向小鼠腹膜内注射抗_EphA2抗体或对照IgG(10mg/kg)，每周两次，共三 周。植入5周后收获肿瘤进行分析。相对于对照IgG治疗的小鼠，观察到用抗-EphA2抗体 治疗的动物肿瘤体积明显缩小(P < 0. 05 ；单因子AN0VA)。数据表示为平均值士SEM。(C) 通过核PCNA表达评估时，与对照相比，抗-EphA2治疗动物的肿瘤细胞增殖也显著降低(ρ < 0. 05 ；单因子ANOVA ；黑色箭头指出PCNA+核)。比例尺=50mm。(D)通过免疫组化(上 图)和免疫印迹(下图)评估时，相对于IgG对照，抗-EphA2处理的肿瘤中EphA2表达明 显降低。除去印迹，再次检测肌动蛋白表达以验证均一的上样量。比例尺=50mm。(E)根 据vWF荧光定量结果，观察到相对于对照，由抗EphA2治疗小鼠分离的肿瘤中微血管密度显 著降低(P < 0. 05 ；单因子AN0VA)(白色箭头指出vffF+血管)。比例尺=IOOmm0 (E)将源 自MMTV-PyV-mT小鼠的细胞原位植入FVB雌性接受小鼠经清除的脂肪垫内，如上所述用抗 EphA2抗体或对照IgG治疗。相对于对照IgG治疗小鼠，抗_EphA2抗体治疗动物的肿瘤体 积没有显著改变。图9. EphA2_缺陷会阻碍一部分MMTV-Neu动物的周围脂肪垫的乳腺上皮渗透。(A)
11由出生后8个月的EphA2+/+和-/-MMTV-Neu雌性转基因动物收集的4号腹股沟乳腺的全组 织标本包埋苏木精染色说明，乳腺上皮无法经过腹股沟淋巴结后完全渗入乳腺脂肪垫(最 右侧的图片中虚线显示渗透程度)Γ)，在大约30% -/"动物中观察到这种表型。左图和中 图分别显示+/+和独立-/_乳腺的全组织标本包埋制备物以便比较。(B)通过对EphA2的 免疫组化染色验证，相对于野生型对照，EphA2缺陷型组织样品的乳腺上皮(箭头，上图)和 乳腺血管(箭头，下图)中不表达EphA2蛋白。比例尺=50mm。(C)ErbB2的免疫组化染色 揭示出在EphA2+/+、+/_或-/-MMTV-Neu肿瘤之间，ErbB2的表达或定位没有显著差异。比 例尺=50mm。图10.在MMTV-Neu/EphA2缺陷型肿瘤中观察到的血管缺陷部分由宿主内皮中不 表达EphA2造成。(A)将源自MMTV-Neu动物的肿瘤细胞原位植入野生型或EphA2缺陷型 FVB宿主动物经清除的脂肪垫内。植入5周后，相对于野生型对照，在由EphA2缺陷型宿主 动物收集的肿瘤中观察到肿瘤体积显著缩小(P < 0. 05 ；单因子AN0VA)。(B)与前述研究一 致的是，根据对vWF免疫荧光的定量测定，相对于野生型对照，由EphA2缺陷型宿主分离的 肿瘤中微血管密度显著降低(P < 0. 05 ；AN0VA)(箭头指出vWF+血管)。比例尺=IOOmm0 (C)为了确定血管募集方面的缺陷是否由宿主内皮中不表达EphA2造成，进行肿瘤细胞-内 皮细胞共同培养迁移实验(参见附图)。将绿色荧光标记物标记的野生型MMTV-Neu肿瘤 细胞接种到基质胶包被的Transwell孔的下表面。源自野生型或EphA2缺陷型动物的内 皮细胞用红色荧光染料进行标记，并加入transwell的上层隔室中，测定因源自肿瘤的信 号而募集到下表面的内皮细胞。5小时后，与对照野生型内皮细胞相比，transwell下表面 的EphA2-缺陷型内皮细胞明显较少(ρ < 0. 05 ；双尾、配对斯氏T检验)(箭头指出迁移到 transwell下表面的内皮细胞)。图11. EphA2-缺陷会降低源自MMTV-Neu小鼠的原代乳腺上皮细胞(PMEC)中的 Erk磷酸化以及乳腺上皮中的磷酸化-Erk。(A)与原代肿瘤细胞中的观察结果相一致，在肝 配蛋白-Al配体表达水平无变化的情况下，分离自EphA2缺陷型MMTV-Neu动物的PMEC中 磷酸化-Erk的基础水平低于源自野生型动物的对照PMEC。通过对PMEC裂解物中的EphA2 进行免疫沉淀证实EphA2缺陷。(B)与这些观察结果相一致，相对于野生型MMTV-Neu乳腺， 由EphA2缺陷型乳腺制备的组织切片中p-Erk表达水平较低。比例尺=50mm。图12.用抗-EphA2抗体处理会下调MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT肿瘤细胞中的EphA2 表达，但不影响MMTV-Neu肿瘤中的ErbB2表达。(A)对ErbB2的免疫组化染色揭示出，在 由对照IgG与抗-EphA2抗体治疗的动物收获的MMTV-Neu肿瘤中，ErbB2的表达和定位没 有显著差异。用对照兔IgG检测相邻切片，以证实ErbB2的染色特异性。比例尺=50mm。 ⑶根据vWF荧光，与对照相比，抗-鼠EphA2抗体治疗对MMTV-PyV-mT肿瘤中的微血管密 度无影响(箭头指出vWF+血管)。比例尺=100mm。(B)与IgG治疗的对照荷瘤动物相比， 抗-鼠EphA2抗体治疗会降低MMTV-PyV-mT肿瘤中的EphA2表达。比例尺=50mm。发明详述大量工作说明，肿瘤发生是多步过程，不同癌基因常常通过合作促进肿瘤进展的 不同步骤[综述见(Hahn 和 Weinberg，2002 ；Hanahan 和 Weinberg，2000 ；Vogelstein 和 Kinzler, 2004)]。申请人已证明，EphA2和ErbB2在肿瘤细胞表面的物理相互作用能在不存 在配体刺激的条件下诱导EphA2受体磷酸化。ErbB2和EphA2之间的相互作用放大了 Ras/Erk信号转导和Rho GTP酶活化(图4和5)，可能会促进表达EphA2的肿瘤细胞的增殖和 移动增加。此观察结果反映出如何治疗表达ErbB2的乳腺癌，特别是用抗_ErbB2治疗难治 的乳腺癌。这些结果表明，抗_EphA2治疗可能单独或与有效靶向ErbB2的方法结合对抗表 达ErbB2的肿瘤。虽然EphA2在各种肿瘤，包括乳腺癌中过度表达[综述见(Brantley-Sieders等， 2004a ；Brantley-Sieders 和 Chen，2004 ；Ireton 和 Chen，2005)]，但本发明说明其本身的 过度表达不一定表明在肿瘤发生中的活性作用。在本研究中，在发生乳腺癌的MMTV-Neu和 MMTV-PyV-mT模型产生的肿瘤中，记录到EphA2显著过度表达。然而，虽然缺失EphA2能显 著减少MMTV-Neu动物中的肿瘤起始和进展，但在只表达中等水平ErbB2的MMTV-PyV-mT模 型中EphA2缺陷对肿瘤进展无影响。因此，EphA2过度表达的功能性后果取决于共同表达 的癌基因。因此，有效治疗性靶向EphA2时需要理解在特定肿瘤类型内EphA2如何与共同 存在的癌基因信号传导网络合作并对其产生功能性影响。例如，虽然EphA2蛋白水平下调 对人卵巢肿瘤异种移植瘤有功效(Landen等，2006)，但独立的类似设计的抗体实际对CT26 人结肠癌异种移植瘤或人乳腺癌异种移植瘤无效(Kiewlich等，2006)。有趣的是，如同 MMTV-PyV-mT肿瘤细胞那样，CT26细胞不过度表达ErbB2/HER2 (Penichet等，1999)，这表明 EphA2过度表达增加了恶性转化和进展，特别是在ErbB2过度表达的情况下，因此是这类肿 瘤中的合适靶点。虽然据报道EphA2在各种人上皮癌，包括超过80 %乳腺癌临床样品中均有过度表 达(Ogawa等，2000 ；Pan, 2005 ；Zelinski等，2001)，仅在约30%人乳腺癌中观察到HER2过 度表达(Ursini-Siegel等，2007)。而且，在近期对134例人乳腺癌样品的筛选中，EphA2和 HER2表达无关联(Pan，2005)。本发明提供与ErbB2相互作用的EphA2。其他EGFR家族成 员，包括表皮生长因子受体(EGFR/ErbBl)和EGFR变体(EGFRvIII)(癌发生所涉及的组成 性活性缺失突变体)也能在物理上和功能上与EphA2相互作用(Larsen等，2007)。而且，EGFR活化能提高 EphA2 的表达(Larsen 等，2007 ；Ramnarain 等，2006)。 EGFRvIII过度表达能提高人肿瘤异种移植瘤的肿瘤发生(Tang等，2000)，EGFR在转基因 动物中的乳腺上皮特异性过度表达会诱导瘤形成(Brandt等，2000)。此外，据报道在多种 人乳腺癌亚型中EGFR和EGFRvIII过度表达，多达48 %病例经分析是EGFR表达阳性(Ge 等，2002 ；Klijn 等，1992 ；Klijn 等，1994 ;Rae 等，2004 ;Tsutsui 等，2003 ；Wikstrand 等， 1995)。因此，EphA2可与受体酪氨酸激酶EGFR家族，而不只是ErbB2协同作用，以提高增 殖和恶性进展。因为ErbB2/HER2是孤儿受体，所以与其他EGFR家族成员异源二聚化会诱 导ErbB2活化[综述见(Ursini-Siegel等，2007)]。EGFR和ErbB2的相互作用影响乳腺 肿瘤进展，因为抑制EGFR激酶活性降低了体外乳腺癌细胞系的HER2/Neu磷酸化、增强贺赛 汀在异种移植瘤中的抗肿瘤作用并抑制MMTV-Neu/MMTV-TGFa双源(bigenic)小鼠的肿瘤 发生(Moulder等，2001) (Lenferink等，2000)。因此，乳腺肿瘤生长和进展可能需要EphA2 和EGFR以及ErbB2之间的功能性相互作用。因此，本发明提供EphA2受体酪氨酸激酶在癌症中的作用是内容依赖性的，因为 EphA2缺陷降低MMTV-Neu的肿瘤进展，但不降低乳腺上皮腺癌的MMTV-PyV-mT转基因模型 的肿瘤进展。本发明提供证据表明，EphA2在物理上和功能上与ErbB2相互作用，以放大肿 瘤细胞中的Ras/MAPK和RhoA信号传导。Ras/MAPK会促进细胞增殖，而活化的Rho GTP酶是肿瘤细胞移动所必需的。总之，这些结果表明EphA2与ErbB2/Neu合作来促进肿瘤进展， 并且EphA2是依赖ErbB-受体信号传导的肿瘤中的新靶点。本发明实施方式在以下编号的实施方式中提供本发明实施方式1. 一种降低过度增殖细胞增殖的方法，所述方法包括a)鉴定表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞群体；和b)给予靶向EphA2的药剂。2. 一种降低表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞群体增殖的方法，所述方法包括 给予靶向EphA2的药剂。3. 一种降低表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞群体增殖的方法，所述方法包括 给予抑制、阻断或干扰EphA2与ErbB2相互作用的药剂。4.如实施方式1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述过度增殖细胞是癌细 胞。5.如实施方式4所述的方法，其特征在于，所述癌症是皮肤癌、肺癌、结肠癌、乳腺 癌、前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤。6.如实施方式1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述过度增殖细胞疾病是 非癌性过度增殖细胞疾病。7.如实施方式6所述的方法，其特征在于，所述非癌性过度增殖细胞疾病是哮喘、 慢性阻塞性肺病(COPD)、牛皮癣、肺纤维化、支气管高反应性、脂溢性皮炎和囊性纤维化病、 炎性肠病、平滑肌再狭窄、内皮再狭窄、过度增殖性血管病、贝切特综合征、动脉粥样硬化或 黄斑变性。8.如实施方式1-7中任一项所述的方法，还包括给予靶向ErbB2的药剂。9.如实施方式1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞过度表达EphA2。10.如实施方式1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞过度表达ErbB2。11.如实施方式1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞同时过度表达 EphA2 禾口 ErbB2。12.如实施方式1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2靶向剂是激动 剂。13.如实施方式1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2靶向剂是拮抗 剂。14.如实施方式1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向 剂是抗体。15.如实施方式1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向 剂是小分子。16.如实施方式1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向 剂是肽。17.如实施方式1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向 剂是siRNA。18.如实施方式1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂是抗体_药物偶联物(ADC)。19.如实施方式1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向 剂中任何一种能抑制、阻断或干扰EphA2和ErbB2之间的相互作用。20. 一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括(a)确定所述患者癌细胞中EphA2和ErbB2的表达水平、存在或含量；(b)如果经测定所述患者癌细胞同时表达EphA2和ErbB2，则给予抗_EphA2和/ 或抗-ErbB2靶向剂。 靶向EphA2或ErbB2的药剂可通过与处理前EphA2或ErbB2的表达和/或活性作比较，来评估靶向EphA2或 ErbB2并改变其表达和/或活性的药剂。通常，利用本领域已知的合适细胞系，以实验室条 件进行评估。应理解，本发明方法不受在靶细胞中抑制EphA2或ErbB2表达和/或活性的 方式或程度的限制。改变Epha2或ErbB2表达和/或活性的方法包括但不限于改变EphA2或ErbB2 表达或活性的方法，例如拮抗EphA2或ErbB2的药剂、拮抗EphA2的药剂、导致EphA2磷酸化 水平增加的药剂、导致EphA2降解的药剂(具体是结合癌细胞上暴露的EphA2表位的药剂 和激动EphA2的药剂)、可用作疫苗的药剂、作用于EphA2或ErbB2编码基因产生的mRNA转 录物的药剂、干扰mRNA转录物翻译成蛋白质的药剂和直接破坏所翻译蛋白质活性的药剂。可通过向细胞内递送反义DNA或RNA分子、双链RNA分子阻碍基因的转录。另一 种抑制酶活性的方式是干扰该基因的mRNA转录产物。例如，可将核酶(或操作性编码核酶 的DNA载体)递送至细胞内，以切割目标mRNA。反义核酸和双链RNA可用于干扰翻译。肽、多肽(包括抗体、抗体片段、融合蛋白)、配体、配体模拟物、肽模拟物化合物和 其他小分子是可用于直接破坏所翻译蛋白质活性的物质的例子。或者，改变Epha2或ErbB2 表达和/或活性的蛋白性胞内剂可以通过常规方法以核酸，如RNA、DNA或者它们的类似物 或组合的形式递送，其中治疗性多肽由核酸编码并操作性连接于调控元件，以便在目标哺 乳动物细胞中表达。用于改变EphA2或ErbB2表达和/或活性的其他治疗剂或预防剂包括但不限于 小分子、肽、反义寡核苷酸、高亲合性多聚体(avimer)、适体、底物模拟物(如不可水解性或 底物捕获性抑制剂)和可用作疫苗以产生对抗Epha2或ErbB2的抗体的药剂。治疗剂可包 括类似底物或干扰Epha2或ErbB2与其底物结合的拮抗剂，特别是干扰EphA2_ErbB2相互 作用的药剂。在一个实施方式中，改变Epha2或ErbB2活性的药剂是防止ErbB2结合磷酸 化的EphA2的药剂。在另一实施方式中，改变Epha2或ErbB2活性的药剂是防止ErbB2结 合EphA2的药剂，不管EphA2是否磷酸化。可用于改变EphA2或ErbB2表达和/或活性的 药剂的非限制性例子包括小分子、肝配蛋白肽(特别是结合EphA2的肝配蛋白Al)或肝配 蛋白肽融合蛋白、EphA2结合抗体和其片段、反义寡核苷酸、RNA干扰(RNAi)分子、高亲合性 多聚体和适体。抗体抗体是结合特定抗原的免疫蛋白。在大多数哺乳动物，包括人和小鼠中，抗体由成 对的重链和轻链多肽构成。各链由两个不同区域组成，称为可变区(Fv)和恒定区(Fe)。轻 链和重链Fv区含有该分子的抗原结合决定簇，负责结合靶抗原。Fc区确定抗体的类型(或
15同种型)(如IgG)，并且负责结合多种天然蛋白质以引发重要的生化事件。抗体的Fc区与多种配体，包括Fc受体和其他配体相互作用，产生一系列称为效 应功能的重要的功能活性。IgG类型Fc受体的一个重要家族是Fc γ受体。这些受体介 导免疫系统的抗体和细胞臂之间的通信(Raghavan等，1996，AnnuRev Cell Dev Biol 12 181-220 ;Ravetch 等，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。在人体内，这一蛋白质家族 包括 Fc γ RI (CID64)，包括同种型 Fc γ RIA、Fc γ RIB 和 Fc γ RIC ；Fc y RII (CD32)，包括同 种型 Fc γ RIΙΑ, Fc y RIIB 禾口 Fc y RIIC ；禾口 Fc γ RIII (CID 16)，包括同种型 Fc y RIIIA 禾口 Fc γ RIIB (Jefferis 等，2002，Immunol Lett82 :57_65)。这些受体一般含有介导与 Fc 结合 的胞外区、跨膜区和可介导一些细胞内信号转导事件的胞内区。这些不同的Fc γ R亚型在 不同细胞类型上表达(综述参见Ravetch等，1991，Annu. Rev. Immunol. 9 :457_492)。例如， 在人中，只在嗜中性粒细胞上发现Fc γ RIIIB，而在巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细 胞和T细胞亚群上发现Fc y RIIIA0Fc/Fc γ R复合物的形成将效应物细胞募集到结合抗原的位点上，一般导致细胞 内信号转导事件和重要的后续免疫应答，如释放炎症介导物、B细胞激活、胞吞作用、吞噬 作用和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬细胞效应功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜 在机制。表达Fc γ R的非特异性细胞毒细胞识别靶细胞上结合的抗体、随后引起靶细胞 裂解的这一细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC) (Raghavan 等，1996，Annu Rev Cell Dev Bioll2 :181_220 ;Ghetie 等，2000，Annu Rev Immunol 18: 739-766 ;Ravetch 等，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。注意，介导 ADCC 的主要细 胞NK细胞只表达Fc y RIIIA，而单核细胞表达Fc γ RI、Fc γ RII和Fc y RIII (Ravetch等， 1991)。另一种重要的Fc配体是补体蛋白Clq。结合于Clq的Fc能介导称为补体依赖性 细胞毒作用(CDC)的过程(综述见Ward等，1995，Ther Immunol 2:77-94)。Clq能够结合 六种抗体，但与两种IgG的结合就足以激活补体级联反应。Clq与Clr和Cls丝氨酸蛋白酶 形成复合物，以形成补体途径的Cl复合物。抗体的几种关键特征包括但不限于靶点特异性、介导免疫效应物机制的能力和 长血清半衰期，使抗体和相关免疫球蛋白分子具有更好的疗效。目前正在开发许多单克 隆抗体，用于治疗各种疾病，包括癌症。它们的例子包括维他辛 (Vitaxin，米迪缪尼公 司(MedImmune))、人源化整联蛋白α ν β 3抗体(如PCT公开W02003/075957)、贺赛汀 (herceptin > (基因泰克公司(Genentech))、批准用于治疗乳腺癌的人源化抗-Herf/neu 抗体((如美国专利5，677，171)、0附095(森拓科公司(Centocor))、人整联蛋白α v抗体 (PCT公开W002/12501)、利妥昔(IDEC/基因泰克/罗氏公司(Roche))、批准用于治疗非 霍奇金淋巴瘤的嵌合抗-⑶20抗体((如美国专利5，736，137)和艾比特斯 (免疫克隆公 司(ImClone))、嵌合抗-EGFR抗体((如美国专利4，943，533)。抗体破坏肿瘤细胞有多种可能机制，包括通过阻断必需的生长途径抗增殖、导 致凋亡的胞内信号传导、增加受体的下调和/或周转、ADCC、CDC和促进适应性免疫应答 (Cragg φ, 1999, Curr Opin Immunol 11541-547 ；Glennie ^,2000, Immunol Today 21 403-410)。虽然裸露抗体可能有效实现其所需的治疗用途，但在某些情况下，改变该抗体可 能提高疗效。例如但不限于，改变抗体的Fc区以提高或降低效应功能。
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在另一实施方式中，本发明抗体是特异性结合EphA2的抗体变体，其衍生物、类似 物和表位结合片段，例如但不限于本文以及PCT公开号W004/014292、WO 03/094859，美国 专利申请公开 2007/0134254、2006/0177453、2006/0039904、2004/0028685 和 2005 年 12 月 21日提交的美国临时专利申请60/751，964和2006年9月7日提交的60/842，641所公开 的那些，通过引用将这些文献全文纳入本文。在一个具体实施方式
中，本发明抗体是特异 性结合EphA2的抗体，其包括上述专利申请所述的抗_EphA2抗体3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、 2B12、5A8的全部或一部分可变区(如，一个或多个OTR)。在一个实施方式中，本发明抗体结合ErbB2。例子包括但不限于美国专利 5，677，171和6，458，356以及美国专利申请公开号2007/0037228和2006/0275305所述的那些。本发明还包括对至少一种Eph受体或ErbB2具有高结合亲和力的本发明抗体的应 用。在一个具体实施方式
中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的本发明抗体的结合 速率常数或kg合速率((Ab) +抗原(Ag)k结合一Ab-Ag)为至少IO5M-1 s—1、至少5X ΙΟΙ、—1、 至少IO6M 1S 人至少 5X IO6MW至少 IO7M-1 S—1、至少 5X IO7IT1 s 1或至少IO8M 1S 1O 在另一具体实施方式
中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的本发明抗体的结合速率常数或 k结合速率((Ab) +抗原(Ag)k结合一Ab-Ag)为至少约ΙΟΙ、—1、至少约5X IO5M-1S^至少约 IO6M 1S 一1、至少约5 X ΙΟΙ、—1、至少约IO7IT1S人至少约5 X IO7IT1 s 1或至少约IO8M 1S 1O在另 一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的抗体的kg纟为至少2X IO5M4iT^ 至少 5 X IO5IT1 s \ 至少 IO6M 1S 入至少 5 X IO6IT1S^至少 IO7IT1 s \至少5 X IO7M 1S 1或至少 IO8MW在另一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的抗体的kg纟为至少 约 2 X IO5M-1S-1、至少约 5 X IO5M-1S-1、至少约 lOH、至少约 5X lOH—1、至少约 IO7MW 至少约5 X IO7IT1SH或至少约ιο -1 S-1。在另一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的本发明抗体的 k解离速率((Ab)+抗原(Ag)^rt-Ab-Ag)小于 ΙΟ、—1、小于 5X ΙΟ、—1、小于 ΙΟ、—1、小 于 5 X ΙΟ、—1、小于 IOW 小于 5 X IOW 小于 ΙΟ—、—1、小于 5Χ ΙΟ—、—1、小于 lO—V、小 于5 X ICT5S人小于ICT6S入小于5 X IOW小于l(T7s人小于5X l(T7s入小于ICTiV1、小 于δΧΙΟ、—1、小于ΙΟ、—1、小于5X IO-V1或小于ΙΟ-10、-1。在另一实施方式中，特异性结 合至少一种Eph受体或ErbB2的本发明抗体的k·速率((Ab) +抗原(Α0“Λ— Ab-Ag) 小于约ΙΟ、—1、小于约δΧΙΟ、—1、小于约IOW小于约δΧΙΟ、—1、小于约ΙΟ、—1、小于 约5 X IOW小于约ΙΟ-、-1、小于约5 X ΙΟ-、-1、小于约ΙΟΥ1、小于约5 X ΙΟ、—1、小于 约IOW小于约5 X ΙΟΥ1、小于约lO—V、小于约5 X ΙΟΥ1、小于约ΙΟ、—1、小于约 δΧΙΟ、—1、小于约ΙΟ、—1、小于约5Χ ΙΟ、—1或小于约ΙΟ-10、-1。在另一实施方式中，特异性 结合至少一种Eph受体或ErbB2的抗体的小于5 X ΙΟ、—1、小于ΙΟ、—1、小于5 X ΙΟ、—1、 小于ICT6S人小于5 X ICT6S人小于ICT7S入小于5 X ICT7S入小于l(T8s人小于5Χ l(T8s人小于 ΙΟ、—1、小于5Χ ΙΟ、—1或小于ΙΟ-、—1。在另一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体 或ErbB2的抗体的k解离小于约δΧΙΟ、—1、小于约ΙΟ、—1、小于约5Χ ΙΟ、—1、小于约ΙΟ、—1、 小于约δΧΙΟ、—1、小于约ΙΟ、—1、小于约δΧΙΟ、—1、小于约ΙΟ、—1、小于约δΧΙΟ、—1、小于 约ΙΟ、—1、小于约5 X ΙΟΥ1或小于约ΙΟ-1、-1。在另一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的本发明抗体的亲和常数或Ka (k结合/k解离)为至少ΙΟ、-1、至少5 X ΙΟ、-1、至少ΙΟ、-1、至少5 X IO3M"1、至少 愈1、至少δΧΙΟ 1、至少ΙΟ^1、至少δΧΙΟ 1、至少虛1、至少δΧΙΟ 1、至少IO7M"1, 至少 5 X IO7IT1、至少 IO8IT1、至少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 IOiqIT1、至 少 5Χ IO1IT1、至少 Ι ΑΤ1、至少 δΧΙΟ^Μ—1、至少 ΙΟΙ—1、至少 5Χ1012Μ、至少 lot1、至少 δΧΙΟ13]^1、至少ΙΟ、—1、至少5 X ΙΟ、—1、至少IO15M-1或至少5 X IO15MA在另一实施方式 中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的本发明抗体的亲和常数或KaGi^Aeii) 为至少约ΙΟΜ4、至少约5Χ ΙΟΜ4、至少约IO3IT1、至少约5 X IO3IT1、至少约IO4IT1、至少约 δΧΙΟ4]^1、至少约105Μ_1、至少约5X ιο 1、至少约106Μ-\至少约δΧΙΟ 1、至少约IO7M"1, 至少约δΧΙΟ 1、至少约108Μ-\至少约5Χ IO8M^至少约ιο 1、至少约5X liAf1、至少约 IOkT1、至少约 5 X ΙΟ、—1、至少约 IO11ITi、至少约 5 X IO11ITi、至少约 IO12IT1、至少约 5 X IO12M、 至少约IO13IT1、至少约5 X IO13IT1、至少约IO14IT1、至少约5 X IO14IT1、至少约IO15IT1或至少约 5 X IO15IT1tj在又一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体或ErbB2的抗体的解离常数 或 Kd (k 解离 /k 结合)/]、于 1(Γ2Μ、/]、于 5 X 1(Γ2Μ、/]、于 1(Γ3Μ、/]、于 5 X 1(Γ3Μ、/]、于 1(Γ4Μ、/]、于 5Χ 1(Γ4Μ、小于 1(Γ5Μ、小于 5Χ 1(Γ5Μ、小于 1(Γ6Μ、小于 5Χ 1(Γ6Μ、小于 1(Γ7Μ、小于 5Χ 1(Γ7Μ、小 于 1(Γ8Μ、小于 5Χ1(Γ8Μ、小于 1(Γ9Μ、小于 5Χ1(Γ9Μ、小于 1(Γ10Μ、小于 5X1(T1QM、小于 1(Γ"Μ、 小于 5 X 1(Γ"Μ、小于 1(Γ12Μ、小于 5 X 1(Γ12Μ、小于 1(Γ13Μ、小于 5 X 1(Γ13Μ、小于 1(Γ14Μ、小于 5Χ 10_14Μ、小于10_15Μ或小于5Χ 10_15Μ。在又一实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体 或ErbB2的抗体的解离常数或KdG^w/kg纟)小于约10_2M、小于约5X10_2M、小于约10_3M、 小于约5 X 10_3M、小于约10_4M、小于约5 X 10_4M、小于约10_5M、小于约5 X 10_5M、小于约 1(Γ6Μ、小于约5Χ1(Γ6Μ、小于约10_7Μ、小于约5Χ10_7Μ、小于约1(Γ8Μ、小于约5Χ1(Γ8Μ、小于 约1(Γ9Μ、小于约5Χ1(Γ9Μ、小于约ΙΟ,Μ、小于约5X1(T1QM、小于约1(Γ"Μ、小于约5Χ1(Γ"Μ、 小于约1(Γ12Μ、小于约5 X 1(Γ12Μ、小于约1(Γ13Μ、小于约5 X 1(Γ13Μ、小于约1(Γ14Μ、小于约 5Χ 1(Γ14Μ、小于约 ICT15M 或小于约 5 X IO-15M0本发明还提供特异性结合EphA2多肽的抗体，所述抗体包含的VH CDR具有任一本 文所述抗体的VH CDR的氨基酸序列。具体说，本发明提供特异性结合EphA2多肽的抗体，所 述抗体包含一个、两个、三个或多个VH⑶R(或者由其构成或主要由其构成)，这些VH⑶R 具有任何本文所述抗体的VH CDR的氨基酸序列。本发明还提供特异性结合EphA2多肽的抗体，所述抗体包含的VL CDR具有任一本 文所述抗体的VL CDR的氨基酸序列。具体说，本发明提供特异性结合EphA2多肽的抗体，所 述抗体包含一个、两个、三个或多个VL⑶R(或者由其构成或主要由其构成)，这些VL⑶R 具有任何本文所述抗体的VL CDR的氨基酸序列。本发明提供特异性结合EphA2多肽或特异性结合ErbB2多肽的抗体，所述抗体包 含本文公开的VH结构域和本文公开的VL结构域，或者其他已知的VL结构域。本发明还提 供特异性结合EphA2多肽或特异性结合ErbB2多肽的抗体，所述抗体包含本文公开的VL结 构域和本文公开的VH结构域，或者其他已知的VH结构域。本发明提供特异性结合EphA2多肽或特异性结合ErbB2多肽的抗体并考虑到其应 用，所述抗体包含本文所述抗体的一个或多个VH CDR和一个或多个VL CDR。具体说，本发明 提供特异性结合EphA2多肽或特异性结合ErbB2多肽的抗体，所述抗体包含VH CDRl和VL
18CDRl ；VH CDRl 和 VL CDR2 ；VHCDRl 和 VL CDR3 ；VH CDR2 和 VL CDRl ；VH CDR2 和 VL CDR2 ； VH CDR2 和 VL CDR3 ；VH CDR3 和 VH CDRl ；VH CDR3 和 VL CDR2 ；VH CDR3 和 VL CDR3 ；VHl CDRl、VH CDR2 和 VL CDRl ；VH CDRl、VH CDR2 和 VLCDR2 ；VH CDRl、VH CDR2 和 VL CDR3 ；VH CDR2、VH CDR3 和 VL CDRl、VH CDR2、VH CDR3 和 VL CDR2 ；VH CDR2、VH CDR2 和 VL CDR3 ； VHCDRUVL CDRl 和 VL CDR2 ；VH CDRUVL CDRl 和 VL CDR3 ；VH CDR2、VL CDRl 和 VL CDR2 ； VH CDR2、VL CDRl 禾口 VL CDR3 ；VH CDR3、VL CDRl 禾口 VL CDR2 ；VH CDR3、VL CDRl 禾口 VL CDR3 ； VH CDRl、VH CDR2、VHCDR3 和 VL CDRl ；VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3 和 VL CDR2 ；VH CDRl、 VH CDR2、VH CDR3 和 VL CDR3 ；VH CDRl、VH CDR2、VL CDRl 和 VLCDR2 ；VH CDRl、VH CDR2、 VL CDRl 禾口 VL CDR3 ；VH CDRUVH CDR3、VL CDRl 禾口 VL CDR2 ；VH CDRUVH CDR3、VL CDRl 禾口 VL CDR3 ；VHCDR2、VH CDR3、VL CDRl 和 VL CDR2 ；VH CDR2、VH CDR3、VL CDRl 和 VL CDR3 ； VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2 和 VL CDR3 ；VH CDRl、VHCDR2、VH CDR3、VL CDRl 和 VL CDR2 ； VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3、VL CDRl和 VL CDR3；VH CDRl、VH CDR2、VL CDRl、VL CDR2和 VLCDR3 ；VH CDRl、VH CDR3、VL CDRl、VL CDR2 禾口 VL CDR3 ；VH CDR2、VH CDR3、VL CDRl、VL ⑶R2和VL⑶R3 ；或者本文所述抗体的VH⑶R和VL⑶R的任意组合(或者由其构成或主 要由其构成)。含有一个或多个可变区或超变区的肽、多肽或蛋白质可用于，例如生产抗-独特 型抗体，进而可用于预防、治疗和/或改善与疾病或失调(如癌症、过度增殖性疾病或增 殖过低性疾病)有关的一种或多种症状。所产生的抗-独特型抗体也可用于免疫实验，如 ELISA，以检测包含用于生产该抗-独特型抗体的肽、多肽或蛋白质中所含可变区或超变区 的抗体。本发明提供体内半衰期延长的特异性结合EphA2多肽的抗体。具体说，本发明提 供特异性结合EphA2多肽或特异性结合ErbB2多肽的抗体，其在对象，优选哺乳动物，最优 选人体内的半衰期大于3天、大于7天、大于10天、大于15天、大于25天、大于30天、大于 35天、大于40天、大于45天、大于2个月，大于3个月，大于4个月或大于5个月。为了延长抗体(如单克隆抗体、单链抗体和Fab片段)的体内血清循环时间，例 如，可利用或不利用多功能接头将惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)连接于该抗 体，具体是将PEG定点偶联至抗体的N-或C-末端或通过赖氨酸残基上的ε -氨基连接。可 利用导致生物活性损失最小的线型或分支聚合物衍生化。通过SDS-PAGE和质谱密切监测 偶联程度，以确保PEG分子适当地偶联于所述抗体。可通过大小排阻或离子交换层析将未 反应的PEG与抗体-PEG偶联物分离开。可利用本领域技术人员熟知的方法，例如本文所述 的免疫实验检测PEG-衍生抗体的结合活性及体内功效。也可通过在IgG恒定区或其FcRn结合片段(例如Fc或铰链-Fc区片段)中引入 一个或多个氨基酸修饰(即取代、插入或缺失)，产生体内半衰期延长的抗体。参见例如，国 际公开号WO 98/23289 ；国际公开号WO 97/34631 ；国际公开号WO 02/060919 ；和美国专利 号6，277，375，通过引用将其全文纳入本文。另外，可将抗体偶联于清蛋白，以制备体内更稳定或具有更长的体内半衰期的抗 体或抗体片段。本领域熟知这些技术，参见例如国际公开号W093/15199、W0 93/15200和WO 01/77137 ；和欧洲专利号EP 413，622，通过引用将所有这些文献纳入本文。为使本发明的某些抗体具有所需性能，准备偶联于所选毒素的抗体的关键方面是该抗体一旦结合域细胞表面靶点(如EphA2)后，能被细胞内化。内化后，偶联毒素可能释 放或保持结合状态，以行使其对细胞的毒性作用。本发明抗体的抗体部分可包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、寡克隆抗体、重 组产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、 合成抗体、单链FvFCS(SCFvFC)、单链FvS(SCFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体。具体说，本 发明方法所用抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。本发明抗体可 以是任何类型(如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、类(如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或小类的免疫球蛋白分子.本发明抗体的抗体部分可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物(如人、鼠、 驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。这些抗体可以是人或人源化单克隆抗体。本文所 用的“人”抗体包括含有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白文库或 由人基因表达抗体的小鼠分离的抗体。抗体和所有多肽都具有等电点(pl)，等电点(pi)通常定义为多肽不带净电荷时 的PH。本领域已知一般当溶液的pH等于该蛋白的等电点(pi)时该蛋白的溶解度最低。可 能通过改变抗体中可电离残基的数量和位置以调节pl，从而优化溶解度。例如，可通过进 行适当的氨基酸取代(例如用带电氨基酸如赖氨酸取代不带电残基如丙氨酸)操纵多肽的 Pl。不希望受任何具体理论的束缚，导致所述抗体Pl改变的抗体的氨基酸取代可提高该抗 体的溶解度和/或稳定性。本领域技术人员应了解哪一种氨基酸取代最适合特定抗体获得 所需pi。可通过各种方法测定蛋白质的pl，这些方法包括但不限于等电聚焦和各种计算 机算法(参见例如，Bjellqvist等，1993，Electrophoresis 14 1023)。在一个实施方式中， 本发明抗体的Pl高于约6. 5、约7. 0、约7. 5、约8. 0、约8. 5或约9. 0。在另一实施方式中， 本发明抗体的Pl高于6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5或9. 0。在一个实施方式中，导致本发明抗体 Pl改变的取代不会显著降低其对Eph受体或ErbB2的结合亲和力。本文所用的pi值定义 为主要电荷形式的pi。可通过各种方法测定蛋白质的pl，这些方法包括但不限于等电聚 焦和各种计算机算法(参见例如，Bjellqvist等，1993，Electrophoresis 14 1023)。抗体Fab结构域的Tm可能是抗体热稳定性的良好指标，还可指示保存期限。较低 的Tm表明聚集较多/稳定性较低，而较高的Tm则表明聚集较少/稳定性较高。因此，常 常使用具有较高Tm的抗体。在一个实施方式中，抗体Fab结构域的Tm值高于至少50°C、 55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C、100°C、105°C、ll(rC、115°C 或 120°C。 在另一实施方式中，抗体Fab结构域的Tm值高于至少约50°C、约55°C、约60°C、约65°C、约 70°C、约 75°C、约 80°C、约 85°C、约 90°C、约 95°C、约 100°C、约 105°C、约 110°C、约 115°C或 约120°C。可利用本领域已知的任何标准方法，例如差示扫描量热法(参见例如Vermeer 等，2000，Biophys. J. 78 394-404 ；Vermeer 等，2000，Biophys. J. 79 :2150_2154)测定蛋白 质(如Fab结构域)的热解链温度I。本发明抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的抗体。多特 异性抗体可特异性结合于所需靶分子的不同表位，或者可特异性结合于靶分子和异源 表位，如异源多肽或固体支持物。参见例如，国际公开号W094/04690 ;W0 93/17715 ；WO 92/08802 ；WO 91/00360 ；和 WO 92/05793 ；Tutt 等，1991，J. Immunol. 147 :60_69 ；美国专 利号 4，474，893,4, 714，681,4, 925，648,5, 573，920 和 5，601，819 ；和 Kostelny 等，1992，J. Immunol. 148 1547 ；各自通过引用全文纳入本文)。在一个实施方式中，结合特异性之一 是对Eph受体的结合特异性，另一种结合特异性是对ErbB2的结合特异性。多特异性抗体对至少两种抗原(例如但不限于，EphA2和ErbB2)具有结合特异 性。虽然这类分子通常只结合两种抗原(即双特异性抗体BsAb)，但本发明也包括具有更多 特异性的抗体如三特异性抗体。BsAb的例子包括但不限于一条臂抗EphA2、另一条臂抗任 何其他抗原的抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统 生产方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中这两条链具有不同特异性 (Millstein等，1983，Nature, 305 :537_539，通过引用全文纳入本文)。由于免疫球蛋白重 链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四体杂交瘤)产生不同抗体分子的可能混合物，其中只 有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤纯化正确分子，亲和层析颇为烦 琐，且产率较低。WO 93/08829 和 Traunecker 等，1991，EMBO J.，10 3655-3659 公开了相 似方法。更直接的方法是产生双-双抗体，或四价双特异性抗体。产生双_双抗体的方法 是本领域已知的(参见例如 Lu 等，2003，JImmunol Methods 279:219-32 ；Marvin 等，2005， Acta Pharmacolical Sinica26 649)。根据不同方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体_抗原结合位点)融 合于免疫球蛋白恒定将区序列。可与含有绞链区、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白 重链恒定区融合。在一个实施方式中，含有结合轻链所必需的位点的第一重链恒定区(CHl) 出现在至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物，如果需要还有免疫球蛋白轻链 的DNA，插入单独的表达载体中，共同转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的不同比例 的三种多肽链提供最优产率的实施方式中，这为调节三个多肽片段的共有部分提供了极大 的灵活性。然而，当表达比例相同的至少两种多肽链导致高产率或该比例没有显著性差异 时，可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。在该方法的一个实施方式中，双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性(例 如Eph受体)的杂交免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供 第二结合特异性)组成。已发现，此种不对称结构有助于分离所需的双特异性化合物与不 需要的免疫球蛋白链的组合，因为免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供了一 种容易的分离方式。这种方法参见W094/04690(通过引用全文纳入本文)。产生双特异性 抗体的进一步详情参见例如，Suresh等，1986，Methods in Enzymology, 121 :210(通过引 用全文纳入本文)。按照W096/27011(通过引用全文纳入本文)所述的另一种方法，可工 程改造一对抗体分子，以最大程度提高由重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分数。在 一个实施方式中，界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，用 较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代第一抗体分子界面上的一个或多个较小氨基酸侧 链。通过用较小氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代较大氨基酸侧链，在第二抗体分子 界面上产生与较大侧链相同或相似大小的补偿性“空穴”。这提供了提高异源二聚体相对于 不希望的终产物如同源二聚体的产率的机制。在一个具体实施方式
中，本发明方法所用抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。 双特异性T细胞接合剂(BiTE)是可再次指导T细胞对靶点进行抗原特异性清除的双特异 性抗体。BiTE分子在分子一端具有结合T细胞抗原(如CD3)的抗原_结合域，并具有结合 靶细胞上抗原的抗原结合域。近期，通过引用纳入本文的WO 99/54440中记载过BiTE分子。该公开文献描述了包含⑶19和⑶3抗原结合位点的新型单链多官能多肽(⑶19X⑶3)。这 种分子衍生自两种抗体，一种结合B细胞上的CD19，另一种结合T细胞上的⑶3。这些不同 抗体的可变区通过某多肽序列连接，从而产生单个分子。也记载了将重链(VH)和轻链(VL) 可变区与弹性接头连接以产生单链双特异性抗体。在本发明的一个实施方式中，特异性结合感兴趣多肽(如Eph受体和/或肝配蛋 白)的抗体或配体包含BiTE分子的一部分。例如，结合感兴趣多肽(如Eph受体和/或 ErbB2)的抗体的VH和/或VL (如scFV)可融合于抗-CD3结合部分，例如上述分子的这一 部分，从而产生靶向感兴趣多肽(如Eph受体和/或ErbB2)的BiTE分子。除感兴趣多肽 (如Eph受体和/或ErbB2)的抗体的重链和/或轻链可变区外，结合感兴趣多肽(如Eph 受体和/或ErbB2)的其他分子可包括BiTE分子，如受体(如Eph受体和/或ErbB2)。在 另一实施方式中，BiTE分子可包含结合其他T细胞抗原(除CD3以外)的分子。例如，本 发明也考虑到特异性结合T细胞抗原如⑶2、⑶4、⑶8、⑶lla、TCR和⑶28的配体和/或抗 体。这个列表不是穷举，而只是说明可用作BiTE分子一部分的特异性结合T细胞抗原的其 他分子。这些分子可包括抗体的VH和/或VL部分或天然配体(例如，LFA3，其天然配体是 CD3)。双特异性抗体包括交联或“异源偶联”的抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可 偶联于亲和素，另一种抗体偶联于生物素。计划用这类抗体(例如)使免疫系统细胞靶向 不良细胞(美国专利号4，676，980)，并用于治疗HIV感染(W091/00360、WO 92/200373和 EP 03089)。上述参考文献各自通过引用全文纳入本文。可采用任何常规的交联方法制备 异源偶联物抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，参见美国专利号4，676，980以及许 多交联技术。上述参考文献各自通过引用全文纳入本文。考虑到掺入至少一个本发明铰链修饰的二价以上的抗体。例如，可制备三特异性 抗体。参见例如，Tutt等，J. Immunol. 147 :60 (1991)，通过引用纳入本文。本发明抗体包括单结构域抗体，包括骆驼化单结构域抗体(参见例如， Muyldermans ，2001， Trends Biochem. Sci. 26 230 ；Nuttall ^,2000, Cur. Pharm. Biotech. 1 253 ；Reichmann 禾口 Muyldermans，1999，J. Immunol. Meth. 231 :25 ；国际公开号 WO 94/04678和WO 94/25591 ；美国专利号6，005，079 ；通过引用全文纳入本文)。其它特别考虑的抗体是“寡克隆”抗体。本文所用术语“寡克隆”抗体指预先确定 的不同单克隆抗体的混合物。参见例如，PCT公开WO 95/20401 ；美国专利号5，789，208和 6，335，163，通过引用全文纳入本文。在一个细胞中产生可由预先确定的一个或多个表位抗 体的混合物组成的寡克隆抗体。寡克隆抗体可包含多个重链，这些重链能够与共同的轻链 配对，产生具有多特异性的抗体(如PCT公开WO 04/009618，通过引用纳入本文)。需要靶 向一个靶分子上的多个表位时，寡克隆抗体特别有用。本领域技术人员将知道或可确定哪 种类型的抗体或抗体混合物可应用于某些目的和需要。在一个实施方式中，可对本发明抗体进行化学修饰(如，可将一个或多个化学部 分连接于该抗体)或修饰改变其糖基化，再次改变该抗体的一种或多种官能特性。例如，可 制备无糖基化抗体(即没有糖基化的抗体)。可改变糖基化状态，以(例如)提高抗体对 靶抗原的亲和力。可通过(例如)改变抗体序列中一个或多个糖基化位点来进行这种糖修 饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而
22消除该位点上的糖基化。这种无糖基化(状态)可提高抗体对抗原的亲和力。这种方法的 详情可参见美国专利号5，714，350和6，350，861，通过引用全文纳入本文。此外或或者，可制备糖基化类型改变的抗体，例如海藻糖残基减少的低海藻糖 基化抗体或平分GIcNAC结构增加的抗体。已证明，这类改变的糖基化模式能提高抗体 的ADCC能力。可通过例如在糖基化机器改变的宿主细胞中表达该抗体来实现这类糖修 饰。本领域已经描述过糖基化机器改变的细胞，它们可用作表达本发明重组抗体，从而产 生糖基化改变的抗体的宿主细胞。参见例如，Shields, R.L.等(2002)J.Biol. Chem. 277 26733-26740 ；Umana 等(1999) Nat. Biotech. 17 176-1，以及欧洲专利 EP 1，176，195 ；PCT 公开WO 03/035835 ；W099/54342，及美国专利6，946，292和7，214，775，各篇文献的全文通 过引用纳入本文。本发明也包括作为抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性增强的Fc变体的抗体。这 类Fc变体抗体的非限制性例子参见美国专利申请11/203，253(2005年8月15日提交并公 开为美国专利申请公开号US 2006/0039904A1)和11/203，251 (2005年8月15日提交)和 美国临时专利申请60/674,674(2005年4月26日提交)和60/713，711 (2005年9月6日 提交)，各篇文献的全文通过引用纳入本文。本发明包括重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)于异源物质以产生融 合蛋白的抗体或其片段用作靶向部分和抗_EphA2或抗-ErbB2试剂的应用。异源物质可以 是多肽(或其一部分，例如，至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少 60个、至少70个、至少80个、至少90或至少100个氨基酸的多肽)、核酸、小分子(小于 1000道尔顿)，或者无机或有机化合物。融合不一定是直接融合，也可通过接头序列融合。 可通过本领域已知方法在体内应用融合或偶联于异源物质的抗体，以检测、治疗、控制或监 测疾病进展。参见例如，国际公开 WO 93/21232 ；EP 439，095 ;Naramura 等，1994，Immunol. Lett. 39 91-99 ；美国专利 5，474，981 ；Gillies 等，1992，PNAS89 1428-1432 ；和 Fell 等， 1991，J. Immunol. 146 :2446_2452，通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，准备检测、 治疗、控制或监测的疾病是过度表达EphA2、或者表达或过度表达ErbB2的恶性癌症。在其 它实施方式中，准备检测、治疗、控制或监测的疾病是与过度表达EphA2、或者表达或过度表 达ErbB2的细胞有关的癌前病症。在一个具体实施方式
中，所述癌前病症是高度前列腺上 皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣。在一个实施方式中，提高抗体的抗肿瘤效力包括将细胞毒性药物或毒素连接于 能够被靶细胞内化的mAb。这些药剂分别称为抗体-药物偶联物(ADC)和免疫毒素。给 予患者后，ADC和免疫毒素通过其抗体部分结合于靶细胞，从而被内化，使得药物和毒素能 够行使其作用。参见例如，W02007/030642A2，美国专利申请公开号US2005/0180972A1、 US2005/0123536A1。也参见例如，Hamblett 等，Clin Canc Res, 10 :7063_7070，1999 年 10 月 15 日，Law 等，ClinCanc Res，10 :7842_7851，2004 年 12 月 1 日，Francisco 等，Neoplasia， 102(4) :1458-1465，2003 年 8 月 15 日，Russell 等，Clin Canc Res，11 :843_852，2005 年 1 月15日，Doronina等，Nat Biotech, 21 (7) :778_784，2003年7月，所有文献通过引用全文 纳入本文。在另一实施方式中，本发明抗体包括特异性结合EphA2的抗体-药物偶联物 (ADC)，例如但不限于PCT公开号WO 2007/030642、2005年9月7日提交的美国临时专利申请60/714，362和2005年11月14日提交的60/735，966，以及2008年3月5日提交的美国 专利申请序列号12/065，832所述的那些，各自通过引用全文纳入本文。本发明还包括含有融合或偶联于抗体片段的异源物质的组合物。例如，可将 异源多肽融合或偶联于Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段或其部分。本领域熟 知融合或偶联多肽与抗体部分的方法。参见例如，美国专利号5，336，603,5, 622，929、 5，359，046,5, 349，053,5, 447，851 和 5，112，946 ；EP 307，434 ；EP 367，166 ；国际公开号 W0 96/04388 和 W0 91/06570 ；Ashkenazi 等，1991，PNAS 88 10535-10539 ；Zheng 等，1995， J. Immunol. 154 5590-5600 ；和 Vil 等，1992，PNAS 89 :11337_11341 (所述参考文献通过引 用全文纳入本文)。可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”) 的技术产生本文所列任何抗体的其它融合蛋白。可利用DNA改组改变本发明抗体或其 片段的活性(如具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见美国专利 5，605，793 ；5，811，238 ；5，830，721 ；5，834，252 ；和 5，837，458 和 Patten 等，1997，Curr. Opinion Biotechnol. ,8 :724_33 ；Harayama,1998, Trends Biotechnol. 16 76 ；Hansson 等，1999，J. Mol. Biol.，287 265 ；和 Lorenzo 和 Blasco，1998，Biotechniques 24 :308 (这 些专利和发表物各自通过引用纳入本文)。可通过易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法随 机诱变，然后进行重组，从而改变抗体或其片段，或编码抗体或其片段。编码抗体或抗体片 段的多核苷酸的一个或多个部分(这些部分特异性结合EphA2)可与一种或多种异源物质 的一个或多个组件、基序、部件、部分、结构域、片段等重组。在一个实施方式中，将本发明抗体或其片段或变体偶联于标记物序列，如肽，以 利于纯化。在某些实施方式中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，例如PQE载体(凯杰公司 (QIAGEN, Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue) 9259 号，查茨沃斯(Chatsworth), CA, 91311)提供 的标签等，其中许多标记可购得。如Gentz等，1989，PNAS 86 :821所述，六组氨酸提供了方 便的融合蛋白纯化方法。用于纯化的其它肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，它对应 于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell 37:767)以及“flag”标签。在其它实施方式中，本发明抗体或其片段或变体偶联于诊断或检测试剂。这类 抗体可作为临床检验的一部分用来监测或预测癌症的发展或进展，例如测定特定疗法的 功效，或用作筛选前程序的一部分。此外，这类抗体可用于监测或预测与表达或过度表达 EphA2和ErbB2的细胞有关的癌前病症的发展或进展。可通过将该抗体偶联于可检测物质进行这类诊断和检测所述可检测物质包括但 不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱 酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限 于伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白； 发光物质，例如但不限于，鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于荧光素酶、萤光素和发光蛋 白；放射性物质，例如但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、 159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、mIn)、碘(1311、1251、1231、 1211)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼("Mo)、钯(103Pd)、磷(32p)、镨(142pr)、钷(149Pm)、 铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、银(85Sr)、硫(35S)、锝 ("Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；采
24用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属以及非放射性顺磁金属离子。在其它实施方式中，将本发明抗体或其片段或变体偶联于治疗剂如细胞毒素，例 如细胞抑制剂和杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，如a发射体。细胞毒素或细胞毒剂 包括对细胞有害的任何物质。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝 裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉 素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l_去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁 卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺和它们的类似物或同源 物。治疗剂包括但不限于抗代谢剂(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟 尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫 司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺 二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环霉素(如道诺霉素和多柔比星)、抗生素(如d放线菌 素、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗-有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。在一个实施方式中，细胞毒剂选自烯二炔、来西菌素(lexitropsin)、多卡霉素 (duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、类美坦西醇和长春花生物碱。在其它实施 方式中，细胞毒剂是紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代-多柔比星、根霉 素、氰基吗啉代-多柔比星、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他汀、卡奇霉素、美登素、DM-1、 耳他汀(auristatin)或其他多拉司他汀衍生物，如耳他汀E或耳他汀F、AEB、AEVB、AEFP、 MMAE(单甲基耳他汀E)、MMAF(单甲基耳他汀F)、艾榴塞洛素(eleutherobin)或纺锤菌素。在另一实施方式中，本发明抗体的细胞毒剂是抗-微管蛋白试剂。在更具体的 实施方式中，细胞毒剂选自长春花生物碱、鬼白毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、隐花素 (cryptophysin)、类美坦西醇、考布他汀或多拉司他汀。在更具体的实施方式中，细胞毒 剂是长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素 (印ithilone)A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙素、可西米(colcimid)、雌莫司汀、西马多 丁、淅皮海绵内酯(discodermolide)、美登素、DM-1、耳他汀或其他多拉司他汀衍生物、如耳 他汀E或耳他汀F、AEB、AEVB、AEFP、MMAE (单甲基耳他汀E)、MMAF (单甲基耳他汀F)、艾榴 塞洛素或纺锤菌素。在一个具体实施方式
中，本发明抗体的细胞毒剂是MMAE。在另一具体实施方式
中， 本发明抗体的细胞毒剂是AEFP。在另一具体实施方式
中，本发明抗体的细胞毒剂是MMAF。 毒素、间隔物、接头、拉伸体(stretcher)等的其他例子和其结构可参见美国专利申请公开 号 2006/0074008 A1、2005/0238649A1、2005/0123536 AU2005/0180972 AU2005/0113308 AU2004/0157782 A1、美国专利号6，884，869B2、美国专利号5，635，483，将所有文献全文纳 入本文。如本文所述，偶联于本发明抗体的药物可包括常规化疗剂，如多柔比星、紫杉醇、 美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、依托泊甙等。此外，可利用条件稳定的接头将 强效药物，如CC-1065类似物、加里刹霉素、美登素、多拉司他汀10类似物、根霉素和海葵毒 素连接于抗体，形成强效免疫偶联物。在某些实施方式中，本发明抗体包含对EphA2表达细胞或ErbB2表达细胞的效力 至少是多柔比星的40倍的药物。这些药物包括但不限于DNA小沟结合剂，包括烯二炔和来 西菌素、多卡霉素、紫杉烷(包括紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、
25SN-38、拓扑替康、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、棘霉素、考布他汀、纺 锤菌素、埃博霉素A和B、雌莫司汀、隐花素(cryptophysin)、西马多丁、类美坦西醇、多拉司 他汀如耳他汀E、多拉司他汀10、MMAE、MMAF、淅皮海绵内酯、艾榴塞洛素和米托蒽醌。在某些特定实施方式中，本发明抗体包含烯二炔部分。在一个具体实施方式
中，所 述烯二炔部分是卡奇霉素。烯二炔化合物通过伯格曼(Bergman)环化产生双基，从而切割 双链DNA。在其它具体实施方式
中，细胞毒剂或细胞生长抑制剂是耳他汀E或耳他汀F，或其 衍生物。在另一实施方式中，耳他汀E衍生物是耳他汀E和酮酸形成的酯。例如，耳他汀 E可与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应，分别产生AEB和AEVB。其它耳他汀衍生物包括 MMAE.MMAF 禾口 AEFP。本领域也已知耳他汀E的合成和结构，如美国专利申请公开号2003/0083263 A1 和 2005/0009751 A1 ；国际专利申请号 PCT/US02/13435,美国专利号 6，323，315 ； 6，239，104 ；6，034，065 ；5，780，588 ；5，665，860 ；5，663，149 ；5，635，483 ；5，599，902 ； 5，554，725 ；5，530，097 ；5，521，284 ；5，504，191 ；5，410，024 ；5，138，036 ；5，076，973 ； 4，986，988 ；4，978，744 ；4，879，278 ；4，816，444 ；和 4，486，414 所述的多拉司他汀-10 和其 衍生物，所有文献通过引用全文纳入本文。在特定实施方式中，所述药物是DNA小沟结合剂。这类化合物和其合成的例子参 见美国专利号6，130，237，通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，所述药物是CBI化 合物。在本发明的某些实施方式中，本发明抗体包含抗微管蛋白剂。抗-微管蛋白剂是 经良好鉴定的癌症治疗化合物类型。抗微管蛋白剂的例子包括但不限于紫杉烷(如泰素 (紫杉醇)、多西他赛)、T67(Tularik)、长春花碱(vincas)和耳他汀(如耳他汀E、AEB、 AEVB、MMAE、MMAF、AEFP)。此种类型的抗微管蛋白剂也包括长春花生物碱，包括长春新碱 和长春碱、长春地辛和长春瑞滨；紫杉烷如紫杉醇和多西他赛；和浆果赤霉素衍生物、埃博 霉素A和B、诺考达唑、氟尿嘧啶和可西米、雌莫司汀、隐花素、西马多丁、类美坦西醇、考布 他汀、多拉司他汀、淅皮海绵内酯和艾榴塞洛素。在一个具体实施方式
中，所述药物是类美坦西醇，一类抗微管蛋白剂。在更具体 的实施方式中，所述药物是美登素。另外，在一个具体实施方式
中，所述细胞毒剂或细胞 生长抑制剂是 DM-1 (IG 公司(ImmunoGen，Inc.)；也参见 Chari 等，1992，Cancer Res 52: 127-131)。天然产物美登素能抑制微管蛋白聚合，导致有丝分裂阻断和细胞死亡。因此，美 登素的作用机理似乎类似于长春新碱和长春碱。然而，美登素的体外细胞毒性约为这些长 春花生物碱的200-1，000倍。在另一具体实施方式
中，所述药物是AEFP。在本发明的某些具体实施方式
中，所述药物不是大于50、100或200个氨基酸的多 肽，例如毒素。在本发明的具体实施方式
中，所述药物是蓖麻毒蛋白。在本发明的其它具体实施方式
中，本发明抗体不包含以下不互斥的药剂类型的一 种或多种细胞毒剂或细胞生长抑制剂烷化剂、蒽环类抗生素、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢 剂、抗微管蛋白剂、耳他汀、化疗增敏剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、多卡霉素、依托 泊甙、氟化嘧唳、来西菌素、亚硝基脲、顺钼、嘌呤抗代谢剂、嘌呤霉素、放疗增敏剂、类固醇、 紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、嘌呤拮抗剂和二氢叶酸还原酶抑制剂。在更具体的实施方式中，高效药物不是以下药物的一种或多种雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬 酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁基硫堇亚胺、喜树碱、卡钼、卡莫司汀 (BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺钼、氟尿嘧啶、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞苷阿拉伯糖苷、松胞 菌素B、达卡巴嗪、放线菌素d(以前称为放线菌素)、道诺霉素、氨烯咪胺、多西他赛、多柔比 星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、黄胆素、异环磷酰胺、伊立替 康、洛莫司汀(CCNU)、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素 C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴胼、链脲霉素、替诺泊甙、6-硫鸟嘌呤、硫 替派、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、VP-16、VM-26、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、甲 氨蝶呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、齐多夫定、阿糖腺苷、利巴韦林、叠氮胸苷、胞苷阿拉伯糖苷、 金刚烷胺、二脱氧尿苷、碘苷、膦甲酸钠(poscarnet)和三氟尿苷。在某些实施方式中，细胞毒剂或细胞生长抑制剂是多拉司他汀。在更具体的实施 方式中，多拉司他汀属于耳他汀类。在本发明的具体实施方式
中，细胞毒剂或细胞生长抑制 剂是MMAE。在本发明的另一具体实施方式
中，细胞毒剂或细胞生长抑制剂是AEFP。在本发 明的另一具体实施方式
中，细胞毒剂或细胞生长抑制剂是MMAF。在其它实施方式中，将本发明抗体或其片段或变体偶联于改变给定生物反应的治 疗剂或药物部分。不应认为治疗剂或药物部分仅限于经典化疗剂。例如，药物部分可以是具 有生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括，例如，毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋 白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子，a -干扰素，3 -干扰 素，神经生长因子，血小板衍生生长因子，组织纤溶酶原激活物，凋亡剂，如TNF-a、TNF_3、 AIM I (参见国际公开号WO 97/33899)、AIM II (参见国际公开号WO 97/34911)、Fas配体 (Takahashi 等，1994，J. Immunol.，6 1567)和 VEGF(参见国际公开号 W099/23105)，血栓形 成剂(thrombotic agent)或抗-新生血管剂，如血管抑制素或内皮抑制素；或者，生物反应 修饰剂，例如，淋巴因子(如白介素-1 (“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-4(“IL-4”)、 白介素 _6( “IL-6”)、白介素-7( “IL-7”)、白介素 _9( “ IL-9”)、白介素-15 ( “IL-15”)、 白介素-12( “IL-12”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因 子(“G-CSF”))或生长因子(如生长激素(“GH”))。在其它实施方式中，将本发明抗体或其片段或变体偶联于治疗剂如放射性物质或 用于偶联放射性金属离子的大环螯合剂(放射性物质的例子如上所述)。在某些实施方式 中，大环螯合剂是1，4，7，10_四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’ -四乙酸(D0TA)，它可通过 接头分子连接于抗体。这些接头分子(进一步详述见下)是本领域公知的，参见Denardo 等，1998，Clin Cancer Res. 4 :2483_90 ；Peterson 等，1999，Bioconjug. Chem. 10 :553_7 ；和 Zimmerman 等，1999，Nucl. Med. Biol. 26 :943_50，通过引用将其全文纳入本文。将治疗部分偶联于抗体的技术是众所周知的。可通过本领域已知的任何方法将 部分偶联于抗体，这些方法包括但不限于醛/SchifT连接、巯基连接、酸不稳定性连接、顺 乌头酰基连接、腙连接、酶可降解的连接(通常参见Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev 53:171-216)。将治疗部分偶联于抗体的其它技术是公知的，参见例如，Arnon等，“在癌症 治疗中免疫革巴向药物的单克隆抗体” (Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)，干于《单克隆抗体禾口癌症治疗》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)，Reisfeld 等(编)，第 243-56 页(ARL 公司(Alan R. Liss, Inc.) 1985)；
27Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”(Antibodies For Drug Delivery)，刊于《控制的 药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第 2 版)，Robinson 等(编)，第 623-53 页 (MD公司(Marcel Dekker，Inc). 1987) ；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒剂的抗体载体综 述，，(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review),干丨J于《单 克隆抗体 84 生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies 84 biological andClinical Applications)，Pinchera等(编)，第475-506页(1985)；“放射性标记抗体在癌症治疗 中的治疗应用的分析、结果和展望”(Analysis，Results, And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy)，干于《用于癌症检IlJ
(Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy), Baldwin 等(编)，第 303-16 页(学术出版社(Academic Press) 1985)和 Thorpe 等，1982， Immunol. Rev. 62 :119_58。本领域熟知将抗体融合或偶联于多肽部分的方法。参见例如， 美国专利号 5，336，603,5, 622，929,5, 359，046,5, 349，053,5, 447，851 和 5，112，946 ；EP 307，434 ；EP 367，166;国际公开号 W0 96/04388 和 W0 91/06570 ；Ashkenazi 等，1991，PNAS 88 10535-10539 ；Zheng 等，1995，J. Immunol. 154 5590-5600 ；和 Vil 等，1992，PNAS 89 11337-11341。抗体与部分的融合不一定需要直接融合，可通过接头序列融合。本领域通 常知道这类接头分子，参见 Denardo 等，1998，Clin CancerRes 4 2483-90 ；Peterson 等， 1999，Bioconjug Chem 10 :553 ;Zimmerman 等，1999，Nucl Med Biol 26 943-50 ；Garnett, 2002，Adv Drug Deliv Rev 53 :171-216，各篇文献通过引用全文纳入本文。可采取两种方法最大程度降低药物在本发明抗体靶向细胞以外的活性首先，可 采用结合于细胞膜EphA2或ErbB2，而不可溶的抗体，以便使药物，包括在前药转化酶作用 下产生的药物集中于活化淋巴细胞的细胞表面。最大程度降低结合于本发明抗体的药物活 性的另一种方法是用某种方式偶联该药物，使其活性降低，除非水解或切割掉抗体。这种方 法将采取用接头将药物连接于抗体，该接头对活化淋巴细胞的细胞表面环境(如活化淋巴 细胞的细胞表面上存在的蛋白酶活性)或该偶联物被活化淋巴细胞摄入后遭遇的活化淋 巴细胞内环境敏感(例如在内体中，或者例如对溶酶体环境中的PH敏感或蛋白酶敏感)。 可用于本发明的接头的例子参见美国专利申请公开号2005/0123536Al、2005/0180972Al、 2005/0113308AU2004/0157782A1和美国专利号6，884，869B2,所有文献通过引用全文 纳入本文。或者，抗体可偶联于第二抗体，形成异源抗体偶联物，如Segal在美国专利号 4，676，980中所述，通过引用将其全文纳入本文。在一个实施方式中，将重组表达的细胞内抗体蛋白给予患者。这种细胞内抗体多 肽必须位于胞内，以介导预防作用或治疗作用。在本发明的这个实施方式中，细胞内抗体多 肽与“膜穿透序列”相连。膜穿透序列是能够透过细胞膜，从细胞外进入细胞内的多肽。连 接于另一多肽时，膜穿透序列也可介导该多肽跨细胞膜转移。在一个实施方式中，膜穿透序列是信号肽的疏水区域(参见例如，Hawiger, 1999， Curr. Opin. Chem. Biol. 3 :89_94 ；Hawiger, 1997，Curr. Opin. Immunol. 9 189-94 ；美国专利 号5，807，746和6，043，339，通过引用全文纳入本文)。膜穿透序列的序列可基于任何信号 肽的疏水区域。例如，该信号肽可选自SIGPEP数据库(参见例如，von Heijne,1987,Prot. Seq. Data Anal. 1 41~2 ；von Heijne 禾口 Abrahmsen，1989，FEBS Lett. 224 :439_46)。革巴向 特定细胞类型插入细胞内抗体多肽时，膜穿透序列可基于该细胞类型内源的信号肽。在另一实施方式中，膜穿透序列是病毒蛋白质(如疱疹病毒蛋白VP22)或其片段(参见例如， Phelan等，1998，Nat. Biotechnol. 16 :440_3)。可通过评估各膜穿透序列指导细胞内抗体 跨细胞膜易位的能力，凭经验确定对特定细胞内抗体和/或特定靶细胞类型具有合适特性 的膜穿透序列。在另一实施方式中，膜穿透序列可以是衍生物。在此实施方式中，通过引入氨基酸 残基取代、缺失、添加和/或修饰来改变膜穿透序列的氨基酸序列。例如但不限于，可通过， 例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切 割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰多肽。可通过化学修饰，利用本领域技术人员 已知的技术，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等方法修 饰膜穿透序列多肽的衍生物。另外，膜穿透序列多肽的衍生物可包含一个或多个非经典氨 基酸。在一个实施方式中，多肽衍生物与未改变多肽具有相似或相同的功能。在另一实施 方式中，与未改变多肽相比，膜穿透序列多肽的衍生物活性改变。例如，膜穿透序列多肽的 衍生物可更有效地通过细胞膜易位，或更抵抗蛋白酶水解。可通过多种方式将膜穿透序列连接于细胞内抗体。在一个实施方式中，膜穿 透序列和细胞内抗体表达为融合蛋白。在此实施方式中，利用标准重组DNA技术将编 码膜穿透序列的核酸连接于编码细胞内抗体的核酸(参见例如，Rojas等，1998，Nat. Biotechnol. 16 370-5)。在另一实施方式中，存在编码膜穿透序列和细胞内抗体的核酸之 间设置的间隔肽的核酸编码序列。在另一实施方式中，单独重组表达后，将膜穿透序列多肽 连接于细胞内抗体多肽(参见例如，Zhang等，1998，PNAS 95 :9184_9)。在此实施方式中， 可通过本领域标准方法，用肽键或非肽键连接多肽(例如用交联试剂，如戊二醛或噻唑烷 连接，参见例如 Hawiger，1999，Curr. Opin. Chem. Biol. 3 :89_94)。可通过以下方式给予膜穿透序列-细胞内抗体多肽胃肠道外给药，如静脉内注 射，包括通过给具有靶细胞的组织或器官供血的血管局部灌注，或通过吸入气雾剂、皮下或 肌肉内注射、局部给药如给予皮肤创伤和病损处、直接转染到(如)为移植制备和随后植入 对象的骨髓细胞和直接转染到随后植入对象的器官中。其它给药方法包括口服给药，特别 是将复合物包入胶囊时，或直肠给药，特别是该复合物形成栓剂形式时。药学上可接受的载 体包括生物学或其它方面没有不良影响的任何材料，即可将该材料与所选复合物一起给予 个体，而不引起任何不良的生物学作用或不与包含它的药物组合物的任何其它成分发生有 害的相互作用。鉴于本领域的教导，不难确定给予膜穿透序列-细胞内抗体多肽的条件(参 见例如，《雷明顿药物科学》(Remington，s Pharmaceutical Sciences)，第18版， E.W.Martin(编)，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton， Pa.) (1990))。如果靶向体内的特定细胞类型，例如局部灌注器官或部分动脉/血管，那么 可对靶组织的细胞进行活检，以便在体外确定输入该组织的复合物的最优剂量，从而优化 体内剂量，包括浓度和时间长度。或者，也可利用相同细胞类型的培养细胞优化靶细胞的体 内剂量。核酸分子本发明方法也可采用EphA2或ErbB2的特异性核酸分子，特别是抑制或编码抑制 EphA2或ErbB2表达的一个或多个部分的核酸分子。本发明包括反义核酸分子，即，全部或一部分编码EphA2或ErbB2的有义核酸的互补分子，如与双链cDNA分子的编码链互补或与 mRNA序列互补的分子。因此，反义核酸可通过氢键结合于有义核酸。反义核酸可以与整个 编码链互补，或者仅与其一部分，如所有或一部分蛋白质编码区(或开放阅读框)互补。反 义核酸分子可与本发明多肽核苷酸编码序列的编码链的非编码区的全部或一部分反义。非 编码区(“5'和3'非翻译区”)是侧接编码区并且不翻译成氨基酸的5'和3'序列。可 通过本领域已知的任何方法，利用可通过公共数据库，如GenBank获得的核苷酸序列确定 反义核酸分子。例如，使用人EphA2的核苷酸序列(例如，GenBank登录号NM_004431. 2)或 人ErbB2的核苷酸序列(例如，GenBank登录号M95667. 1)。反义寡核苷酸的长度可以是，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷
酸。可利用本领域已知方法，通过化学合成和酶促连接构建本发明反义核酸。例如，反义核 酸(如反义寡核苷酸)可以用天然产生的核苷酸或各种修饰核苷酸化学合成，所述修饰核 苷酸经修饰能提高该分子的生物学稳定性或提高反义和有义核酸之间形成的双链体的物 理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修 饰核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌 呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲 基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、3 -D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6_异戊烯基腺嘌 呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2_ 二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基 氨基甲基-2-硫尿嘧啶、0-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、 2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、五步苷(wybutoxosine)、假尿嘧 啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿 嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3- (3-氨基-3-N-2-羧 基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6_ 二氨基嘌呤。或者，可利用以反义方向亚克隆某核酸(即， 从插入核酸转录的RNA为感兴趣靶核酸，如EphA2或ErbB2的反义方向)的表达载体，通过 生物方法产生反义核酸。本发明反义核酸分子通常给予对象，或原位产生，以至于它们与编码本发明所选 多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制表达，例如通过抑制转录和/或 翻译抑制表达。杂交可以是通过常规核苷酸互补形成稳定的双链体，或者例如，在结合DNA 双链体的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用进行杂交。本发明 反义核酸分子的给药途径的例子包括直接注射到组织位点。或者，可修饰反义核酸分子使 其靶向所选细胞，然后全身给药。例如，对全身给药而言，可修饰反义分子使其特异性结合 所选细胞表面上表达的受体或抗原，例如将该反义核酸分子连接于结合细胞表面受体或抗 原的肽。也可用本文所述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为了达到足够的反义分子胞 内浓度，可使用反义核酸分子处于强pol II或pol III启动子控制下的载体构建物。本发明反义核酸分子可以是a-异头核酸分子。a-异头核酸分子与互补RNA形 成特异性双链杂交体，其中与普通单元相反，该链互相平行运行(Gaultier等，1987， Nucleic Acids Res. 15 6625)。反义核酸分子也可包含2，-邻-甲基核糖核苷酸(Inoue 等，1987，Nucleic Acids Res. 15 6131)或嵌合的 RNA-DNA 类似物(Inoue 等，1987，FEBS Lett. 215 327)。
核酶本发明也包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割 与其具有互补区的单链核酸，如mRNA。因此，核酶(如，锤头核酶；如Haselhoff和Gerlach， 1988，Nature 334 :585_591所述)可用于催化性切割mRNA转录物，从而抑制该mRNA编码 的蛋白质的翻译。可根据EphA2或ErbB2的核苷酸序列设计对编码EphA2或ErbB2的核酸 分子有特异性的核酶。例如，可构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸 序列与美国专利4，987，071和5，116，742中切割的核苷酸序列互补。或者，可使用编码本 发明多肽的mRNA从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例 如，Bartel 禾口 Szostak, 1993，Science 261 :1411。RNA 干扰在某些实施方式中，使用RNA干扰(RNAi)分子抑制EphA2或ErbB2的表达或活性。 RNA干扰(RNAi)定义为双链RNA(dsRNA)抑制与其自身序列对应的基因表达的能力。RNAi 也称为翻译后基因沉默或PTGS。由于在细胞胞质中出现的RNA分子只有单链mRNA分子， 所以细胞含有能识别dsRNA并将其切成含21-25个碱基对的片段(大约为两圈双螺旋)的 酶。该片段的反义链与正义链足够分离，因此它与内源性细胞mRNA分子上的互补正义序列 杂交。这种杂交会触发切割双链区的mRNA，从而破坏其翻译成多肽的能力。因此，引入对应 于特定基因的dsRNA会敲除该细胞自身表达的该基因，特别是在特定组织中和/或所选时 间上敲除。可利用双链(ds)RNA干扰哺乳动物的基因表达(Wianny和Zernicka-Goetz，2000， Nature Cell Biology 2 :70_75 ；通过引用全文纳入本文)。dsRNA用作EphA2功能的抑制 性RNA或RNAi，以产生与EphA2无效突变体相同的表型(Wianny和Zernicka-Goetz，2000， Nature Cell Biology 2 :70_75)。受体酪氨酸激酶应用中siRNA的非限制性例子可参见美 国专利申请公开号2005/0246794。小 RNA小RNA(称为"miRNA")是非编码小RNA，属于植物和动物中发现的调节分子类 型，通过结合目标信使RNA (mRNA)转录物上的互补位点控制基因表达(图1)。miRNA由 大RNA前体(称为前-miRNA)产生，在细胞核中加工成约70个核苷酸的前miRNA，折叠成 不完美的茎环结构(Lee, Y.等，Nature (2003) 425 (6956) :415_9)(图1)。通过额外加工 步骤在细胞质中加工前-miRNA，其中由RNA酶III-切酶(Dicer)从前mi-RNA发夹的一 侧切下长度为18-25个核苷酸的成熟miRNA(Hutvagner，G.等，Science (2001) 12 12和 Grishok,A.等，Cell (2001) 106(1) :23_34)。已证明miRNA能以两种方式调节基因表达。首 先，结合与miRNA精确互补的蛋白质编码mRNA序列的miRNA诱导RNA-介导的干扰(RNAi) 途径。信使RNA靶点由RISC复合物中的核糖核酸酶切割。这种miRNA介导的基因沉默 机制主要出现在植物中(Hamilton，A.J.和 D. C. Baulcombe，Science (1999) 286 (5441) 950-2 和 Reinhart，B. J.等，“植物中的小 RNA”(MicroRNAs in plants) Genes and Dev. (2002) 16 :1616-1626)，但已知一个来自动物的例子(Yekta, S.，I. H. Shih，和 D. P. Bartel， Science (2004) 304 (5670) :594-6)。在第二种机制中，结合信使RNA转录物上不完美互补 位点的miRNA在转录后水平指导基因调节，但不切割其mRNA靶点。在植物和动物中鉴定 到的miRNA采用这种机制对其基因靶点进行翻译控制(Bartel, D. P.，Cell (2004) 116 (2)
31281-97)。在某些实施方式中，EphA2和/或ErbB2靶向剂是miRNA。miRNA的非限制性例 子可参见美国专利申请公开号2006/0189557。适体在特定实施方式中，本发明提供EphA2或ErbB2的适体。如本领域所知，适体是由 紧密结合于特定分子靶点(如本文所述的EphA2或ErbB2蛋白、EphA2或ErbB2多肽和/或 EphA2或ErbB2表位)的核酸(如RNA、DNA)构成的大分子。可通过线性核苷酸序列描述 特定适体，其长度一般约为15-60个核苷酸。适体中的核苷酸链形成将该分子折叠成复杂 三维形状的分子内相互作用，这种三维形状使得该适体能紧密结合于其靶分子的表面。鉴 于所有可能的核苷酸序列内存在的分子形状的多样性，可获得针对一大类分子靶点，包括 蛋白质和小分子的适体。除高特异性以外，适体与其靶点有非常高的亲和力(例如，对蛋白 质的亲和力在皮摩尔至低纳摩尔范围)。适体的化学性质稳定，在沸腾或冻结时不会损失活 性。因为它们是合成分子，所以可对它们进行各种修饰，这些修饰可优化其在特定应用中的 功能。就体内应用而言，可修饰适体以显著降低其对血液酶降解的敏感性。此外，也可利用 适体的修饰改变其生物分布或血浆驻留时间。可通过本领域已知方法选择可结合EphA2或ErbB2或其片段的适体。例如，可使 用SELEX(通过指数富集对配体进行系统性演化(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment))方法(Tuerk 和 Gold，1990，Science249 :505_510，通过引用全 文纳入本文)选择适体。在SELEX方法中，用靶分子(如本文所述的EphA2或ErbB2蛋白、 EphA2或ErbB2多肽和/或EphA2或ErbB2表位或其片段)产生和/或筛选大核酸分子文库 (例如1015种不同分子)。将靶分子与核苷酸序列文库一起孵育一段时间。然后，可使用几 种方法从物理上分离混合物中的适体靶分子与未结合的分子，可弃去未结合的分子。然后， 可将对靶分子亲和力最高的适体与靶分子纯化分离开，并通过酶促方法扩增该适体得到一 个主要富集了可结合靶分子的适体的新分子文库。然后，可使用该富集文库启动新一轮选 择、分离和扩增。经过5-15轮此种选择、分离和扩增过程后，将该文库缩小到少量牢固结合 靶分子的适体。然后，可分离混合物中的单独分子，测定其核苷酸序列，测定和比较其结合 亲和力和特异性等特性。然后，可进一步改良分离的适体，以消除对靶点结合和/或适体结 构(即，截短至其核心结合域的适体)无贡献的任何核苷酸。参见例如，Jayasena,1999, Clin. Chem. 45 =1628-1650中有关适体技术的综述，通过引用将其全部内容纳入本文)。在具体实施方式
中，本发明适体对本发明抗体具有本文所述的结合特异性和/或 功能活性。因此，例如，在某些实施方式中，本发明涉及对本发明抗体具有与本文所述相同 或相似的结合特异性(例如，对EphA2或ErbB2多肽、脊椎动物EphA2或ErbB2多肽的片段、 脊椎动物EphA2或ErbB2多肽的表位区(如，本发明抗体结合的EphA2或ErbB2的表位区) 的结合特异性)的适体。在具体实施方式
中，本发明适体可结合EphA2或ErbB2多肽并抑 制EphA2或ErbB2多肽的一种或多种活性。高亲合性多聚体在一个实施方式中，本发明提供抗_EphA2或抗-ErbB2高亲合性多聚体(阿威达 公司(Avidia，Inc.))。高亲合性多聚体是一类新的人来源的治疗性蛋白质，它们与抗体 和抗体片段无关，由若干模块和可重复使用的结合域构成，具有分子量各自为4. 5kD的单 独结合域，其分子量一般为9kD至18kD，经设计可具有拮抗或激动活性，可以同时高亲和结
32合多个表位，结合亲和力(Kd)和阻断功能(IC50)在亚-nM级，非糖基化，可经微生物表达 产生，在生产过程中显示群体行为，可以高产率生产，可通过皮下注射递送，具有出色的组 织穿透能力，可定制其药代动力学特性，并且在动物中无免疫原性(参见例如，美国专利申 请公开号 2005/0221384、2005/0164301、2005/0053973 和 2005/0089932,2005/0048512 和 2004/0175756，通过引用将其全文纳入本文)。基因治疗在一个具体实施方式
中，通过基因治疗的方式给予能改变EphA2或ErbB2表达的 核酸(如EphA2或ErbB2反义核酸或EphA2或ErbB2 dsRNA)，以治疗、预防或控制过度增殖 性疾病、特别是癌症。基因治疗指通过给予对象表达或可表达的核酸进行的治疗。在本发 明的这个实施方式中，产生反义核酸，并介导预防或治疗作用。本领域可获得的任何基因治疗方法均可用于本发明。示范性方法如下所述。基 因治疗方法的综述参见 Goldspiel 等，1993，Clinical Pharmacy 12 488 ；Wu 和 Wu, 1991， Biotherapy 3 87 ；Tolstoshev,1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 573 ；Mulligan, 1993，Science 260 926-932 ；禾口 Morgan 禾口 Anderson，1993，Ann. Rev. Biochem. 62 191 ； May, 1993, TIBTECH 11 :155。本领域已知用于重组DNA技术的方法可参见Ausubel等(编)， 《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰韦利父子 公司(John Wiley &Sons)，NY(1993)；和Kriegler，“基因转移和表达，实验室手册”(Gene Transferand Expression, A Laboratory Manual),HjlKli (Stockton Press), NY(1990)。在一个实施方式中，本发明组合物包含可降低EphA2或ErbB2表达的EphA2或 ErbB2核酸，所述核酸是在合适宿主中表达核酸的表达载体的一部分。具体说，这类核酸 含有启动子，如异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型，任选是组织特异性的。在另一具体实施方式
中，使用核酸分子，其中降低EphA2或ErbB2表达的核酸和任何其他所需序 列侧接于促进在基因组所需位点上发生同源重组的区域，从而使降低EphA2或ErbB2表 达的核酸在染色体内表达(Koller 和 Smithies, 1989，PNAS 86 8932 ；Zijlstra 等，1989， Nature342 435)。将核酸递送给对象可以是直接递送，即使对象直接接触核酸或携带核酸的载体， 或者可以是间接递送，即首先在体外用核酸转化细胞，然后将细胞移植到对象中。这两种方 法是分别称为体内或离体基因治疗。其他激酶抑制剂在一个实施方式中，能够抑制或降低EphA2或ErbB2表达的其他激酶抑制剂可用 于本发明方法。这类激酶抑制剂包括但不限于Ras抑制剂以及某些其他致癌受体酪氨酸 激酶如EGFR和ErbB2的抑制剂。这类抑制剂的非限制性例子参见美国专利6，462，086 ； 6，130，229 ；6，638，543 ；6，562，319 ；6，355，678 ；6，656，940 ；6，653，308 ；6，642，232 和 6，635，640，以及美国专利申请号2006/0252056，各自通过引用全文纳入本文。在具体实施 方式中，在本文所述或本领域已知的实验(如RT-PCR、N0rthern印迹或免疫实验如ELISA、 Western印迹)中，相对于对照(如磷酸盐缓冲盐水)，激酶抑制剂能将EphA2或ErbB2表 达抑制或降低至少25 %、至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、 至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%、
33或者至少1. 5倍、至少2倍、至少2. 5倍、至少3倍、至少3. 5倍、至少4倍、至少4. 5、至少5 倍、至少7倍或至少10倍。在一个具体实施方式
中，本发明方法包括联合给予本发明组合物和一种或多种预 防剂/治疗剂，所述预防剂/治疗剂是以下激酶的抑制剂例如但不限于ABL、ACK、AFK, AKT (如 AKT-I、AKT-2 和 AKT-3)、ALK、AMP-PK, ATM、Auroral, Aurora2, bARKl、bArk2、BLK, BMX, BTK, CAK, CaM 激酶、CDC2、CDK、CK、COT、CTD, DNA-PK, EGF-R、ErbB-I、ErbB-2、ErbB-3、 ErbB-4, ERK (如 ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7)、ERT-PK, FAK, FGR (如 FGF1R、 FGF2R)、FLT (如 FLT—1、FLT-2, FLT-3, FLT-4)、FRK, FYN、GSK (如 GSKl、GSK2、GSK3- α、 GSK3- β、GSK4、GSK5)、G-蛋白偶联受体激酶(GRK)、HCK、HER2、HKII、JAK(如 JAK1、JAK2、 JAK3、JAK4)、JNK (如 JNK1、JNK2、JNK3)、KDR、KIT、IGF-I 受体、ΙΚΚ-1、IKK-2、INSR (胰岛素 受体)、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOK、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、 MHCK、MLCK、MLK3、NEU、NIK、PDGF 受体 α、PDGF 受体 β、卩!《、卩1-3激酶、卩1^、卩1 、卩1((、卩1 、 PRKl、PYK2、p38 激酶、？135{71^2、？340(^2、？420(^2、？4211^ 1^、？44111 1^、1^卩、1 1\1 1卩、1 1卩-2、 RK、RON、RS 激酶、SRC、SYK, S6K、TAKl、TEC、TIEl、TIE2、TRKA, TXK, ΤΥΚ2、UL13、VEGFRl、 VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70，以及这些激酶的所有亚型(参见例如，Hardie和Hanks (1995)《蛋 白质激酶丛书》(The Protein Kinase Facts Book) I 和 II，学术出版社(AcademicPress), 加州圣地亚哥)。在某些实施方式中，联合给予本发明抗体和一种或多种预防剂/治疗剂， 所述预防剂/治疗剂是RTK(如EphA2或ErbB2)的抑制剂。在一个实施方式中，联合给予 本发明抗体和一种或多种预防剂/治疗剂，所述预防剂/治疗剂是EphA2或ErbB2的抑制 剂。在另一具体实施方式
中，本发明方法包括联合给予本发明组合物和一种或多种预 防剂/治疗剂，所述预防剂/治疗剂是血管新生抑制剂，例如但不限于血管他丁(纤溶酶 原片段)；抗血管新生性抗凝血酶III ；新生血管酶(Angiozyme) ；ABT-627 ；Bay 12-9566 ； 贝尼芬(Benefin)；贝伐单抗；BMS-275291 ；软骨衍生的抑制剂(CDI) ；CAI ；CD59补体片段； CEP-7055 ；Col 3 ；考布他汀A-4 ；内皮他汀(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β ；卤 夫酮；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833;人绒毛膜促性腺素(hCG) ；IM-862 ；干扰素α/β/ Y ；干扰素诱导蛋白(IP-IO)；白介素-12;Kringle 5 (纤溶酶原片段)；马立马司他；金属 蛋白酶抑制剂(TIMPs) ；2-甲氧基雌二醇；MMI 270 (CGS 27023A) ；MoAbIMC-ICll ；新伐司 他(Neovastat) ；NM-3 ；盘泽(Panzem) ；PI-88 ；胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原激活物抑 制剂；血小板因子-4(PF4)；普啉司他；促乳素16kD片段；多育曲菌素-相关蛋白(PRP)； PTK 787/ZK 222594 ；类视黄醇；索利司他；角鲨胺；SS 3304 ；SU 5416 ；SU6668 ；SU11248 ； 四氢皮质醇-S ；四硫钼酸盐；沙利度胺；血小板反应蛋白-1 (TSP-I) ；TNP-470 ；转化生长因 子-β (TGF-β)；血管抑制素(Vasculostatin)；血管抑制因子(Vasostatin)(钙网织蛋白 片段)；ZD6126 ;ZD6474 ；法尼基转移酶抑制剂(FTI)；和二膦酸盐(bisphosphonate)。在另一具体实施方式
中，本发明方法包括联合给予本发明组合物和一种或多种预 防剂/治疗剂，所述预防剂/治疗剂是抗癌剂，例如但不限于阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿 考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波霉素、乙酸阿美蒽醌、氨鲁米特、 安吖唳、阿那曲唑、安曲霉素、门冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马 司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博来霉素、布喹
34那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡钼、卡莫司汀、盐酸卡 柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺钼、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环 磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、氨烯咪胺、地西他滨、右奥马钼、 地扎胍宁、甲磺酸地扎胍宁、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸 屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛钼、恩普氨 酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝 唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氮尿苷、磷酸 氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲、盐 酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、白介素2 (包括重组白介素2或rIL2)，干扰素α _2a、 干扰素α _2b、干扰素α-η 、干扰素α-η3、干扰素β-Ia、干扰素Y_Ib、异丙钼、盐酸伊 立替康、乙酸兰瑞肽、来曲唑、乙酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索 蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、乙酸基孕留酮、乙酸美仑孕酮、苯丙氨酸氮芥、美诺立 尔、巯嘌呤、氨甲喋呤、氨甲喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托卡星、丝裂红素、 米托洁林、丝裂马菌素、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、霉酚酸、亚硝基脲、诺 考达唑、诺拉霉素、奥马钼、奥昔舒仑、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、奈莫司汀、硫酸培洛霉 素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、吓菲尔钠、泊非霉 素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴胼、嘌罗霉素、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚 胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺 莫司汀、螺钼、链黑霉素、链佐星、磺氯苯脲、他利霉素、替可加兰钠、替加氟、盐酸替洛蒽醌、 替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酪、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、 柠檬酸托瑞米芬、乙酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐 酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地 辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒石酸长春瑞滨、硫酸长 春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼钼、净司他丁、盐酸佐柔比星。其它抗癌药包括但不限 于20_表_1，25 二羟基维生素D3、5-乙炔基尿嘧啶、阿比特龙、阿柔比星、酰基富烯、腺环 戊醇(adecypenol)、阿多来新、阿地白介素、ALL-TK拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀、阿米多 克斯(amidox)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、穿心莲内 酯、血管新生抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、抗-背侧化形成蛋白-1、抗雄激素、 抗雌激素、抗瘤酮(antineoplaston)、甘氨酸阿非迪霉素、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、 脱嘌呤核酸、ara-CDP-DL-PTBA、精氨酸脱氨酶、阿苏拉科林(asulacrine)、阿他美坦、阿莫 司汀、阿西他汀(axinastatirOl、阿西他汀2、阿西他汀3、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨 酸、浆果赤霉素III衍生物、巴拉醇(balanol)、巴马司他、BCR/ABL拮抗剂、苯并二氢卟酚 (benzochlorin)、苯甲酰星孢素、β内酰胺衍生物、β -阿里辛(beta-alethine)、贝塔克 拉霉素(betaclamycirOB、桦木酸、bFGF抑制剂、比卡鲁胺、比生群、双氮丙啶精胺、双奈法 德、比特迪尼(bistratene)A、比折来新、贝伏特(breflate)、溴匹立明、布度钛、丁基硫堇 亚胺、卡泊三醇、卡弗他丁(calphostirOC、喜树碱衍生物、金丝雀痘IL-2、卡培他滨、羧酰 胺-氨基-三唑、羧基酰胺三唑、CaRest M3、CARN 700、软骨衍生的抑制剂、卡折来新、酪 蛋白激酶抑制剂(ICOS)、澳粟精胺、杀菌肽B、西曲瑞克、氯代喹喔啉磺酰胺、西卡前列素、 顺-卟啉、克拉屈滨、恩氯米芬类似物、克霉唑、克利霉素(collismycirOA、克利霉素B、考
35布他汀A4、考布他汀类似物、克纳宁(conagenin)、科莱贝司丁(crambescidin)816、克立那 托、自念珠藻环肽(crypt0phyCin)8、自念珠藻环肽A衍生物、麻疯树毒蛋白(curacirOA、 环戊惠酉昆(cyclopentanthraquinone)、环普拉JS (cycloplatam)、塞;t咅霄素(cypemycin) > 阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、细胞裂解因子、磷酸己烷雌酚(cytostatin)、达昔单抗、地西他 滨、脱氢代代宁B、地洛瑞林、地塞米松、右异环磷酰胺、右雷佐生、右维拉帕米、地吖醌、代 代宁B、二羟基苯并氧肟酸(didox)、二乙基正精胺、二氢-5-氮杂胞苷、二氢紫杉醇，9_、 二氧霉素(dioxamycin)、二苯基螺莫斯汀、多西他赛、二十二烷醇、多拉司琼、去氧氟尿苷、 屈洛昔芬、屈大麻酚、多卡霉素SA、依布硒、依考莫司汀、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨 酸、榄香烯、乙嘧替氟、表柔比星、依立雄胺、雌莫司汀类似物、雌激素激动剂、雌激素拮抗 剂、依他硝唑、磷酸依托泊甙、依西美坦、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那雄胺、 黄皮酮(flavopiridol)、氟卓斯汀、夫卢丝龙(fluasterone)、氟达拉滨、盐酸氟代柔红霉 素(fluorodaunorunicin)、福酚美克、福美坦、福司曲星、福莫司汀、德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、明胶酶抑制剂、吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、赫 舒反(h印sulfam)、调蛋白、环己基双乙酰胺、金丝桃蒽酮、伊班膦酸、黄胆素、艾多昔芬、 伊决孟酮、伊莫福新、伊洛马司他、咪唑并吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、胰岛素样生长因 子-1受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素、白介素、碘苄胍、碘阿霉素、甘薯苦醇，4_、伊罗普 拉、伊索拉定、异本格唑(isobengazole)、异高软海绵素(isohomohalicondrin)B、伊他司 琼、结丝立得(jasplakinolide)、卡哈拉得(kahalalide)F、片螺素(Iamellarin)-N 三乙 酸、兰瑞肽、雷纳霉素(Ieinamycin)、来格司亭、硫酸蘑菇多糖、莱托斯汀(1印tolstatin)、 来曲唑、白血病抑制因子、白细胞_干扰素、亮丙瑞林+雌激素+孕酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、 利阿唑、直链多胺类似物、亲脂性二糖肽、亲脂性钼化合物、利索纳得(liSS0Clinamide)7、 洛钼、胍乙基磷酸丝氨酸、洛美曲索、氯尼达明、洛索蒽醌、洛伐他汀、洛索立宾、勒托替康、 德卟啉镥(lutetium texaphyrin)、莱索菲林(lysofylline)、细胞裂解肽、美坦新、慢诺 他汀(marmostatirOA、马立马司他、马索罗酚、马斯平(maspin)、基质溶解因子抑制剂、 基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、硫巴妥苯胺、美替瑞林、甲硫氨酸酶、甲氧氯普胺、MIF 抑制剂、米非司酮、米替福新、米立司亭、错配的双链RNA、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉 素类似物、米托萘胺、米托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子_皂草毒蛋白、米托蒽 醌、莫法罗汀、莫拉司亭、单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素、单磷酰基脂质A+分支杆菌 细胞壁骨架、莫哌达醇、多药耐药基因抑制剂、基于多肿瘤抑制物1的治疗、芥类抗癌剂、 印度洋海绵(mycaperoxide)B、分枝杆菌细胞壁提取物、米亚普龙(myriaporone)、N-乙 酰基地那林、N-取代的苯甲酰胺、那法瑞林、那瑞替喷(nagrestip)、纳洛酮+镇痛新、纳 帕英(napavin)、萘萜二醇(naphterpin)、那托司亭、奈达钼、奈莫柔比星、奈立膦酸、中 性内肽酶、尼鲁米特、尼萨霉素(nisamycin)、氮氧化物调节剂、硝基氧抗氧化剂、尼多林 (nitrullyn)、06-苄基鸟嘌呤、奥曲肽、奥可斯酮(okicenone)、寡核苷酸、奥那司酮、昂丹 司琼、昂丹司琼、奥莱辛(oracin)、口服细胞因子诱导物、奥马钼、奥沙特隆、奥沙利钼、氧 杂奥诺霉素(oxaimomycin)、紫杉醇、紫杉醇类似物、紫杉醇衍生物、帕劳胺(palauamine)、 棕榈酰根霉素、帕米磷酸、人参炔三醇、帕诺米芬、副菌铁素(parabactin)、帕折普汀、培 门冬酶、培得星、戊聚硫钠、喷司他丁、喷托唑(pentrozole)、全氟溴烷、培磷酰胺、紫苏子 醇、苯那霉素(phenazinomycin)、乙酸苯酯(phenylacetate)、磷酸酶抑制剂、皮西巴尼(picibanil)、盐酸匹鲁卡品、吡柔比星、吡曲克辛、胎盘素(placetirOA、胎盘素B、纤溶酶 原激活物抑制剂、钼络合物、钼化合物、钼-三胺络合物、吓菲尔钠、泊非霉素、氯泼尼松、 丙基双吖啶酮、前列腺素J2、蛋白酶体抑制剂、基于蛋白A的免疫调节剂、蛋白激酶C抑制 剂、蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、嘌呤核苷磷酸化 酶抑制剂、红紫素、吡唑啉吖唳、吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物、raf拮抗剂、雷替曲 塞、雷莫司琼、ras法尼基蛋白转移酶抑制剂、ras抑制剂、ras-GAP抑制剂、去甲基化的瑞 替普汀、依替膦酸铼Rel86、根霉素、核酶、RII维甲酰胺(retinamide)、罗谷亚胺、罗希吐碱 (rohitukine)、罗莫肽、罗喹美克、卢比格酮(rubiginone)Bl、卢伯西(ruboxyl)、沙芬戈、 伞托平(saintopin)、SarCNU、萨可菲醇(sarcophytol)A、沙格司亭、Sdi 1模拟物、司莫司 汀、衰老衍生的抑制剂1、有义寡核苷酸、信号转导抑制剂、信号转导调节剂、单链抗原结合 蛋白、西佐喃、索布佐生、硼卡钠、苯基乙酸钠、索尔醇(solverol)、生长调节素结合蛋白、 索纳明、膦门冬酸、斯卡霉素(spicamycirOD、螺莫司汀、脾脏五肽(splenopentin)、海绵他 汀(spongistatin) 1、角鲨胺、干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂、斯提酰胺(stipiamide)、 基质分解素抑制剂、斯菲诺辛(sulfinosine)、强效血管活性肠肽拮抗剂、素拉迪塔 (suradista)、苏拉明、苦马豆碱、合成粘多糖、他莫司汀、他莫昔芬甲碘化物、牛磺莫司汀、 紫杉醇、他扎罗汀、替可加兰钠、替加氟、碲吡喃洋(tellurapyrylium)、端粒酶抑制剂、替莫 泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)、四佐胺(tetrazomine)、 泰立拉汀(thaliblastine)、沙利度胺、噻可拉林、硫鸟嘌呤、血小板生成素、血小板生成素 模拟物、胸腺法新、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南、促甲状腺激素、本紫红素乙酯锡、替 拉扎明、二氯环戊二烯钛、拓扑森汀(topsentin)、托瑞米芬、全能干细胞因子、翻译抑制剂、 维甲酸、三乙酰基尿苷、曲西立滨、三甲曲沙、曲普瑞林、托烷司琼、妥罗雄脲、酪氨酸激酶抑 制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)、UBC抑制剂、乌苯美司、泌尿生殖窦衍生的生长 抑制因子、脲激酶受体拮抗剂、伐普肽、瓦立奥林(variolirOB、载体系统，红细胞基因治疗、 维拉雷琐、藜芦明、瓦尔丁(verdins)、维替泊芬、长春瑞滨、威科萨汀(vinxaltine)、维他 辛(Vitaxin)、伏氯唑、扎诺特隆、折尼钼、亚苄维C、和净司他丁斯酯。其他抗癌药是5-氟 尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。本发明也包括联合给予本发明组合物和放疗，放疗包括使用X射线、Y射线和其 它放射来源，以摧毁癌细胞。在某些实施方式中，以外束放疗或远距治疗形式给予放疗，其 中射线由远程源发出。在其它实施方式中，以内部治疗或近程治疗的形式给予放疗，其中放 射源放置在体内接近癌细胞或肿瘤的地方。本领域了解癌症治疗和其剂量、给药途径和推荐用法，这类文献包括例如《医师案 头参考》(Physician，s Desk Reference)(第 61 版，2007)。递送方法和运载体本发明提供设计用于治疗、控制或预防过度增殖细胞疾病，特别是癌症的方法和 组合物。为了提高抗_EphA2剂或抗ErbB2剂或其他抗癌剂的治疗或预防作用，和/或降低 这类药剂的不良副作用，本发明方法和组合物靶向某些细胞类型或特定组织，特别是表达 或过度表达EphA2和ErbB2的细胞。本领域已知的任何递送运载体均可用于本发明。已知可使用各种递送系统给予一 种或多种本发明组合物，例如包裹在脂质体、微粒、微胶囊中，能表达该抗体或抗体片段的重组细胞，受体介导的胞吞(参见，例如Wu和Wu, 1987，J. Biol. Chem.，262 =4429-4432)，构 建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸，等等。例如，可使用微粒轰击递送核酸分子 (例如，基因枪；生物射弹，杜邦公司(Dupont))，或者用偶联于EphA2或ErbB2靶向部分的 脂质或转染剂包被，包裹在脂质体、微粒或微胶囊中，或将它们与已知能进入细胞核的肽连 接后给药，或将它们与能引发受体介导胞吞作用的配体连接后给药(参见例如，Wu和Wu， 1987，J. Biol. Chem. 262 4429)(可用于靶向特异性表达某受体的细胞类型)，等等。在一个具体实施方式
中，将核酸序列直接给予体内。这可通过本领域已知的多种 方式实现，例如，将它们构建成合适核酸表达载体(如上述靶向EphA2或ErbB2的载体) 的一部分并通过给药使其进入细胞内，例如用缺陷型或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体 感染(参见美国专利号4，980，286)；或通过直接注射裸露DNA;或使用微粒轰击(如，基因 枪；生物射弹，杜邦公司)；或使用本领域已知且通过偶联于合适的靶向部分靶向EphA2或 ErbB2的任何递送载体，或将它们连接于已知能进入细胞核的肽后给予，或将它们连接于 能引发受体介导的胞吞作用的配体后给予(参见例如，Wu和Wu，1987，J. Biol. Chem. 262 4429)(可用于靶向特异性表达该受体，如EphA2或ErbB2的细胞类型)，等等。在另一实施 方式中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包含促融的病毒肽以破坏内体，使得核酸避 免溶酶体降解。在又一实施方式中，可通过靶向特定受体，如EphA2或ErbB2进行核酸的体 内靶向递送，以便进行细胞特异性摄取和表达。或者，可将核酸引入细胞内并通过同源重组 掺入宿主细胞 DNA 内表达(Koller 和 Smithies，1989，PNAS USA 86 8932 ；和 Zijlstra 等， 1989，Nature342 435)。在一个实施方式中，先将核酸引入细胞，然后在体内给予得到的重组细胞。这种引 入过程可通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有 核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、小室介导的基因转 移、质体融合等。将外源基因引入细胞的许多技术是本领域已知的(参见例如，Loeffler和 Behr, 1993，Meth. Enzymol. 217 599 ；Cohen 等，1993，Meth. Enzymol. 217 618)，只要不破坏 接受细胞必需的发育和生理功能，这些技术均可用于本发明。该技术应能将核酸稳定转移 到细胞内，以使该细胞可表达该核酸，并且该细胞的后代可遗传和表达该核酸。可通过本领域已知的各种方法将得到的重组细胞给予对象。考虑使用的细胞量取 决于所需作用、患者状态等，可由本领域技术人员确定。递送载体可靶向某些细胞类型，例如根据该载体的固有特征，或通过偶联于该载 体的特异性结合特定细胞亚组的部分，例如结合所靶向细胞亚组的特征性细胞表面分子的 部分，以实现靶向。在一个实施方式中，本发明递送载体靶向表达EphA2和/或ErbB2的细 胞，并且可靶向表达未结合配体的EphA2和/或ErbB2而不是结合于配体的EphA2和/或 ErbB2的细胞。在一个具体实施方式
中，EphA2或ErbB2靶向部分连接于本发明递送载体。该递送载体可以是，例如肽载体、肽-DNA聚集体、脂质体、气体填充的微粒体、包 裹的大分子、纳米悬浮液等(参见例如，Torchilin，Drug Targeting. Eur. J. Phamaceutical Sciences 第 11 卷，第 S81-S91 页(2000) ；Gerasimov, Boomer, Quails, Thompson,使 用pH和光敏感性脂质体进行胞浆药物递送(Cytosolic drugdelivery using pH-and light-sensitive liposome), Adv. Drug Deliv. Reviews 第 38 卷，第 317-338 页(1999)； Hafez，Cullis，脂质多态性在胞内递送中的作用(Rolesof lipid polymorphism in
38)，Adv. Drug Deliv. Reviews 第 47 卷，第 139—148 页(2001)； Hashida, Akamatsu, Nishikawa, Fumiyoshi, Takakura，含半乳糖残基用于靶向肝细胞的 前歹Il腺素 El 白勺多聚前药白勺设计(Design ofpolymeric prodrugs of prostaglandin El having galactose residue for hepatocytetargeting), J. Controlled Release 第 62 卷，第253-262页(1999) ；Shah, Sadhale, Chilukuri，作为药物递送系统的立体相凝胶 (Cubic phase gels as drug deliverysystems), Adv. Drug Deliv. Reviews 第 47 卷，第 229-250页(2001) ；Muller, Jacobs, Kayser，在治疗中纳米悬液作为颗粒药物制剂开发 的基本原理禾口我们对未来的予页其月(Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy :Rationale for development and what we can expect for the future), Adv. DrugDelivery Reviews 第47卷，第3-19页(2001))。在一些实施方式中，递送载 体是病毒载体。在一个具体实施方式
中，递送载体可以是，例如，HVJ(仙台病毒)-脂质 体基因递送系统(参见例如，Kaneda 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 811 :299-308 (1997))；“肽 载体”(参见例如，Vidal 等，CR Acad. Sci III 32:279-287(1997))；肽-DNA 聚集体(参 见例如，Niidome 等，J.Biol. Chem. 272 15307-15312 (1997))；脂质载体系统(参见例如， Lee 等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14 :173_206 (1997))；聚合物包被的脂质体 (Marin等，美国专利号5，213，804 ；Woodle等，美国专利号5，013，556)；阳离子型脂质体 (Epand等，美国专利号5，283，185 Jessee, J. A.，美国专利号5，578，475 ；Rose等，美国专 利号5，279，833 ；Gebeyehu等，美国专利号5，334，761)；气体填充的微球(Unger等，美国专 利号5，542，935)，或包裹的大分子(Low等，美国专利号5，108，921 ；Curiel等，美国专利号 5，521，291 ；Groman等，美国专利号5，554，386 ；Wu等，美国专利号5，166，320)(所有参考文 献通过引用全文纳入本文)。将治疗剂或预防剂包装成递送载体的方法取决于各种因素，例如所用递送载体的 类型，或药剂的疏水性或亲水性。本领域已知的任何包装方法均可用于本发明。病毒由于感染宿主细胞和引入外源核酸的天然能力，病毒是有吸引力的递送载体。用 于实施本发明的病毒载体系统包括例如，天然产生的或重组病毒载体系统。例如，病毒载体 可衍生自以下病毒的的基因组人或牛腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、腺伴随病毒(参见例 如，Xiao 等，Brain Res. 756 :76_83(1997)、小鼠微小病毒(MVM)、HIV、HPV 和 HPV 样颗粒、 辛德毕斯病毒和逆转录病毒(包括但不限于劳氏肉瘤病毒)，以及MoMLV、乙肝病毒(参见 例如，Ji等，J. ViralHepat. 4 167-173 (1997))。通常将感兴趣的基因插入这类载体中以包 装基因构建物，其中通常含有伴随的病毒DNA，然后感染敏感宿主细胞并表达感兴趣基因。 重组病毒载体的一个例子是腺病毒载体递送系统，其缺失蛋白IX基因(参见国际专利申请 WO 95/11984，通过引用将其全文纳入本文)。重组病毒载体的另一个例子是重组副流感病 毒载体(重组PIV载体，如通过引用全文纳入本文的国际专利申请公开号WO 03/072720, 米迪缪尼疫苗公司(MedlmmuneVaccines，Inc.)所述)或重组肺炎后病毒载体(重组MPV 载体，如通过引用全文纳入本文的国际专利申请公开号WO 03/072719，米迪缪尼疫苗公司 (Medlmmune Vaccines, Inc.)所述)。在某些情况下，可能最好使用衍生自与所治疗对象不同物种的载体，以避免预先 存在的免疫应答。例如，用于人类基因治疗的马疱疹病毒载体参见1998年8月5日公开的
39WO 98/27216。该载体可用于治疗人，因为马病毒对人没有致病性。相似地，绵羊腺病毒载 体可用于人类基因治疗，因为它们能避免对抗人腺病毒载体的抗体。这类载体详见1997年 4月10日公开的WO 97/06826，通过引用纳入本文。这些病毒可以是能够复制的(例如，完全野生型或基本野生型如Ad dl309或Ad dl520)、条件复制的(经设计能够在某些条件下复制)或复制缺陷的(在不存在能够补充 缺失功能的细胞系的情况下基本不能复制)。或者，该病毒基因组可具有某些对病毒基因组 的修饰，以提高某些所需特性，例如组织选择性。例如，腺病毒Ela区的缺失导致在肿瘤细 胞内优先复制和改良复制。也可修饰病毒基因组，以包括治疗性转基因。该病毒可具有某 些修饰以使其进行“选择性复制”，即它优先在某些细胞类型或表型细胞状态，如癌状态中 复制。例如，可使用肿瘤或组织特异性启动子元件驱动早期病毒基因的表达，产生优先在某 些细胞类型中复制的病毒。或者，可使用在正常细胞中有活性的通路选择性启动子，以驱动 病毒复制阻抑物的表达。优先在快速分裂细胞中复制的选择性复制的腺病毒载体参见国际 专利申请号WO 990021451和WO 990021452，通过引用各自纳入本文。在一个具体实施方式
中，使用含有能降低EphA2或ErbB2表达和/或功能的核酸 序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等，1993，Meth. Enzymo 1. 217 581)。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中所必需的组 分。将本发明所用的核酸序列克隆到一种或多种载体中，这些载体能促进将核酸递送到对 象内。有关逆转录病毒载体的更详细内容可参见Boesen等，1994，Biotherapy 6 =291-302, 其记载了逆转录病毒载体在将mdr 1基因递送给造血干细胞以使该干细胞对化疗更加耐 受的应用。说明逆转录病毒载体在基因治疗中的应用的其他参考文献是=Clowes等，1994， J. Clin. Invest. 93 :644_651 ；Klein 等，1994，Blood 83 1467-1473 ；Salmons 和 Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129—141 ；禾口 Grossman 禾口 Wilson,1993, Curr. Opin. in Genetics Devel. 3 :110_114o腺病毒是可用于递送本发明核酸分子的其他病毒载体。对于将基因递送至呼吸 道上皮细胞的情况而言，腺病毒是特别有吸引力的递送载体。在天然情况下，腺病毒能感 染呼吸道上皮细胞，从而引起轻微疾病。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。基于腺 病毒的基因治疗的综述可参见 Kozarsky 和 Wilson，1993，Current Opinion in Genetics Development 3:499。Bout 等，1994，HumanGene Therapy 5 :3_10 提出腺病毒载体在将基 因转移至恒河猴呼吸道上皮细胞中的应用。腺病毒作为递送载体的应用的其它例子可参 见 Rosenfeld 等，1991，Science 252 431 ；Rosenfeld 等，1992，Cell 68 143 ；Mastrangeli 等，1993，J. Clin. Invest. 91 225 ；国际公开号W094/12649 ；和Wang等，1995,Gene Therapy 2:775。在一个实施方式中，使用腺病毒载体。腺伴随病毒(AAV)也可用作递送载体(Walsh等，1993，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204 :289_300 ；和美国专利号 5，436，146)。文献中记载了各种产生靶向病毒的方法。例如，可通过以下方法用腺病毒载 体实现细胞靶向通过选择性修饰病毒基因组knob和fiber编码序列表达修饰的knob 和fiber结构域，这些结构域能与独特细胞表面受体，例如经工程改造含有EphA2或 ErbB2靶向部分的受体发生特异性相互作用。这类修饰的例子参见Wickham等(1997) J. Virol. 71 (11) 8221_8229(将 RGD 肽掺入腺病毒 fiber 蛋白)；Arnberg 等(1997)Virology 227 :239_244(修饰腺病毒fiber基因以实现眼部和生殖道的趋向性)；Harris 和 Lemoine(1996)TIG 12(10) :400_405 ;Stevenson 等(1997)J. Virol. 71(6) :4782_4790 ； Michael等(1995)Gene Therapy2 :660_668 (将胃泌素释放肽片段掺入腺病毒fiber蛋 白)；禾口 Ohno 等(1997)Nature Biotechnology 15 :763_767(将蛋白 A-IgG 结合域掺入辛 德毕斯病毒)。细胞特异性靶向的其它方法依赖于抗体或抗体片段与包膜蛋白的偶联(参见例 如，Michael 等(1993) J. Biol. Chem. 268 :6866_6869，Watkins 等(1997)Gene Therapy 4 1004-1012 ;Douglas 等(1996)Nature Biotechnology 14:1574-1578)。例如，可通过修饰 抗体的氨基酰基侧链(特别是赖氨酸残基)将结合EphA2或ErbB2的抗体或抗体片段化学 偶联于病毒颗粒表面。出于靶向目的修饰病毒表面的另一个非限制性例子参见通过引用纳 入本文的美国专利6，635，476。作为使用抗体的替代方式，可将靶向蛋白与病毒颗粒表面复 合。参见例如Nilson等(1996)Gene Therapy 3 :280_286 (EGF偶联于逆转录病毒蛋白)。在一些实施方式中，将EphA2或ErbB2靶向部分，如抗_EphA2或ErbB2抗体、EphA2 或ErbB2配体、肽或本领域已知的其它靶向部分连接于病毒表面，从而将病毒导向表达或 过度表达EphA2和/或ErbB2的细胞。合成载体非病毒合成载体也可用作本发明的递送载体。例如，可将靶向部分连接于聚阳离 子(如脂质或聚合物)主链。聚阳离子主链也与待递送的治疗剂或预防剂(如核酸分子)形 成复合物。这类递送载体的非限制性例子是聚赖氨酸，偶联于各种选择性靶向某些细胞类 型上特定受体的配体。参见例如，Cotton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 87 4033-4037 (1990)； Fur等，用去唾液酸糖蛋白-聚赖氨酸偶联物实现受体介导的靶向基因递送，刊于《基因治 疗直接基因转移的方法和应用》(Gene Therapeutics =Methods and Applications of Direct Gene Transfer)，WolffJA 编，博客号森公司(Birkhauser)波士顿，第 382-390 页(1994) ；McGraw等，大分子的内化和分选胞吞作用(Internalization and sorting of macromolecules :Endocytosis)，干Ij 于〈〈革巴向药物递送〉〉(Targeted Drug Delivery), Juliano RL 编，施普林格出版社(Springer)纽约，第 11-41 页(1991)；和 Uike 等，Biosci Biotechnol. Biochem. 62 :1247_1248 (1998)。在一些实施方式中，将 EphA2 或 ErbB2 革巴向部 分，如抗_EphA2或ErbB2抗体、EphA2或ErbB2配体、肽或本领域已知的其它靶向部分连接 于聚阳离子主链(如，聚赖氨酸)，从而将治疗剂导向表达或过度表达EphA2和/或ErbB2 的细胞。嵌合多结构域肽也可用作本发明递送载体。参见例如，Fominaya等，J.Biol. Chem. 271 10560-10568 (1996)；和 Uherek 等，J. Biol. Chem. 273 :8835_8841 (1998)。这类 载体将靶向部分(即EphA2或ErbB2)、内体逃离和DNA结合基序掺入单个合成肽分子。按照本发明，脂质体可用作递送载体。脂质体是用于各种治疗目的的封闭脂质囊 泡，具体说，在全身给予脂质体时携带治疗剂或预防剂至靶区域或细胞。脂质体通常分为小 单层囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)或多层囊泡(MLV)。从定义上看，SUV和LUV只有一层 双分子层，而MLV含有多个同心的双分子层。脂质体可用于包裹各种物质，将亲水性分子俘 获在水性内腔内或双分子层之间，或将疏水分子俘获在双分子层内。据信，神经节苷脂能抑 制血清蛋白质非特异性吸附至脂质体，从而防止巨噬细胞非特异性识别脂质体。
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具体说，表面上嫁接有水溶性生物相容性聚合物链，如聚乙二醇的脂质体已成为 重要的药物载体。与缺少这种聚合物包被的脂质体相比，这些脂质体的血液循环寿命延长。 嫁接的聚合物链遮蔽或掩蔽该脂质体，从而最大程度降低血浆蛋白质的非特异性相互作 用。这进而降低了脂质体体内清除或消除的速率，因为循环的脂质体不被巨噬细胞和网状 内皮系统的其它细胞所识别。而且，由于渗透性和保留作用提高，这种脂质体容易聚集在脉 管受损或扩张的部位，例如肿瘤和炎症部位。需要配制具有较长循环寿命并且能够将包裹的药物保持所需时间、且能够按需 释放所述药物的脂质体组合物。本领域记载的实现这些特征的一种方法是由非囊泡形 成脂质，如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，以及脂质双层稳定性脂质，如甲氧基-聚乙二 醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)形成脂质体(Kirpotin等，FEBS Lett. 388 115-118(1996))。在这种方法中，mPEG通过可切割的连接方式连接于DSPE。切割该连接会 使脂质体失去稳定性，从而快速释放脂质体内容物。记载了将PEG聚合物链连接于脂质体的不稳定键(美国专利5，013，556、 5,891,468 ；WO 98/16201)。这种脂质体组合物中的不稳定键从脂质体释放PEG聚合物链， 以便，例如，暴露连接靶向配体的表面或引发脂质体与靶细胞的融合。在脂质体药物递送系统中，抗_EphA2或ErbB2在脂质体形成过程中被包埋，然后 给予待治疗的患者。参见例如，美国专利3，993，754,4, 145，410,4, 224，179,4, 356，167和 4，377，567。在本发明中，修饰脂质体，以便使其表面上具有一个或多个EphA2或ErbB2靶 向部分。杂合载体杂合载体利用病毒的内体逃离能力和非病毒载体的灵活性。杂合载体可分成以下 两个亚类(1)作为单独实体与非病毒载体一同加入的膜破坏性颗粒，即病毒颗粒或其他 促融肽；和(2)与传统非病毒载体结合成单一复合物的这种颗粒。例如，杂合载体可使用与靶向的非病毒载体反式结合(in trans with)的腺病毒， 例如，腺病毒和转铁蛋白/聚赖氨酸、抗体/聚赖氨酸或去唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸的复合 物。参见例如，Cotton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 89 6094-6098 (1992) ；Curiel 等，受体-介 导的基因递送采用腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合物(Rec印tor-mediated gene delivery employing adenovirus-polyIysine-DNAcomplexes),干丨J于〈〈基因治疗直接基因转移的方 法禾口应用》(Gene Therapeutics :Methods and Applications of Direct Gene Transfer), Wolff JA 编，博客号森公司波士顿，第 99-116 页(1994) ；Wagner 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 89 6099-6103(1992) ；Christiano 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 90 :2122_2126 (1993)通 过引用全文纳入本文。这类杂合载体的作用机制从靶向复合物和病毒颗粒与其各自受体的 特异性结合开始。结合后，靶向复合物和病毒颗粒可能内化到同一囊泡中或内化到不同内 体中。在一个具体实施方式
中，病毒颗粒直接偶联于靶向载体。可通过(例如)腺病毒和 聚赖氨酸的链霉亲和素/生物素化、通过预偶联于聚赖氨酸的抗体、或通过直接化学偶联 将病毒颗粒掺入靶向复合物中。参见例如，Verga等，Biotechnology and Bioengineering 70(6) :593-605(2000)。在某些实施方式中，本发明提供包含一种或多种EphA2或ErbB2靶 向部分的杂合载体。预防/治疗方法
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本发明包括在对象中治疗、预防或控制与EphA2和ErbB2表达或过度表达有关的 疾病或失调和/或细胞过度增殖性疾病，特别是癌症的方法，所述方法包括给予有效量的 一种组合物，该组合物可靶向表达EphA2和ErbB2的细胞并改变EphA2和/或ErbB2表达 或功能，和/或对过度增殖细胞疾病有治疗或预防作用。在一个实施方式中，本发明方法包 括给予对象一种组合物，该组合物包含连接于对抗过度增殖细胞疾病的治疗剂或预防剂的 EphA2或ErbB2靶向部分。在另一实施方式中，本发明方法包括给予对象一种组合物，该组 合物包含一种核酸，该核酸含有编码EphA2或ErbB2靶向部分的核苷酸序列和编码对抗过 度增殖性疾病的治疗剂或预防剂的核苷酸序列。在另一实施方式中，本发明方法包括给予 对象包含EphA2或ErbB2靶向部分和一种核酸的组合物，该核酸包含编码对抗过度增殖性 疾病的治疗剂或预防剂的核苷酸序列，其中所述靶向部分与核酸直接相连或通过递送载体 相连，以便递送至表达或过度表达EphA2和/或ErbB2的细胞。在特定实施方式中，EphA2 或ErbB2靶向部分也抑制EphA2或ErbB2的表达或活性。本发明包括在对象中治疗、预防或控制与EphA2和/或ErbB2表达或过度表达相 关的疾病或失调和/或细胞过度增殖性疾病，例如，癌症的方法，所述方法包括给予一种或 多种靶向EphA2或ErbB2和/或改变EphA2或ErbB2表达或活性的抗体，其中所述抗体包含 EphA2或ErbB2激动性或拮抗性抗体、EphA2或ErbB2细胞内抗体或者EphA2或ErbB2癌细 胞表型抑制性抗体，或暴露的EphA2或ErbB2表位抗体或结合EphA2的低于SXKT1iT1 的EphA2或ErbB2抗体，或者EphA2或ErbB2高亲合性多聚体。在一个具体实施方式
中，治 疗、预防或控制的疾病是恶性癌症。在另一具体实施方式
中，所述治疗、预防或控制的疾病 是与表达或过度表达EphA2或ErbB2的细胞有关的癌前病症。在更具体的实施方式中，所述 癌前病症是高度前列腺上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣。在一个实施方式中，本发明组合物可与用于治疗、预防或控制与EphA2或ErbB2表 达或过度表达有关的疾病或失调、过度增殖性疾病和/或癌症的一种或多种其它治疗剂联 合给药。在某些实施方式中，将一种或多种本发明组合物和用于治疗癌症的一种或多种其 它治疗剂同时给予哺乳动物，优选人。术语“同时”不限于在完全相同的时间给予预防剂或 治疗剂，而是指在一个事件间隔内依次给予本发明组合物和其它治疗剂，以使本发明组合 物可与所述其它治疗剂一起作用以便与其它给药方式相比提高获益。例如，可将每一预防 剂或治疗剂在相同时间或在不同时间点以任何顺序依次给予；然而，如果没有在同一时间 给药，应将它们在足够接近的时间内给药以提供所需治疗或者预防效果。可将每一治疗剂 以任何合适形式通过任何合适途径分别给予。在其它实施方式中，可以在手术之前、同时或 之后给予本发明组合物。该手术优选完全切除局部肿瘤，或降低大肿瘤的大小。手术也可 作为预防性手段或用于缓解疼痛。本发明提供治疗、预防和控制与EphA2或ErbB2表达或过度表达有关的疾病或失 调和/或过度增殖性细胞疾病，特别是癌症的方法，即给予需要的对象治疗或预防有效量 的一种或多种本发明组合物。在另一实施方式中，本发明组合物可与一种或多种其它治疗 剂联合给药。该对象优选是哺乳动物，如非灵长类(如牛、猪、马、猫、犬、大鼠等)和灵长类 (例如，猴，如猕猴和人)。在一个具体实施方式
中，该对象是人。可用本发明包括的方法进行治疗的癌症的具体例子包括但不限于表达或过度表 达EphA2和/或ErbB2的癌症。在另一实施方式中，癌症是上皮来源的。这类癌症的例子
43是肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和皮肤癌。其它癌症包括膀胱癌和胰腺癌，以及肾细胞癌 和黑色素瘤。在下文中，其它癌症以举例方式列出但不具限制性。在具体实施方式
中，本发 明方法可用于治疗和/或预防原发性肿瘤的转移。本发明的方法和组合物包括给予患有癌症，例如具有患特定癌症类型的遗传倾 向、接触过致癌物或处于特定癌症缓解中的对象/患者一种或多种本发明组合物。本文所 用的“癌症”指原发性或转移性癌症。这类患者可能曾接受过或未曾接受过癌症治疗。本 发明方法和组合物可用作一线或二线癌症治疗。本发明也包括治疗正在接受其它癌症治疗 的患者，可以在这些其它癌症治疗发生任何不良作用或不耐受之前使用本发明方法和组合 物。本发明也包括给予难治患者一种或多种本发明组合物，以治疗或改善症状。在某些实 施方式中，癌症难治意味着使用这种治疗时至少相当一部分癌细胞不被杀死或其细胞分裂 不被阻滞。可以利用本领域接受的“难治”的涵义，通过本领域已知的测定治疗对癌细胞有 效性的任何方法，在体内或体外确定癌细胞是否“难治”。在各种实施方式中，当癌细胞数量 未显著减少或增加时癌症是难治的。在具体实施方式
中，给予本发明组合物，以逆转癌细胞对某些激素、放疗或化疗药 的耐受性或逆转其降低的敏感性，从而使癌细胞再次对一种或多种这类药物敏感，然后可 给予这些药物(或继续给予)以治疗或控制癌症，包括预防转移。在一个具体实施方式
中， 将本发明组合物给予细胞因子IL-6水平升高的患者，IL-6水平升高与癌细胞对不同治疗 方案，如放疗和激素治疗产生耐受性有关。在另一具体实施方式
中，将本发明组合物给予对 他莫昔芬治疗反应性降低或用他莫昔芬难治的乳腺癌患者。在另一具体实施方式
中，将本 发明组合物给予细胞因子IL-6水平升高的患者，IL-6水平升高与癌细胞对不同治疗方案， 如放疗和激素治疗产生耐受性有关。在其它实施方式中，本发明提供治疗患者的癌症的方法，即将一种或多种本发明 组合物与任何其它治疗联合给予已证明用其它治疗难治但不再接受这些治疗的患者。在某 些实施方式中，用本发明方法治疗的患者是已经用化疗、放疗、激素疗法或生物疗法/免疫 疗法治疗的患者。这些患者中包括难治患者和用已有癌症疗法治疗的癌症患者。在其它实 施方式中，患者经过治疗且没有出现疾病活动，给予一种或多种本发明组合物以预防癌症 的复发。在某些实施方式中，已有疗法是化疗。在具体实施方式
中，已有疗法包括给予化 疗剂，包括但不限于甲氨蝶呤、紫杉醇、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰 胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺钼、卡钼、丝裂霉素、达卡巴嗪、丙卡巴胼、依托泊甙、喜树碱 (campathecin)、博来霉素、多柔比星、黄胆素、道诺霉素、放线菌素d、普卡霉素、米托蒽醌、 天冬酰胺酶、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛等。这些患者中包括用放疗、激 素疗法和/或生物疗法/免疫疗法治疗的患者。这些患者中还包括已接受癌症手术治疗的
^^ ο或者，本发明也包括治疗正在接受或已接受放疗的患者的方法。这些患者包括正 在或者曾经用化疗、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法治疗的患者。这些患者中还包括 已接受癌症手术治疗的患者。在其它实施方式中，本发明包括治疗正在接受或已接受激素疗法和/或生物疗法 /免疫疗法的患者的方法。这些患者包括正在接受或已接受化疗和/或放疗治疗的患者。这些患者中还包括已接受癌症手术治疗的患者。此外，本发明还提供治疗癌症的方法作为化疗、放疗、激素疗法和/或生物疗法/ 免疫疗法的替代方法，其中已证明或可证明对所治疗对象而言，所述疗法的毒性太大，即导 致无法接受或无法承担的副作用。用本发明方法治疗的对象可以任选用其它癌症疗法治 疗，包括例如，手术、化疗、放疗、激素疗法或生物疗法，这取决于发现哪种治疗是无法接受 或无法承担的。在其它实施方式中，本发明给予已证明用任何其它癌症疗法难治的患者一种或多 种本发明组合物而不给予这类疗法，以治疗癌症。在特定实施方式中，给予用其它癌症疗法 难治的患者一种或多种本发明组合物而不给予这种癌症疗法。在其它实施方式中，向患有与表达或过度表达EphA2和ErbB2的细胞有关的癌前 病症的患者给予本发明组合物，以治疗所述疾病和降低其进展成癌症的可能性。在一个具 体实施方式中，所述癌前病症是高度前列腺上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性 囊肿病或复合性痣。在其它实施方式中，本发明提供治疗、预防和控制非癌性过度增殖细胞疾病，特别 是与EphA2和ErbB2表达或过度表达有关的疾病的方法，这些疾病包括但不限于哮喘、慢 性阻塞性肺病(COPD)、再狭窄(平滑肌和/或内皮)、牛皮癣等。这些方法包括类似于上述 治疗、预防和控制癌症的方法的方法，例如，给予本发明组合物，以及联合治疗，给予特定疗 法难治的患者等。癌症可利用本发明方法和组合物治疗的癌症和相关疾病包括但不限于上皮细胞来源 的癌症。这类癌症的例子包括白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急 性髓细胞白血病如成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单细胞性白血病、单核细胞 性白血病、红白血病性白血病和骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细 胞(粒细胞)性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、真性红细胞增多症；淋巴瘤， 例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于冒烟型多发性骨髓瘤、 非分泌型骨髓瘤、骨硬化骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登 斯特伦巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病，重链 病，骨癌和结缔组织肉瘤，包括但不限于骨的肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细 胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、脉管肉瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波 西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；脑肿瘤，例 如但不限于，胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非胶质细胞肿 瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和原发性脑 淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于导管癌、腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘 液性乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病及炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于 嗜铬细胞瘤及肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状 腺癌和未分化甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于，胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素、活性肠 肽瘤、生长抑素分泌瘤、类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体肿瘤，例如但不限于库欣症、泌乳素分泌 瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不仅限于虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、脉络膜黑 色素瘤、睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外
45阴癌，如鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤以及佩吉特病；子宫颈癌，例如但不 限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不 仅限于卵巢表皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质肿瘤；食道癌，例如不仅限于鳞状细胞 癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细 胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈伞型癌(息肉)、溃疡、表面扩散、弥漫扩散、 恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和肉瘤、结肠癌、直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和 肝母细胞瘤；胆囊癌，如腺癌；胆管癌，例如但不限于罗若性(Iuoroura)、结节状和弥散性 的胆管癌；肺癌，如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(上皮细胞癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺 癌；睾丸癌，例如但不限于生发瘤、精原细胞瘤、未分化、经典(典型)、精母细胞性、非精细 胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌，例如但不仅限于前列腺上皮内肿 瘤、腺癌、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，例如但不仅限于鳞状细胞癌；基底癌； 唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞 癌和疣状；皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、表面扩散性黑素瘤、 结节性黑色素瘤，恶性黑色素瘤痣、肢端多雀斑黑色素瘤；肾癌，包括但不限于肾细胞癌、腺 癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤癌症、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；肾母细胞瘤；膀胱癌， 例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括肌肉瘤、成骨肉瘤、 内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗 腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(这类疾病的综述参见Fishman等，1985，《医学》 (Medicine)，第 2 版，费城 JBL 公司(J. B. Lippincott Co.，Philadelphia)和 Murphy 等， 1997，知情决定癌症诊断、治疗和恢复的完整手册(InformedDecisions =The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery),维京企鹅(Viking Penguin),美 国企鹅图书公司(Penguin Books U. S. Α.，Inc.，UnitedStates of America))。因此，本发明方法和组合物也可用于治疗或预防各种癌症或其它异常增殖性疾 病，包括但不限于癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃 癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、 急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋 巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病，以及早幼粒细胞性白血 病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞 瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和胶质瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母 细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以 及其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、滤泡状甲状腺癌和畸 胎癌。还考虑到，也可利用本发明方法和组合物治疗凋亡异常引起的癌症。这类癌症可包括 但不限于滤泡淋巴瘤，P53突变的癌症，激素依赖性的乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和卵巢肿瘤， 以及癌前病变，如家族性腺瘤性息肉病和骨髓发育异常综合征。在特定实施方式中，治疗或 预防皮肤、肺、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、胰、卵巢或子宫中的恶性疾病或增殖异常改变 (如组织转化和发育异常)，或过度增殖性疾病。在其它具体实施方式
中，治疗或预防肉瘤、 黑色素瘤或白血病。在一些实施方式中，所述癌症为恶性，且表达或过度表达EphA2和ErbB2。在其它 实施方式中，所治疗的疾病是与过度表达EphA2和ErbB2的细胞有关的癌前病症。
在其它实施方式中，利用本发明的方法和组合物治疗和/或预防乳腺癌、结肠癌、 卵巢癌、肺癌和前列腺癌，以及黑色素瘤，下面以举例而非限制的方式提供这些方法和组合 物。药物组合物本发明组合物包括药物组合物的制造过程中使用的散装药物组合物(如不纯或 非无菌的组合物)和用于制备单位剂型的药物组合物(如适合给予对象或患者的组合物)。 这类组合物包含预防或治疗有效量的本文所述的预防剂和/或治疗剂或其组合，以及药学 上可接受的载体。在一个实施方式中，本发明组合物还包含另一种治疗剂，如抗癌剂。在一个具体实施方式
中，术语“药学上可接受的”指被联邦或州政府管理机构批 准，或美国药典或其它通常接受的药典所列的用于动物，更具体是用于人的。术语“载体”指 与该治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂(如弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)或获自加州埃默 里威尔的西龙公司(Chiron，Emeryville，CA)的MF59C. 1佐剂)，赋形剂或运载体。这类药 物载体可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、 大豆油、矿物油、芝麻油等。药物组合物经静脉内给药时，水是可以使用的载体的例子。盐 水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别适用于注射液。合适的药物赋 形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、 单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合 物也可含有少量润湿剂或乳化剂或PH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片 剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂等形式。通常，本发明组合物的成分是单独提供或混合在一起以单位剂型的形式提供，例 如在标明活性物质含量的密封容器如安瓿或药囊中的冻干粉末或无水浓缩物。通过输液给 予该组合物时，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配该组合物。通过注射给予该组 合物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前与药物成分混合。本发明组合物可配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成 的盐，例如衍生自氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍 生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。给予本发明预防剂或治疗剂的方法包括但不限于胃肠道外给药(如皮内、肌肉 内、腹膜内、静脉内和皮下途径)、硬膜外给药和粘膜给药(如鼻内、吸入和口服途径)。在 一个具体实施方式
中，肌肉内、静脉内或皮下给予本发明预防剂或治疗剂。可通过任何常规 途径，例如输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬里(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收给 予该预防剂或治疗剂，并可与其它生物活性剂一起给药。给药可以是全身给药或局部给药。在一个具体实施方式
中，可能需要将本发明预防剂或治疗剂局部给予需要治疗的 区域；这可通过，例如但不限于，局部输注、注射或植入物等方式实现，所述植入体是多孔 性、非多孔性或明胶状材料，包括膜，如唾液酸膜(sialasticmembrane)，或者纤维。在又一实施方式中，可利用控释或缓释系统递送预防剂或治疗剂。在一个实施方 式中，可使用泵实现控释或缓释(参见Sefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 20 ； Buchwald 等，1980，Surgery 88 507 ；Saudek 等，1989，N. Engl. J. Med. 321 574)。在另一 实施方式中，可使用聚合物材料实现本发明抗体或其片段的控释或者缓释(参见如《控释 的医学应用》(Medical Applicationsof Controlled Release)， Langer 禾口 Wise (编)，佛罗里达州博卡拉顿CRC出版社(CRC Pres.，Boca Raton, Florida) (1974)；《受控的 药物生物利用度，药物产品的设计和性能》(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design andPerformance)，Smolen 禾口 Ball (编)，纽约韦利公司(Wiley, NY) (1984) ；Ranger 禾口 Peppas, 1983, J. , Macromo 1. Sci. Rev. Macromo 1. Chem. 23 :61 ；还可参 见 Levy 等，1985，Science 228 190 ；During 等，1989，Ann. Neurol. 25 351 ；Howard 等， 1989，J. Neurosurg. 71 105)；美国专利号 5，679，377 ；5，916，597 ；5，912，015 ；5，989，463 ； 5，128，326;国际公开号WO 99/15154和WO 99/20253。缓释制剂中所用聚合物的例子包括 但不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙 酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚 (乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和聚原 酸酯。在一个实施方式中，缓释制剂中所使用的聚合物为惰性、不含可浸提杂质、稳定储存、 无菌且可生物降解的物质。在又一实施方式中，可将控释或缓释系统放置于预防或治疗靶 点附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，《控释的医学应用》(Medical Applications of ControlledRelease)，第 2 卷，115-138(1984))。Langer (1990，Science 249 :1527_1533)讨论了控释系统。任何本领域所知技术 可用于生产包含一种或多种本发明治疗剂的缓释制剂。参见例如美国专利号4，526，938 ； 国际公开号 WO 91/05548 和 WO 96/20698 ;Ning 等，1996，Radiotherapy & Oncology 39: 179 189 ；Song 等，1995, PDA Journal ofPharmaceutical Science & Technology 50 372 397 ；Cleek 等，1997，Pro. Int' 1. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24 853 854 ；禾口 Lam 等，1997，Proc. Int' 1. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24 759 760，通过引用全文纳入 本文。制剂可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂，以常规方式配制本发明使用 的药物组合物。因此，可根据吸入或吹入给药(通过口或鼻)或口服、胃肠道外或粘膜给药 (如含服、阴道、直肠、舌下)来配制本发明组合物。在一个实施方式中，采用局部或全身性 胃肠道外给药。在口服给药中，药物组合物可以是以下形式，例如，通过常规方式与药学上可接受 的赋形剂如粘合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂 (如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(如 马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或湿润剂(如月桂基硫酸钠)制备在一起的片剂或胶囊。可 按照本领域熟知方法对片剂进行包衣。口服液体制剂可以是(例如)溶液剂、糖浆剂或混 悬剂的形式，或者可制成临用前用水或其它合适的载体进行重建的干燥产品。可通过常规 方式用药学上可接受的添加剂如助悬剂(如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂 肪)；乳化剂(如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物 油)；和防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸)配制这类液体制剂。该制剂还 可适当地含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可适当地配制口服给药制剂，以便实现活性化合物的控释。就含服给药而言，该组 合物可采用常规方式配制的片剂或锭剂的形式。就吸入给药而言，使用合适推进剂(如二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)的加压包装或喷雾
48器中气溶胶喷雾的形式常规递送本发明使用的预防剂或治疗剂。在加压气溶胶的情况下， 可通过阀门递送计量用量，以确定剂量单位。可将用于吸入或吹入的胶囊和药筒(例如，由 明胶组成)制成含有化合物和合适粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。可以配制通过注射，如推注或连续输注进行胃肠道外给药的预防剂或治疗剂。用 于注射的制剂可以是单位剂型，例如装在安瓿或多剂量容器中，添加有防腐剂。该组合物可 以是诸如油性或水性载体中的悬浮剂、溶液剂或乳剂的形式，可含有配方试剂，如助悬剂、 稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是使用前用合适的运载体如无菌无热原的水进 行重建的粉末形式。该预防剂或治疗剂也可配制成直肠组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有常 规栓剂基料，如可可油或其他甘油酯。除前述制剂外，该预防剂或治疗剂也可配制成长效制剂。这种长效制剂可通过植 入(例如皮下或肌肉内植入)或肌肉内注射给药。因此，例如，该预防剂或治疗剂也可与合 适的聚合材料或疏水材料(例如，用可接受的油配制成乳剂)或离子交换树脂配制在一起， 或者配制成微溶性衍生物，例如，微溶性盐。本发明也提供，将本发明预防剂或治疗剂包装在标明含量的密封容器如安瓿或小 药囊中。在一个实施方式中，在密封容器中以无菌冻干粉末或无水浓缩物形式提供该预防 剂或治疗剂，可用水或盐水将该抗体重建为合适浓度，以便给予对象。在本发明的一个实施方式中，配制或给予各种化疗剂、生物/免疫治疗剂和激素 治疗剂的方法是本领域已知的，在《医师案头参考》(Physician’ s DeskReference)，第56 版(2002)中常有描述。例如，在本发明的某些具体实施方式
中，可以如本文所述配制和提 供本发明治疗剂。在本发明的其它实施方式中，放疗剂如放射性同位素可作为胶囊中的液体或作为 饮料经口服给药。也可配制用于静脉内注射的放射性同位素。熟练的肿瘤学家可确定优选 的制剂和给药途径。在某些实施方式中，可将本发明组合物配制成lmg/ml、5mg/ml、10mg/ml和25mg/ ml用于静脉内注射，并且配制成5mg/ml、10mg/ml和80mg/ml用于重复皮下给药和肌肉内注射。如果需要，可将该组合物装入包装或分配装置中，所述包装或分配装置可包含一 个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，该包装可包括金属或塑料薄片，如泡罩包装。所 述包装或分配装置可附有给药说明书。剂量和给药频率可利用标准临床方法确定能有效预防、治疗、控制和/或改善过度增殖性疾病或 其一种或多种症状的本发明疗法(如预防剂或治疗剂)或本发明组合物的用量。给药频率 和剂量因每位患者的具体情况而异，这取决于所给的具体疗法(如具体治疗剂或预防剂)， 疾病、失调或病症的严重程度，给药途径，以及患者的年龄、体重、反应和过往病史。例如，可 通过将该组合物给予动物模型，例如本文所述或本领域技术人员已知的动物模型来确定有 效治疗、预防、控制和/或改善过度增殖性疾病或者其一种或多种症状的本发明预防剂或 治疗剂或组合物的剂量。此外，可任选地进行体外试验以助于鉴别最优的剂量范围。本领 域技术人员可通过考虑这些因素或以下因素，例如，文献报道和《医师案头参考》(第61版，2007)报道的剂量选择合适的方案。在各种实施方式中，给予疗法(如预防剂或治疗剂)的间隔小于1小时、约1小时、 约1小时-约2小时、约2小时-约3小时、约3小时-约4小时、约4小时-约5小时、约 5小时-约6小时、约6小时-约7小时、约7小时-约8小时、约8小时-约9小时、约9 小时-约10小时、约10小时-约11小时、约11小时-约12小时、不超过24小时或不超
过48小时。在某些实施方式中，在同一次患者就诊期间给予两个或更多个组分。本文所述的给药剂量和频率为术语“治疗有效”或“预防有效”所涵盖。通常，剂 量和频率还因每位患者的具体因素而异，这取决于所给的具体治疗剂或预防剂、癌症严重 程度和类型、给药途径，以及患者的年龄、体重、反应和过往病史。本领域技术人员可通过考 虑这些因素或以下因素，例如，文献报道和《医师案头参考》(第58版，2004)报道的剂量选 择合适的方案。小分子的示范性剂量包括每千克对象或样品重量为毫克或微克级的小分子用量 (如，约1微克/千克至约500毫克/千克、约100微克/千克至约5毫克/千克或约1微 克/千克至约50微克/千克)。对本发明所包括的抗体、蛋白质、多肽、肽和融合蛋白而言，给予患者的剂量一般 是 0. 0001 至 100mg/kg 患者体重。给予患者的剂量为 0. 0001mg/kg-20mg/kg、0. 000lmg/ kg-10mg/kg、0. 0001mg/kg-5mg/kg、0. 0001-2mg/kg>0. 0001-lmg/kg、0. 0001mg/kg-0. 75mg/ kg、0. 0001mg/kg-0. 5mg/kg、0. 0001mg/kg-0. 25mg/kg、0. 0001-0. 15mg/kg、0. 0001-0. IOmg/ kg、0. 001-0. 5mg/kg、0. 01-0. 25mg/kg 或 0. 01-0. lOmg/kg 患者体重。通常，因为对外来多肽 的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比其它来源的抗体长。因此，人抗体的给药剂量和给 药频率常常较低。另外，可通过修饰，如脂化提高抗体的摄取和组织渗透性，从而降低给予 本发明抗体或其片段的剂量和频率。在一个具体实施方式
中，预防、治疗、控制和/或改善患者的过度增殖性疾病或其 一种或多种症状的抗体的给药剂量是150yg/kg以下、125yg/kg以下、100yg/kg以下、 95 μ g/kg 以下、90 μ g/kg 以下、85 μ g/kg 以下、80 μ g/kg 以下、75 μ g/kg 以下、70 μ g/kg 以 下、65μ g/kg 以下、60 μ g/kg 以下、55 μ g/kg 以下、50 μ g/kg 以下、45 μ g/kg 以下、40 μ g/ kg 以下、35 μ g/kg 以下、30 μ g/kg 以下、25 μ g/kg 以下、20 μ g/kg 以下、15 μ g/kg 以下、 10 μ g/kg 以下、5 μ g/kg 以下、2. 5 μ g/kg 以下、2 μ g/kg 以下、1.5 μ g/kg 以下、1 μ g/kg 以 下、0. 5μ g/kg以下或0. 5μ g/kg患者体重以下。在另一实施方式中，预防、治疗、控制和/或 改善患者的过度增殖性疾病或其一种或多种症状的本发明抗体的给药剂量是以下单位剂 量0. lmg-20mg、0. lmg-15mg、0. lmg-12mg、0. lmg-10mg、0. lmg-8mg、0. lmg-7mg、0. lmg-5mg、 0. 1-2. 5mg、0. 25mg-20mg、0. 25-15mg、0. 25-12mg、0. 25-10mg、0. 25-8mg、0.25mg-7mg、 0. 25mg_5mg、0· 5mg-2. 5mg、lmg_20mg、lmg_15mg、lmg_12mg、lmg-10mg、lmg_8mg、lmg_7mg、 lmg-5mg 或 lmg-2. 5mg。在其它实施方式中，给予对象一个或多个剂量的有效量的一种或多种本发明疗法 (如治疗剂或预防剂)，其中所述有效量的剂量能使本发明疗法(如治疗剂或预防剂)血 清滴度达到至少0. 1 μ g/ml、至少0. 5μ g/ml、至少1 μ g/ml、至少2μ g/ml、至少5μ g/ml、 至少 6μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ml、至少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、
50至少 225μ g/ml、至少 250μ g/ml、至少 275μ g/ml、至少 300μ g/ml、至少 325μ g/ml、至少 350μ g/ml、至少375 μ g/ml或至少400 μ g/ml。在其它实施方式中，给予对象一剂有效量 的一种本发明抗体，使抗体的血清滴度达到至少0. 1 μ g/ml、至少0. 5 μ g/ml、至少1 μ g/ ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ml、至少 20 μ g/ ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ml、至少 150 μ g/ml、至 少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml，然后给 予一剂有效量的一种或多种本发明抗体，将血清滴度维持在至少0. 1 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ml、至少 150 μ g/ ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至少 275 μ g/ml、至 少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml。按照 这些实施方式，可给予对象1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个后续剂量。在一个具体实施方式
中，本发明提供预防、治疗、控制或改善过度增殖性疾病或 其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要的对象一剂至少10yg、至少15yg、 至少20 μ g、至少25 μ g、至少30 μ g、至少35 μ g、至少40 μ g、至少45 μ g、至少50μ g、至 少55 μ g、至少60 μ g、至少65 μ g、至少70 μ g、至少75 μ g、至少80 μ g、至少85 μ g、至少 90μ g、至少95μ g、至少100 μ g、至少105 μ g、至少110 μ g、至少115 μ g或至少120 μ g的 一种或多种本发明疗法(如治疗剂或预防剂)、联合治疗或组合物。在另一实施方式中，本 发明提供预防、治疗、控制和/或改善过度增殖性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方 法包括给予需要的对象一剂至少10 μ g、至少15 μ g、至少20 μ g、至少25 μ g、至少30 μ g、 至少35 μ g、至少40 μ g、至少45 μ g、至少50 μ g、至少55 μ g、至少60 μ g、至少65μ g、至 少70 μ g、至少75 μ g、至少80 μ g、至少85 μ g、至少90 μ g、至少95 μ g、至少100 μ g、至少 105 μ g、至少110 μ g、至少115 μ g或至少120 μ g的一种或多种本发明抗体、联合治疗或组 合物，每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每8天一次、每10天 一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。本发明提供预防、治疗、控制或防止癌症或过度增殖性疾病，或者其一种或多种症 状的方法，所述方法包括(a)给予需要的对象一个或多个剂量预防或治疗有效量的一种 或多种本发明抗体、联合治疗或组合物；和(b)给予一定数量的所述治疗(如治疗剂或预防 剂)的剂量后，监测所述给予的抗体在所述对象中的血浆水平/浓度。而且，所述一定数量 的剂量是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个剂量的预防或治疗有效量的一种或多种本发 明抗体、组合物或联合治疗。在一个具体实施方式
中，本发明提供一种预防、治疗、控制和/或改善癌症或过度 增殖性疾病，或者其一种或多种症状的方法，所述方法包括(a)给予需要的对象一剂至少 10 μ g (例如，至少15μ g、至少20μ g、至少25μ g、至少30μ g、至少35μ g、至少40μ g、至 少45 μ g、至少50 μ g、至少55 μ g、至少60 μ g、至少65 μ g、至少70 μ g、至少75 μ g、至少 80 μ g、至少85 μ g、至少90 μ g、至少95 μ g或至少100 μ g)的一种或多种本发明治疗(如治 疗剂或预防剂)；和(b)当给予所述对象的抗体的血浆水平低于0. 1 μ g/ml、低于0. 25 μ g/ ml、低于0.5 μ g/ml、低于0. 75 μ g/ml或低于1 μ g/ml时，给予所述对象一个或多个后续
51剂量。在另一实施方式中，本发明提供一种预防、治疗、控制和/或改善癌症或过度增殖性 疾病，或者其一种或多种症状的方法，所述方法包括(a)给予需要的对象一个或多个剂量 至少10 μ g (至少15 μ g、至少20 μ g、至少25 μ g、至少30 μ g、至少35 μ g、至少40μ g、至 少45 μ g、至少50 μ g、至少55 μ g、至少60 μ g、至少65 μ g、至少70 μ g、至少75 μ g、至少 80 μ g、至少85 μ g、至少90 μ g、至少95 μ g或至少100 μ g)的一种或多种本发明抗体；(b) 在给予一定数量的剂量后，监测所给抗体在所述对象中的血浆水平；和(C)当给予所述对 象的抗体的血浆水平低于0. 1 μ g/ml、低于0. 25 μ g/ml、低于0. 5 μ g/ml、低于0. 75 μ g/ml 或低于lyg/ml时，给予后续剂量的本发明抗体。所述一定数量的剂量是1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11或12个剂量的有效量的一种或多种本发明抗体。已用于或目前正用于预防、治疗、控制和/或改善过度增殖性疾病或其一种或多 种症状的除本发明抗体以外的治疗(如预防剂或治疗剂)可与本发明方法的一种或多种 抗体联合使用，以治疗、控制、预防和/或改善过度增殖性疾病或其一种或多种症状。用 于本发明联合治疗的预防剂或治疗剂的剂量低于已用于或正用于预防、治疗、控制和/或 改善过度增殖性疾病或其一种或多种症状的剂量。目前用于预防、治疗、控制和/或改善 过度增殖性疾病或其一种或多种症状的药剂的推荐剂量可获自本领域已知的任何参考文 献，包括但不限于=Hardman等编，2001，Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(The PharmacologicalBasis Of Basis Of Therapeutics),第 10 版，Mc-Graw-Hi 11,纽约；〈〈医 师案头参考》(Physician' s Desk Reference, PDR)第58版，2004，新泽西州蒙特威尔的医 疗经济公司(Medical Economics Co.，Inc.，Montvale，NJ)，通过引用将其全文纳入本文。在各种实施方式中，给予治疗(如预防剂或治疗剂)的间隔小于5分钟、小于30分 钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1-2小时、间隔约2小时-3小时、间隔约3小时-4小 时、间隔约4小时-5小时、间隔约5小时-6小时、间隔约6小时-7小时、间隔约7小时-8 小时、间隔约8小时-9小时、间隔约9小时-10小时、间隔约10小时-11小时、间隔约11 小时-12小时、间隔约12小时-18小时、间隔18小时-24小时、间隔24小时-36小时、间 隔36小时-48小时、间隔48小时-52小时、间隔52小时-60小时、间隔60小时-72小时、 间隔72小时-84小时、间隔84小时-96小时或96小时-120小时。在某些实施方式中，在 同一次患者就诊期间给予两个或更多个治疗。在某些实施方式中，循环给予一种或多种本发明抗体和一种或多种其它治疗(如 预防剂或治疗剂)。循环治疗包括给予第一治疗(如，第一种预防剂或治疗剂)一段时间，然 后给予第二治疗(如，第二种预防剂或治疗剂)一段时间，任选地，之后给予第三治疗(如， 预防剂或治疗剂)一段时间等等，并重复此种顺次给药即该循环，以降低对一种治疗发生 耐受的概率、避免或减轻一种治疗的副作用和/或提高这些治疗的功效。在某些实施方式中，可重复给予相同的本发明抗体，给药可间隔至少1天、2天、3 天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月，75天、3个月或至少6个月。在其它实施方式中， 可重复给予除本发明抗体以外的相同治疗(如，预防剂或治疗剂)，所述给药可间隔至少1 天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月，75天、3个月或至少6个月。选择患者群EphA2或ErbB2也可用作癌症或癌前病症的标记物。在本发明中，申请人发现 EphA2和ErbB2在癌症中相互作用。因此，在一个实施方式中，本发明提供筛选或选择患者
52群、诊断癌症或癌前病症或对癌症分期的方法，该方法包括检测和任选地定量测定生物样 品中EphA2和ErbB2的存在、含量或活性。本发明诊断方法可用于获得或确认癌症的初步 诊断，或者提供有关癌症定位、癌症转移或癌症预后的信息。在一个具体实施方式
中，提供 经过优化用于筛选和检测EphA2和ErbB2的诊断试剂盒。在诊断方法的一个实施方式中，从哺乳动物中取出生物样品如组织、器官或液体， 裂解细胞，将裂解液与多克隆或单克隆EphA2和/或ErbB2抗体相接触。得到的抗体复合 物或者本身可检测，或者能够与另一化合物结合形成可检测复合物。可以在ELISA或相似 实验中直接检测结合的抗体；或者，诊断试剂可包含可检测标记，可检测标记可用本领域已 知方法检测。在通过可检测标记的诊断试剂如抗体结合检测EphA2和ErbB2的本发明方法的实 施方式中，标记包括发色染料、荧光标记和放射性标记。最常用的发色剂是3-氨基-9-乙 基咔唑(AEC)和3，3’ - 二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)。它们可用光学显微镜检测。最常用的荧光标记化合物是荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、 邻苯二醛和荧光胺。也可使用化学发光和生物发光化合物如氨基苯二酰胼、异氨基苯二酰 胼、热发光性(theromatic)吖啶鐺酯、咪唑、吖啶鐺盐、草酸酯、萤光素、萤光素酶和发光蛋 白。荧光标记的抗体接触适当波长的光后，可通过其荧光检测其存在。具体可用于标记本发明抗体的放射性同位素包括3H、125I、mI、35S、32P和14C。可通 过一些方式检测放射性同位素，例如使用Y计数器、闪烁计数器或放射自显影。可利用Western印迹、斑点印迹、沉淀、凝集、酶学免疫实验(EIA)或酶联免疫吸附 实验(ELISA)、免疫组化、原位杂交、对各种组织液或体液进行流式细胞术和各种夹心实验 检测抗体-抗原复合物。这些技术是本领域众所周知的。例如参见美国专利第5，876，949 号，该文献通过引用纳入本文中。在酶学免疫实验(EIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)中， 酶在随后接触其底物时，与底物相互作用并产生可通过(例如)分光光度法、荧光法或肉眼 观测检测的化学部分。可用于可检测标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌 核酸酶、S 5类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧 化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化 氢酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰基胆碱酯酶。其他标记和检测抗体的方法是 本领域已知的，并且落入本发明范围内。在诊断方法的另一实施方式中，对生物样品进行生物化学测定，以检测EphA2和 ErbB2激酶活性。也可使用结合编码EphA2和ErbB2蛋白的DNA或RNA的可检测试剂进行 检测。对各种组织样品，包括肿瘤组织生物活检样品和各种体液样品，如血液、血浆、脊 髓液、唾液和尿液而言，EphA2和ErbB2可用作癌症、癌前疾病或转移性疾病的标记物。其他抗体可与结合EphA2和ErbB2的抗体联用，以提供有关是否存在癌症和该疾 病的状态的详细信息。例如，使用磷酸化酪氨酸_特异性抗体能为测定、检测或评估恶性状 态提供额外数据。治疗用途的表征和证明可通过标准药学方法，在细胞培养物或实验动物中测定LD50(使50%群体死亡的 剂量)和ED50 (在50%群体中有效治疗的剂量)，以确定本发明预防和/或治疗方案的毒性和功效。毒性和疗效的剂量比是治疗指数，可表示为LD50/ED50。虽然可采用存在毒副作 用的预防剂和/或治疗剂，但应仔细设计使这类药物靶向患病组织位点的递送系统，以最 大程度降低对未感染细胞的潜在损伤，从而降低副作用。可利用获自细胞培养实验和动物研究的数据制定人用预防剂和/或治疗剂的剂 量范围。这类药物的剂量优选属于毒性很小或无毒性的包括ED50在内的循环浓度范围。 该剂量可根据所用剂型和所用给药途径在此范围内变化。就本发明方法所用的任何药剂 而言，最初可由细胞培养实验估计治疗有效剂量。可以调整动物模型中的剂量，以实现包括 IC50( S卩，受试化合物实现半数最大症状抑制的浓度)的循环血浆浓度范围(经细胞培养测 定)。可利用这些信息更精确地确定人用剂量。可通过高效液相色谱测定血浆水平。也可利用癌症研究所用的各种实验动物模型，例如SCID小鼠模型或小鼠EphA2 和/或ErbB2被人EphA2和/或ErbB2替代的转基因小鼠、具有人异种移植物的裸小鼠 或本领域已知和以下文献所述的任何动物模型(包括仓鼠、兔等)测定本发明所用疗法 的抗癌活性，这些文献是《在抗癌药物开发中肿瘤模型的实用性》(Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development) (1999, Fiebig 禾口 Burger 编)；《对月中瘤学的 贡献》(Contributions to Oncology) (1999, Karger)；《肿瘤学研究中的裸小鼠》(The Nude Mouse in Oncology Research) (1991，Boven 和 Winograd 编)；和《抗癌药物开发指南》 (Anticancer DrugDevelopment Guide) (1997，Teicher 编)，通过弓|用将其纳入本文。在用于人之前，可以先在体外，然后在体内研究本发明方法和组合物的所需治疗 或预防活性。例如，可用于确定给予何种具体治疗方案的体外实验包括体外细胞培养实验， 其中培养患者组织样品，并使其接触或给予某种方案，观察这种方案对组织样品的影响，例 如，EphA2的磷酸化/降解改变，在软琼脂中的生长和/或集落形成受抑制或水平降低，或在 三维基底膜或胞外基质制品中形成管状网络。接触细胞的增殖或存活水平降低表明该治疗 剂能有效治疗该患者的病症。或者，不培养患者细胞，而用肿瘤或恶性细胞系的细胞筛选所 述治疗剂或方法。可使用本领域许多标准实验评估这类存活和/或生长；例如，可通过检测 3H-胸苷掺入、直接细胞计数、检测已知基因如原癌基因(如f0S、myc)或细胞周期标记物 转录活性的改变来测定细胞增殖；可通过台盼蓝染色评估细胞活力，可通过观察形态改变、 EphA2的磷酸化/降解改变、在软琼脂中的生长和/或集落形成水平降低，或在三维基底膜 或胞外基质制品中形成管状网络等评估分化情况。可以在进行人体试验之前，利用合适的动物模型系统，包括但不限于大鼠、小鼠、 鸡、牛、猴、兔、仓鼠等，例如上述动物模型检测用于治疗的化合物。该化合物可用于合适的 临床试验。另外，本领域技术人员已知的任何试验均可用于评估本文所述联合治疗在治疗或 预防癌症中的预防性和/或治疗性用途。药盒本发明提供包括一个或多个装有本发明组合物的容器的药物包装或药盒。此外， 该药物包装或药盒中可装有用于治疗癌症的一种或多种其他预防剂或治疗剂。本发明也提 供包括一个或多个容器的药物包装或药盒，所述容器中装有本发明药物组合物的一种或多 种成分。所述容器任选附有关于药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构颁发的告 知书，该告知书反映出生产、使用或销售管理机构批准其用于人体。
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本发明还提供与检测EphA2和/或ErbB2有关的筛选和/或诊断试剂盒。在一个具体实施方式
中，本发明提供经过优化用于依次或同时筛选和检测EphA2和ErbB2的试剂
品.ο然而，出于描述目的，上文已经描述了本发明的具体实施方式
，本领域技术人员应 理解，可以在不背离所附权利要求书所述的本发明的情况下对细节作出许多改变。将本说明书中提及的所有发表物、专利和专利申请纳入本说明书作参考，如同专 门和单独将各篇发表物、专利或专利申请纳入本文作参考的程度一样。
实施例下面开始参照以下实施例描述本发明。提供这些实施例的目的只是说明，不应认 为本发明仅限于这些实施例，而应认为本发明包括通过本文所述内容可明显看出的任何和 所有变化形式。实施例1 试剂使用对抗以下蛋白质的抗体EphA2 (加州伯林盖姆的甾酶实验室公 司(Zymed Laboratories, Burlingame, CA)；加州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司 (Santa Cruz Biotechnology ；Santa Cruz，CA)；纽约州普莱西德湖的昂斯特生物技术 公司(Upstate Biotechnology, Lake Placid，NY))，EphA4(昂斯特生物技术公司)，增 殖性细胞核抗原(PCNA;新泽西州富兰克林湖的BD生物科学公司(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ))，抗-Erk，抗-磷酸化苏氨酸-202/酪氨酸_204Erk，Akt，磷酸化丝氨 酸-473Akt (马萨诸塞州波士顿的细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology, Boston，MA))，抗-微管蛋白(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)), ErbB2(加州弗里蒙特的新标记/拉威信公司(Neomarkers/Lab Vision Corporation, Fremont, CA))，抗_b_肌动蛋白(圣克鲁兹生物技术公司)，Ras (BD生物科 学公司)，RhoA(圣克鲁兹生物技术公司；BD生物科学公司)，血管假性血友病因子(vWF;加 州南圣弗朗西斯科的甾酶实验室公司(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)), E-钙粘着蛋白(BD生物科学公司)，Ki67(马萨诸塞州诺威耳的威信生物系统公司(Vision Biosystems Inc. , Norwe 11, ΜΑ))和正常兔IgG (圣克鲁兹生物技术公司)。治疗性抗_EphA2 抗体(ICl)和对照抗体(R347)由马里兰州盖瑟斯堡的米迪缪尼公司(MedImmune, Inc.， Gaithersburg, MD)提供。Raf-I RBD琼脂糖Ras测定试剂购自昂斯特生物技术公司。 5_溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich) 0 BrdU检测和 ApopTag Red原位凋亡试剂盒分别购自甾酶实验室公司和马萨诸塞州比尔里卡的开米康/ 密理博公司(Chemicon/Millipore，Billerica，ΜΑ)。亲和素过氧化物酶试剂购自加州伯 林盖姆的维克多实验室公司(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，液体3，3，- 二氨基 联苯胺四盐酸盐(DAB)底物试剂盒购自留酶实验室公司。肝配蛋白-Al-Fc购自明尼苏达 州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)。雌激素、孕酮、胰岛素 和表皮生长因子(EGF)购自西格玛-奥德里奇公司。4’，6-二脒基-2苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)购自西格玛-奥德里奇公司。T0-PR0-3碘化物核染料、CellTracker橙色CMTMR和 CellTracker绿色CMFDA染料购自分子探针公司(Molecular Probes)(加利福尼亚州卡尔 斯巴德的英杰集团公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA))。生长因子减少的基质胶(Matrigel)购自BD生物科学公司。AG825 ErbB2激酶抑制剂购自卡巴开(Calbiochem) (加州圣地亚哥的EMD生物科学公司(EMD Biosciences, San Diego, CA))。组成型表达活 性RhoA(Q63L)和Erk-I的重组腺病毒分别购自加州圣地亚哥的细胞生物实验室公司(Cell Biolabs，San Diego,CA)和宾夕法尼亚州费城的维克多生物实验室公司(Vector Biolabs, Philadelphia, PA)。以前记载过表达b_半乳糖苷酶的对照腺病毒和表达EphA2的腺病毒 (Brantley-Sieders 等，2004 ；Cheng 和 Chen，2001)。小鼠和体内肿瘤研究所有动物均在无病原体的条件下饲养，按照AAALAC指 南，经范德比尔特大学动物护理和使用委员会(VanderbiltUniversity Institutional Animal Care禾Π Use Committee)批准进行实验。EphA2_缺陷型小鼠与FVB动物回交5-7 代，然后与近亲FVB背景的MMTV-Neu或MMTV-PyV_mT小鼠杂交[缅因州巴港的杰克逊实验 室公司(JacksonLaboratories，Bar Harbor, ME) ； (Guy 等，1992a ;Guy 等，1992b)]。野生 型、杂合或无ephA2的MMTV-Neu或MMTV-PyV-mT阳性转基因动物(Brantley-Sieders等， 2004b)通过聚合酶链反应(PCR)鉴定，即用以下引物分析来自尾生物活检样品的基因组 DNA :5，-GGG TGC CAA AGT AGA ACTGCG—3，(正向)(SEQ ID NO :1)、5，-GAC AGA ATA AAA CGC ACG GGT G_3，(neo) (SEQ ID NO :2)、5，-TTC AGC CAA GCC TAT GTA GAA AGC-3，(反 向)(SEQ ID NO :3)。通过PCR，利用杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)推荐的引 物和条件检测neu和PyV-mT转基因。通过每周触诊监测年龄匹配的同窝仔畜的肿瘤形成。收集出生后8个月和1年的两组MMTV-Neu半合子、EphA2+/+、+/-和-/-动物 的肿瘤和肺。在出生后100天收集MMTV-PyV-mT半合子、EphAl+/+、+/-和-/-动物的肿 瘤和肺。对肿瘤计数，并用卡尺测量大小。用以下公式计算肿瘤体积体积=长度X宽 度2XO. 52 (Bergers等，2000)。固定肺，脱水，对表面转移灶计数。在移植研究中，清除3 周龄接受者EphA2+/+或EphA2-/-FVB雌性动物的左侧腹股沟乳腺脂肪垫中的内源性上 皮细胞，如前所述(Brantley等，2001)，注射IO6个源自MMTV-Neu (Muraoka等，2003)或 MMTV-PyV-mT (Muraoka-Cook等，2004)动物的肿瘤细胞。在注射后4_5周收获得到的肿瘤 进行分析。从肿瘤细胞注射后2周开始，接受小鼠接受腹膜内注射ICl抗-EphA2抗体或对 照IgG(10mg/kg，每周两次，共3周)，然后收集和分析原始肿瘤。在2-3个独立实验中分析 至少10只动物/条件。组织学分析在指定时间点收集乳腺和肿瘤，用10%中性缓冲福尔马林(新罕布 什尔州汉普顿的费氏科学公司(Fisher Scientific, Hampton, NH))在4°C固定24小时。 如前所述(Brantley等，2001)，进行乳腺的全组织标本包埋苏木精染色和7mm乳腺组织切 片的苏木精伊红染色。在EphA2免疫组化中，在柠檬酸盐缓冲液中煮沸以提取抗原，如前所 述(Brantley等，2002)用5mg/ml兔抗_EphA2抗体(甾酶实验室公司)检测切片。如前所 述(Brantley等，2002)对PCNA进行免疫组化染色，通过计算相对于总核数量PCNA阳性核 的平均百分数(每个基因型取34独立的乳腺和肿瘤样品，每个样品取4个随机20X视野)， 定量分析增殖情况。用Apoptag Red原位凋亡检测试剂盒，按照生产商说明书进行凋亡测 定。通过计算相对于总核数量TUNEL阳性核的平均百分数(每个基因型取34独立的乳腺 和肿瘤样品，每个样品取4个随机20X视野)来评估凋亡。用兔单克隆抗-P-Erk抗体克隆 20G11，按照细胞信号传导技术公司(Cell SignalingTechnology)的方案检测组织中的磷 酸化-Erk。由范德比尔特大学免疫组化中心实验室对血管假性血友病因子(vWF)进行彩色免疫组化染色，如前所述(Brantley-Sieders等，2005)进行免疫荧光染色。在从每个基 因型取至少4个肿瘤样品，每个样品4个随机20X视野中对vWF-阳性血管计数，以确定微 血管密度。如上文有关抗_EphA2的描述，用5mg/ml兔抗_ErbB2抗体(新标记/拉威信公 司)进行ErbB2免疫组化。细胞培养如前所述(Brantley等，2001 ；Muraoka等，2002)由小鼠分离原代乳腺 上皮细胞(PMEC)，在生长因子减少的基质胶(1/20稀释)包被的组织培养皿上用PMEC培养 基[补充有5ng/ml雌激素、5ng/ml孕酮、5ng/ml EGF和5mg/ml胰岛素(均购自西格玛-奥 德里奇公司)的DMEM/F12培养基(弗吉尼亚州赫恩登的培养基技术公司(Mediatech， Hern don, VA))]培养。如前所述(Muraoka等，2003)，由野生型或EphA2_缺陷型MMTV-Neu动 物获得原代肿瘤细胞。简言之，将肿瘤组织分散在PMEC消化培养基中(Brantley等，2001 ； Muraoka等，2002)。离心获得细胞团块，用加入10 %胎牛血清(犹他州洛根的海克隆公司 (Hyclone, Logan, UT))的DMEM/F12洗涤细胞，用无血清培养基洗涤数次，接种于PMEC培养 基。连续3天每24小时将细胞接种于组织培养皿，由第三天接种的培养液收集肿瘤细胞 并扩增。通过neu转基因的表达验证肿瘤细胞在培养物中的富集(Muraoka等，2003)。在 PMEC培养基中培养用于移植和信号传导研究的MMTV-Neu肿瘤衍生的细胞系(Muraoka等， 2003)和MMTV-PyV-mT肿瘤衍生的细胞系(Muraoka-Cook等，2004)。在EphA2降解研究中， 在所示浓度的ICl抗_EphA2抗体或对照IgG(米迪缪尼公司)存在下培养肿瘤细胞48小 时，然后收获裂解物进行免疫印迹分析。如前所述(Brantley等，2002 ；Muraoka等，2002)， 用上述BrdU和TUNEL检测试剂盒进行体外增殖和凋亡分析。在拯救实验中，用lX108pfu/ ml表达Erk-I或对照b_半乳糖苷酶的腺病毒转导EphA2_缺陷型Neu原代肿瘤细胞，48小 时后进行BrdU测定。如前所述(Brantley-Sieders等，2004b)进行Transwell迁移实验。 在拯救实验中，用lX108pfu/ml表达有组成活性的RhoA (Q63L)或对照b_半乳糖苷酶的 腺病毒转导EphA2-缺陷型Neu原代肿瘤细胞，48小时后进行Transwell测定。如前所述 (Brantley-Sieders 等，2005 ；Brantley-Sieders 等，2006)进行肿瘤-内皮细胞共培养迁 移实验。如前所述(Brantley-Sieders等，2006 ；Brummelkamp 等，2002)，将用于小鼠 EphA2 或无关对照序列的siRNA序列克隆到pRetroSuper病毒载体中，用其产生逆转录病毒感染 MMTV-Neu 肿瘤细胞。以下序列用于靴向 EphA2 siRNA# 15‘-GCCAAAGTAGAACTGCGTT (1140-11 58)-3'(SEQ ID NO 4) ；siRNA#25‘-GCGCTAGACAAGTTCCTTA(2211-2229)-3‘(SEQ ID NO 5)； 对照 siRNA 5，-GCACCAGTTCAGCAAGACT-3，(SEQ ID NO :6)。如前所述(Debnath 等，2003) 建立三维球状培养物。维持培养8天，然后进行光学测量。用国立卫生研究院的图像J软 # (Image J software, National Institutes of Health) id^ 4
野3个培养物的球状培养物的数字图像。对于共聚焦成像，如前所述(Spancake等，1999)， 用10%中性缓冲福尔马林固定球状培养物，并对E-钙粘着蛋白进行免疫组化分析，然后用 T0-PR0-3染核。如上所述将肿瘤细胞移植到接受FVB小鼠经过清除的脂肪垫内。在2-3个 独立实验中分析至少10只动物/条件。如前所述(Ueda等，2004)维持稳定过表达人ErbB2/Her2的亲代MCF10A和MCF10A 细胞。如前所述(Debnath等，2003)建立三维球状培养物。用1 X 108pfu/ml组成性表达 EphA2或对照b-半乳糖苷酶的腺病毒转导细胞，48小时后进行分析。如上所述进行染色，
57以便进行共聚焦分析。免疫沉淀和免疫印迹分析如前所述(Brantley等，2002)进行EphA2的免疫沉淀 和免疫印迹。用Img兔抗-ErbB2和Img小鼠抗_ErbB2 Ab-17 (新标记/拉威信公司)免疫 沉淀ErbB2。需要时，用加入2 % FBS的DMEM F12培养基培养250，000个PMEC (用于western 分析)或2，500，000个原代肿瘤细胞(用于GTP-Ras和-Rho/Rac拉下实验(pull-down assay))过夜。用士肝配蛋白-Al-Fc或EphA2_激动剂单克隆抗体ICl以所示浓度和时间 处理细胞。收获裂解物，如前所述(Brantley等，2002)用于免疫印迹分析。用NIH图像J 软件进行密度测定分析。在Ras和Rho/Rac拉下实验中，收集肿瘤组织，称重，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中 机械勻浆化，离心并重悬于生产商推荐的测定缓冲液(昂斯特生物技术公司)中。每次测定 使用约500mg肿瘤裂解物。利用Raf-IRas结合结构域-GST测定试剂(昂斯特生物技术公 司)按照生产商方案进行Ras测定。利用Rhorekin结合结构域-GST试剂，如前所述(Fang 等，2005)进行Rho测定。在某些共免疫沉淀实验中，利用脂质转染试剂2000 (英杰公司)， 用 myc 标记的 erbB2 (pcDNA3_erbB2)和印hA2 (pcDNA3_EphA2)各 Img 共同转染 C0S7 细胞。 用 1 % NP-40 缓冲液(IOmM Tris-HCl pH 7. 5，150mM NaCl，2mM EDTA, 1 % NP-40 和 50mM 蛋 白酶抑制剂)裂解细胞。用抗-myc抗体(西格玛奥德里奇公司)和抗_EphA2抗体(圣克 鲁兹公司，sc-924)对裂解物进行免疫沉淀。在SDS-PAGE上分析免疫复合物，并用抗_EphA2 和抗-myc抗体进行Western印迹分析。由MMTV-Neu细胞免疫沉淀EphA2，然后用ImM交联 剂DTSSP处理一半样品。用抗_ErbB2抗体(新标记公司(Neomarkers)，1 2000)对免疫 沉淀物进行Western印迹分析。如上所述，由MCFlOA和MCF10A. HER2细胞免疫沉淀EphA2 和ErbB2。用10mg/ml AG825ErbB2激酶抑制剂培育细胞24或48小时，然后进行免疫沉淀。结果EphA2_缺陷能抑制MMTV-Neu小鼠中的乳腺上皮增生、肿瘤发生、转移和血管募集产生野生型、杂合子或EphA2缺陷型MMTV-Neu阳性雌小鼠并监测其肿瘤形成。由 出生后8个月和1年的两组动物收集乳腺组织和/或肿瘤。相对于野生型和杂合子对照， EphA2-缺陷型MMTV-Neu雌性发生乳腺上皮增生和乳腺肿瘤的频率降低2至3倍(图1A)。 全组织标本包埋和组织学分析揭示出，相对于对照，EphA2缺陷型MMTV-Neu腺体中乳腺上 皮增生和上皮细胞含量降低(图1C)。没有观察到野生型与EphA2-缺陷型MMTV-Neu动物 发生肿瘤的潜伏期的显著性差异，但相对于EphA2-缺陷型动物，观察到野生型动物的肿瘤 体积小约3倍。然而，与EphA2缺陷型动物相比，野生型和杂合子对照的总体肿瘤负荷较高， 因为它们在出生后1年发生两个或多个肿瘤，而EphA2缺陷型动物只发生一个肿瘤。而且， 在30% EphA2-缺陷型MMTV-Neu乳腺中，乳腺上皮细胞无法穿透乳腺脂肪垫(图9A)。为了检测EphA2_缺陷型与野生型MMTV-Neu动物的乳腺上皮内的恶变前改变，我 们通过对正在增殖的细胞核抗原(PCNA)进行染色和TUNEL实验分别评估了组织切片中的 增殖和凋亡情况。与EphA2+/+MMTV-Neu乳腺上皮相比，EphA2_/_乳腺上皮中上皮细胞的增 殖低5. 5倍，而凋亡水平不受影响(图1D)。为了确定与周围宿主组织相比乳腺上皮的增殖 缺陷是否由EphA2缺陷引起，分析了分离自野生型或EphA2-缺陷型动物的纯化原代乳腺上 皮细胞(PMEC)的增殖和凋亡。经Brdu掺入评估，相对于野生型对照，血清刺激的EphA2-缺 陷型细胞的增殖降低接近3倍(图1E)，这表明EphA2介导的对增殖的影响至少部分源于上皮细胞自身。令人感兴趣的是，与原位乳腺上皮不同，观察到与野生型细胞相比EphA2_缺 陷型PMEC的凋亡适度明显增加(图1E)。总之，这些数据表明缺少EphA2会抑制ErbB2引 发的乳腺上皮细胞增生。在实际发生肿瘤的EphA2缺陷型动物中，没有观察到潜伏期的显著改变。然而，检 测到相对于野生型对照EphA2缺陷型动物的肿瘤体积缩小近3倍。此外，与EphA2缺陷型 小鼠相比，野生型和杂合子对照的总体肿瘤负荷较高，因为对照动物在出生后1年发生两 个或多个肿瘤，而EphA2缺陷型动物只发生一个肿瘤。在MMTV-Neu野生型雌性的乳腺上皮 细胞和相关血管中检测到EphA2蛋白表达，但在EphA2-缺陷型MMTV-Neu小鼠的组织中未 检测到EphA2蛋白表达(图9B)。ErbB2在MMTV-Neu肿瘤中的表达水平和定位不受EphA2 缺陷的影响(图9C，图4C)。1岁时，与野生型或杂合子对照相比，从EphA2缺陷型MMTV-Neu 小鼠收获的肺的表面转移灶数量降低近5倍(图1B)。而且，与野生型和杂合子对照相比， EphA2-缺陷型动物的总体转移频率较低(图1A)。在出生后8个月对根据每种基因型收集的肿瘤进行组织学检测，结果揭示出原位 癌和侵袭性癌的相关病灶主要以边界清晰的方式增殖，其特征是挤压，而非边界浸润。在由 出生后1年的动物收集的肿瘤中观察到更具侵袭性的癌。相对于野生型MMTV-Neu肿瘤中观 察到的致密实心板样生长图样，分离自EphA2缺陷型MMTV-Neu小鼠的肿瘤显示出更多囊性 变性和清晰内腔形成的区域，这与分化程度更高的表型相一致(图1F)。肿瘤组织的PCNA 染色揭示出，相对于野生型肿瘤，EphA2-缺陷型MMTV-Neu肿瘤的增殖降低近2倍(图1G)。 通过血管假性血友病因子(vWF)的免疫组化染色评估肿瘤微血管，这证明缺乏EphA2表达 与微血管密度显著降低(2. 9倍)相关(图1H)。与对照相比，EphA2缺陷型MMTV-Neu肿瘤 中凋亡水平未改变。MMTV-Neu肿瘤的血管募集需要宿主微环境中存在EphA2虽然本文提供的数据提示EphA2缺陷限制了 MMTV-Neu乳腺的上皮增殖，但以前的 数据提示肿瘤血管化可能需要EphA2 [综述见(Brantley-Sieders和Chen，2004)]。实际 上，在MMTV-Neu/EphA2-缺陷型肿瘤中观察到肿瘤血管化降低(图1H)。为了确定相对于肿 瘤细胞，宿主组织中肿瘤微血管密度缺陷是否由EphA2缺陷造成，将野生型MMTV-Neu肿瘤 细胞(Muraoka等，2003)原位植入同系野生型或EphA2缺陷型FVB宿主动物的经清除的脂 肪垫内。植入EphA2缺陷型宿主的野生型肿瘤细胞产生的肿瘤明显小于植入野生型宿主的 细胞产生的肿瘤(图10A)。相对于野生型对照接受者，观察到由EphA2缺陷型接受者分离 的肿瘤的微血管密度低7倍(图10B)。与这些数据一致的是，与野生型对照动物分离的内 皮细胞所具有的强烈迁移反应相比，在共同培养实验中EphA2缺陷型动物的微血管内皮细 胞对MMTV-Neu肿瘤细胞的迁移反应明显较低(图10C)。总之，这些数据表明EphA2信号传 导能在肿瘤微环境，包括血管内皮中和肿瘤实质内通过不同过程促进肿瘤发生和进展。EphA2表达缺失会降低MMTV-Neu肿瘤细胞的肿瘤形成和侵袭性。除在EphA2_缺陷先于肿瘤发生的内源性MMTV-Neu肿瘤内分析EphA2在肿瘤发生 和进展中的功能外，我们还希望检测在已建立的肿瘤细胞中降低EphA2表达的影响。使用 在已建立的衍生自MMTV-Neu肿瘤的细胞系中的RNAi敲减策略(Muraoka等，2003)。如图 2A所示，相对于亲本细胞和表达对照siRNA的细胞，在MMTV-Neu细胞中两种独立siRNA序 列的稳定表达能明显降低EphA2表达。EphA2表达降低的细胞群体的生长速率比亲本细胞和表达对照siRNA的细胞慢(数据未显示)。与生长速率降低相一致的是，在EphA2siRNA 克隆中抑制EphA2表达降低了磷酸化Erk的水平，Erk是MMTV-Neu模型中已知的增殖调节 物[综述见(Eccles，2001)](图2A)。亲代MMTV-Neu细胞和用对照siRNA转导的细胞形成 大的多腺泡结构，且在三维基质胶培养中难以形成内腔，这与以前记载的ErbB2活性对人 MCFlOA细胞三维培养物的影响相一致(Muthuswamy等，2001)。相反，EphA2表达降低对三维 培养的MMTV-Neu细胞的ErbB2/Neu_驱动的多腺泡表型有损害。取而代之的是，这些细胞主 要形成由围绕中央腔的上皮细构成的小的良好组织的腺泡(图2B和2C)。而且，对照细胞 形成的单个三维集落的大小是EphA2表达降低的细胞的3到4倍(图2B)。虽然MMTV-Neu 亲代细胞或表达对照siRNA的细胞在原位植入FVB接受雌性小鼠经清除的脂肪垫时形成肿 瘤，但EphA2表达降低的MMTV-Neu细胞无法建立肿瘤或在一少部分动物中形成非常小的不 可触知的肿瘤(图2D)。这些数据表明对ErbB2/Neu癌基因而言，EphA2活性是肿瘤细胞固 有的生长和侵袭性所必需的。EphA2表达增加能增强过度表达人ErbB2/HER2的MCFlOA细胞的生长和侵袭性为了确定EphA2能否增强ErbB2_介导的生长和侵袭性，我们在未转化的MCFlOA 人乳腺上皮细胞和通过腺病毒转导稳定表达ErbB2人同源物HER2的MCFlOA细胞(Ueda 等，2004)中过度表达EphA2。与先前研究(Zelinski等，2001) —致的是，过度表达EphA2 增强生长，因为观察到三维基质胶培养物中的集落大小增加(图3A)。相对于亲代MCF10A， 过度表达HER2的细胞形成较大的多腺泡结构，但在三维基质胶培养中难以形成内腔(图 3A)，这与以前的报道相一致(Muthuswamy等，2001 ;Ueda等，2004)。与未转导对照或用 Ad-β -半乳糖苷酶病毒转导的细胞相比，在MCF10A. HER2细胞中通过腺病毒转导过度表达 EphA2导致单个集落的大小增加2倍(图3A)。此外，经共聚焦显微术评价，EphA2过度表 达时MCFlOA和MCF10A. HER2形成的腺泡结构中内腔填充度和侵袭性突出体增加(图3B)。 对细胞核Ki67的定量测定揭示出，与对照细胞相比，在MCFlOA和MCF10A. HER2细胞中过度 表达EphA2将增殖提高近3倍(图3B)。通过免疫印迹确认HER2在MCF10A. HER2细胞中的 过度表达以及腺病毒基因产物的表达(图4C)。这些数据表明，EphA2过度表达足以促进乳 腺上皮增殖和侵袭，并增强ErbB2/HER2诱导的生长和侵袭性。EphA2促进Ras/MAPK活化和肿瘤细胞增殖为检测调节增殖的肿瘤细胞固有的特异性EphA2信号传导事件，由EphA2缺陷型 小鼠和野生型对照纯化原代MMTV-Neu肿瘤细胞(PMTC)。与野生型细胞相比，EphA2_缺陷型 PMTC的增殖水平降低(图4A)，类似于EphA2-缺陷型PMEC中观察到的增殖水平降低(参 见图IE)。EphA2缺陷型PMTC的增殖水平降低伴随着磷酸化-Erk减少和活性GTP结合的 Ras水平降低(图4B)。未检测到EphA2蛋白在EphA2_缺陷型肿瘤细胞中的表达(图4B)。 然而，观察到在源自EphA2缺陷型动物与野生型对照的肿瘤细胞中Neu/ErbB2蛋白表达和 磷酸化水平相当(图4B)，这表明EphA2不调节ErbB2的表达或活性。在不存在配体刺激 的条件下血清饥饿的野生型PMTC中EphA2磷酸化表明ErbB2可能调节EphA2的活性(图 4B)。类似地，EphA2-缺陷型动物的全肿瘤裂解物中Erk和Ras活性显著低于来自野生型 MMTV-Neu小鼠的肿瘤(图4C)。我们还观察到，相对于分离自野生型对照的PMEC，血清饥 饿的EphA2-缺陷型PMEC中磷酸化Erk的基础水平明显较低(图11A)。此外，通过免疫组 化在EphA2缺陷型乳腺上皮中无法检测到磷酸化-Erk，而对照组织中存在细胞核和胞质染色(图11B)。相反，在我们的实验条件下，相对于野生型对照，我们没有检测到EphA2_缺陷 型细胞的磷酸化_src、磷酸化-stat5或磷酸化-PLCg水平发生任何显著变化，这表明Ras/ Erk信号传导的调节是EphA2影响Neu介导的肿瘤生长的主要机制。为了支持这一结论，相 对于表达对照b-半乳糖苷酶的细胞，在EphA2-缺陷型PMTC中过度表达外源性Erk-I能拯 救增殖缺陷(图4D)。这些数据表明，在MMTV-Neu肿瘤细胞中EphA2通过上调Erk活性促 进肿瘤细胞增殖。EphA2通过激活RhoA GTP酶促进肿瘤细胞迁移。为了仔细研究EphA2促进肿瘤转移的机制，用Transwel 1迁移试验分析MMTV-Neu 肿瘤细胞在EphA2缺陷情况下的运动能力。相对于野生型肿瘤细胞，EphA2缺陷型MMTV-Neu 肿瘤细胞在血清刺激下的迁移降低1. 5倍(图5A)。由于Rho家族小GTP酶的表达和活性 是调节细胞迁移的信号传导途径的组成部分，我们希望测定EphA2是否通过Rho依赖性机 制调节肿瘤细胞运动性。相对于野生型对照，EphA2-缺陷型肿瘤和纯化的EphA2-缺陷型 PMTC中活性GTP结合的RhoA水平较低(图5B)。EphA2_缺陷型肿瘤细胞的RhoA总蛋白表 达降低。相反，在我们的实验条件下，活化Racl的水平没有发生可检测的改变。为了确定 活化RhoA能否介导EphA2-依赖性细胞迁移，我们在EphA2-缺陷型MMTV-Neu肿瘤细胞中 组成性表达活性RhoA。虽然在EphA2-缺陷型PMTC中由表达b_半乳糖苷酶的对照腺病毒 表达对迁移无影响，但表达外源性活化RhoA能将迁移恢复至类似于野生型对照细胞的水 平(图5C)。这些发现表明，RhoA活化能促进EphA2-介导的肿瘤细胞迁移。由于Rho家族GTP酶，包括RhoA也能调节细胞周期进展(Olson等，1995 ;Welsh 等，2001)，我们也研究了有组成活性的RhoA可否拯救EphA2-缺陷型肿瘤细胞的增殖缺陷。 表达组成活性的RhoA无法拯救EphA2-缺陷型PMTC的增殖，这表明RhoA活化特异性促进 EphA2-介导的肿瘤细胞迁移，而非生长。相反，为了测定Ras/MAPK活性可否影响细胞迁移， 我们在EphA2-缺陷型肿瘤细胞中过度表达Erk-I。过度表达Erk-I后观察到EphA2_缺陷 型PMTC的迁移未发生变化，这表明在ErbB2/EphA2介导的肿瘤进展中通过独立的信号传导 途径调节增殖和运动。EphA2在物理上和功能上与ErbB2相互作用。为了研究EphA2调节Neu/ErbB2_介导的增殖和侵袭性的分子机制，进行生化研 究以评估过度表达EphA2和ErbB2的C0S7细胞中这两种蛋白之间的物理相互作用，以及 MMTV-Neu来源的原代肿瘤细胞(PMTC)中内源性蛋白之间的物理相互作用。利用过度表达 EphA2和ErbB2的人同种型的C0S7细胞的裂解物检测到，EphA2免疫沉淀物中存在ErbB2/ Neu, ErbB2/Neu免疫沉淀物中存在EphA2 (图6A)。来自PMTC的内源性蛋白质的共同沉淀 分析确认ErbB2与EphA2形成复合物(图6B)。在PMTC和C0S7细胞中，EphA2和ErbB2高 水平表达，在没有配体刺激的情况下EphA2/ErbB2发生组成性相互作用(图6C)。令人惊讶 的是，在没有配体或血清刺激的情况下，在C0S7细胞中共同表达ErbB2和EphA2足以诱导 EphA2的酪氨酸磷酸化(图6C)。同样，相对于亲代MCFlOA细胞，在过度表达人HER2/ErbB2 的MCFlOA细胞中观察到EphA2磷酸化水平升高(图6D)。与C0S7细胞中的共同表达数据 相一致的是，用ErbB2激酶抑制剂处理MCF10A. HER2细胞能降低EphA2磷酸化以及HER2磷 酸化(图6D)。鉴于ErbB2和EphA2之间物理相互作用的证据和ErbB2下游信号传导途径 的最大程度活化在功能上需要EphA2表达，这些数据表明EphA2参与ErbB2信号传导。
EphA2-缺陷对MMTV-PyV_mT转基因动物的肿瘤进展、血管新生或转移无影响为了评估EphA2在乳腺肿瘤发生(也依赖Ras/MAPK途径)的独立内源性模型中的 功能，产生野生型、杂合子或EphA2缺陷型的在MMTV启动子控制下表达多瘤病毒中间T抗 原的MMTV-PyV-mT小鼠。监测处女型雌性小鼠的肿瘤形成100天。虽然确认在MMTV-PyV_mT 模型中EphA2-缺陷丢失(图7B，D)，但EphA2-缺陷不影响肿瘤形成的速度(数据未显示)、 肿瘤体积或肺表面病损的数目，或微血管密度(图7A，C)。此外，在源自野生型与EphA2-缺 陷型小鼠的MMTV-PyV-mT肿瘤中，总Ras、活性GTP-结合的Ras、磷酸化-Erk或总Rho的水 平无差异。(图7D)。这些发现与MMTV-Neu模型中观察到的EphA2_缺陷的影响形成鲜明 对比。这些数据表明，在MMTV-PyV-mT模型中EphA2不影响肿瘤发生、进展和血管形成，与 MMTV-Neu模型中的相似途径相比，EphA2缺失也不影响对此模型肿瘤进展的这些方面有贡 献的许多信号传导途径。也评估了在分离自FVB雌性小鼠的正常乳腺组织、MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT肿瘤 组织，以及在匪TV-Neu和MMTV-PyV-mT动物的PMEC和PMTC中EphA2的表达和激活。与正 常乳腺组织相比，源自MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT模型的肿瘤组织中EphA2过度表达且被磷 酸化。而且，与正常乳腺组织相比，来自这两种模型的肿瘤裂解物中肝配蛋白-Al配体表 达升高，但在野生型和EphA2-缺陷型肿瘤裂解物中肝配蛋白-Al的水平相当(图7E，D)。 然而很显然，MMTV-Neu肿瘤中总EphA2和磷酸化EphA2的水平高于MMTV-PyV-mT肿瘤(图 7E)。检测到与PMEC相比，EphA2在PMTC肿瘤上皮中特异性过度表达(图7F)。虽然曾报道过且在我们的肿瘤裂解物中观察到MMTV-PyV-mT肿瘤中ErbB2过度表 达(Lin等，2003)，但MMTV-Neu肿瘤中ErbB2过度表达水平高得多(图7E)。这些数据表 明，EphA2表达水平提高可能是ErbB2信号传导途径在肿瘤中放大的机制。抗-EphA2治疗在MMTV-Neu模型中显示疗效为了确定MMTV-Neu肿瘤是否对体内靶向性抗_EphA2治疗有反应，将野生型Neu 肿瘤细胞植入野生型FVB接受动物经清除的脂肪垫中。移植两周后，向动物腹膜内注射对 照IgG或靶向鼠EphA2以使其降解的抗_EphA2抗体，每周两次共三周(图8A)。抗_EphA2 抗体特异性靶向EphA2，因为抗体治疗的源自MMTV-Neu和MMTV-PyV-mT动物的肿瘤细胞中 相关受体EphA4的表达不受影响(图8A)。由抗-EphA2抗体治疗动物收集的MMTV-Neu肿 瘤的体积比分离自IgG治疗小鼠的肿瘤小3倍(图8B)。此外，通过定量测定核PCNA染色， 与对照相比，抗-EphA2抗体治疗动物中肿瘤细胞增殖显著降低(图8C)。正如所料，通过免 疫组化和免疫印迹分析，与对照IgG治疗的肿瘤相比，抗_EphA2抗体治疗的肿瘤中EphA2 蛋白水平显著降低(图8D)，但抗-EphA2治疗的肿瘤中EphA2表达下调并未影响ErbB2的 表达，对照IgG治疗也不影响肿瘤中ErbB2的表达(图12A)。观察到与对照IgG治疗动物 相比，由抗_EphA2抗体治疗动物收集的肿瘤中微血管密度显著降低(图8E)。与这些结果 相反，在移植MMTV-PyV-mT肿瘤的动物中抗_EphA2治疗对肿瘤体积(图8F)或微血管密度 (图12B)没有影响，但抗_EphA2治疗的肿瘤中EphA2蛋白水平下调(图12C)。这些数据表 明，抗-EphA2抗体治疗的功效取决于发生肿瘤进展的癌基因因素，因为治疗MMTV-PyV-mT 荷瘤动物不会像治疗MMTV-Neu荷瘤小鼠那样影响肿瘤进展，但这两种动物模型中EphA2均 过度表达。然而，出于描述目的，上文已经描述了本发明的具体实施方式
，本领域技术人员应理解，可以在不背离所附权利要求书所述的本发明的情况下对细节作出许多改变。将本说明书中提及的所有发表物、专利和专利申请纳入本说明书作参考，如同专 门和单独将各篇发表物、专利或专利申请纳入本文作参考的程度一样。尽管已经出于清楚和理解的目的在一些细节中描述了本发明，但是本领域技术人 员通过阅读该说明书可以很清楚地了解，可以在不背离本发明真实范围的情况下进行各种 形式和细节的变化。例如，上述所有的技术和设备都可以以各种组合联用。本申请中提到 的所有公开出版物、专利、专利申请或文献都通过引用全文纳入本文中，相当于所述各单独 的公开出版物、专利、专利申请或文献都独立地通过引用纳入本文用于所有目的。此外，2007年6月18日提交的美国临时专利申请60/929，212通过引用全文纳入 本文。此外，Brantley-Sieders，D. M等于2008年1月发表于《临床研究期刊》(Journal of Clinical Investigation)，第118卷，第1期的题为“受体酪氨酸激酶EphA2在小鼠中 通过放大ErbB2信号传导促进乳腺腺癌肿瘤发生和转移进展”的研究论文通过引用全文纳 入本文用于所有目的。
权利要求
一种降低过度增殖细胞增殖的方法，所述方法包括a)鉴定表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞群体；和b)给予靶向EphA2的药剂。
2.一种降低表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞增殖的方法，所述方法包括给予靶向 EphA2的药剂。
3.一种降低表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞增殖的方法，所述方法包括给予抑制、 阻断或干扰EphA2与ErbB2相互作用的药剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述过度增殖细胞是癌细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌症是皮肤癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、 前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述过度增殖细胞疾病是非癌 性过度增殖细胞疾病。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述非癌性过度增殖细胞疾病是哮喘、慢性 阻塞性肺病(COPD)、牛皮癣、肺纤维化、支气管高反应性、脂溢性皮炎和囊性纤维化病、炎性 肠病、平滑肌再狭窄、内皮再狭窄、过度增殖性血管病、贝切特综合征、动脉粥样硬化或黄斑 变性。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括给予靶向ErbB2的药剂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞过度表达EphA2。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞过度表达ErbB2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞过度表达EphA2和 ErbB2。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2靶向剂是激动剂。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2靶向剂是拮抗剂。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂是 抗体。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂是 小分子。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂是肽。
17.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂是 SiRNA0
18.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂是 抗体-药物候选物(ADC)。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述EphA2或ErbB2靶向剂中 任何一种能抑制、阻断或干扰EphA2和ErbB2之间的相互作用。
20.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括(a)确定所述患者癌细胞中EphA2和ErbB2的表达水平、存在或含量；(b)如果经测定所述患者癌细胞同时表达EphA2和ErbB2，则给予抗_EphA2和/或 抗-ErbB2靶向剂。
全文摘要
本发明涉及治疗表达EphA2和ErbB2的过度增殖细胞的方法。本发明还涉及选择接受治疗的患者群体的方法。
文档编号G01N33/574GK101918844SQ200880103677
公开日2010年12月15日 申请日期2008年6月16日 优先权日2007年6月18日
发明者D·布兰特利-赛德, D·杰克逊, E·布鲁克海默, J·陈 申请人:米迪缪尼有限公司;范德比尔特大学