生物传感器的制作方法

专利名称：生物传感器的制作方法
生物传感器本发明涉及电极组件，所述电极组件具有结合了模拟生物膜的磷脂层的电极，涉及结合了这种组件的电化学生物传感器，并且涉及所述生物传感器的用途。该传感器可以 用于例如电化学分析样品以确定具有生物膜活性的物种(例如毒素)的存在(或其它)，或 用于研究物种(例如潜在药物)是否具有生物膜活性。电极上的表面层作为用于电化学询问(electrochemical interrogation)的膜 模型1已被研究了一些时间。一种方法利用了如下事实，即长链烷烃硫醇可以使用硫醇键 结合到金属表面如金或银上以形成自组装层(SAM)2。该体系被用作生物传感器，例如通过 查看在膜表面上的分析物特定结合反应3或通过研究与溶液中的感应电流物种(faradaic species)的偶联酶反应4。此途径用于传感应用的优点在于体系的稳定性。缺点在于结合 层不是流体并且不完全类似细胞膜。因为此缺点，该体系精心设计通过在束缚层上非共价 地沉积磷脂层而制备不对称的双层5。然而，所得到的模型膜体系的复杂性导致远离了对于 耐用的分析器件所需要的简单性。用于研究电极上的似表面膜的层的备选策略是表面活性 剂/磷脂膜在电极表面上的非共价沉积6_19。此途径的优点在于层是可移动的，发生作为施 加电势的函数的可逆相转变并且在极值电势(> IV)下脱附1(1’17’18。这些方法成为在双层 和生物膜的电穿孔19中涉及的机理的基础。在此方面相关的是GB-A-2 193 326 (自然环境研究学会(NaturalEnvironment Research Council))，其公开了一种基于悬汞滴电极(HDME)的使用的生物传感器，其中为 了用电极进行测量的目的，每一个连续的汞滴形成有磷脂层。更具体地，HMDE (其在还包含 辅助电极和参比电极的电化学池中起到工作电极的作用)具有毛细管尖端(在这里可以形 成连续的汞滴)，它可相反地移入电解质液体中和从电解质液体中移出，所述电解质液体在 其表面上具有磷脂(例如，二油酰卵磷脂或蛋黄卵磷脂(egg lecithin))的膜。要通过生 物传感器研究的物种包含在电解质液体中。在一个操作循环中，当尖端在液体中并且在脂 质膜下方时，在尖端处形成汞滴。然后尖端向上通过膜取出，然后向下回到液体中。以此方 式，在汞滴的表面上形成脂质膜，其具有与一半的生物膜非常类似的结构和性质。然后可以 通过快速循环伏安法使用处于快速变化速率(ramp rate)(例如40V s—1)的锯齿波形，通 过监测浸入电解质液体中的汞电极上的磷脂层进行研究溶液中物种的测量。在低的电压， 所得到的电流与电极表面的电容成比例，在高的电压，电容显示尖峰，表示对应于其流动性 的磷脂层的相变，并且(考虑到电解质液体不含有任何生物膜活性组分)非常体现纯磷脂 的特征。对于二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)在伴随的图6a(参见以下)中显示这些峰。然而， 具有生物膜活性的物种的存在改变流动性并且影响相变，因而影响峰的形式。因而生物传 感器可以用于检测样品中生物膜活性组分的存在。检测极限取决于样品中特定化合物的本 性，但是对于一些聚芳族化合物为在水中Ippb左右。非共价地沉积在液态汞上的磷脂单层的体系由于流体磷脂与液态汞的相容性因 而代表独特且生物相关的情况。由此性质显现三种特征(i)代表水的进入和随后取向变化的相转变是尖锐的并且由循环伏安法和交流伏 安法曲线中的不同电容峰表现9。
(ii)汞上的磷脂层对于与以选择性方式改变层的结构和流动性或组织的生物膜 活性物种的相互作用敏感。相互作用影响相转变的本性和层的阻抗性质14。这些相互作用 不同于通常用于膜基生物传感器中的那些，它们依赖于分析物物种和连接到膜或单层/双 层上的部分之间的结合反应16。最近我们显示了磷脂-Hg体系还可以用于筛选溶液中的肽，并且其选择性地响应 短肽的官能性14。最初研究了层与短杆菌肽衍生物之间的相互作用"’12，随后的研究着眼于 通过抗微生物肽改变单层体系21’22，最后研究了短链十一残基β “折叠自组装肽的结构和 单层活性之间的关系14。就一切情况而论，相互作用非常接近地反映肽的生物膜活性。除了以上讨论的显著优点，磷脂/悬Hg滴电极(HMDE)体系具有许多显著缺点。特 别是HMDE易碎因而HMDE体系最适于用于实验室中，从而限制了“在现场(in the field)” 的应用。另外，HMDE需要使用较大量的液态Hg，应当考虑作为结果的毒性因素。此外，HMDE 仅能困难地成像24。因而本发明的目的是排除或减轻上述缺点。根据本发明的第一方面，提供一种电极组件，所述电极组件包括至少一个工作电 极，所述工作电极包括导电载体基底，所述导电载体基底的表面包覆有固定在所述基底的 表面上的汞，其中远离所述金属(metal)的汞的表面包覆有磷脂层。根据本发明的第二方面，提供一种生物传感器，其包括(i)如关于本发明的第一方面所定义的电极组件，(ii)至少一个用于所述工作电极的对电极，(iii)参比电极，(iv)用于向所述至少一个工作电极施加周期变化电压的装置，和(ν)用于确定相对于所述对电极的磷脂的微分电容(differentialcapacitance) 变化的装置。因此，在本发明的第一方面的电极组件中，工作电极包括固定在导电基底上的 金属(液态)汞(其上设置磷脂层)。包括沉积在导电基底上的金属汞的电极是本领域 已知的，并且通常称为“薄膜汞电极”而有时称为“汞齐电极”。因此，例如，铱上汞电极 (mercury-on-iridium electrodes)是己知的并且公开于例如US-A—5 378 343 (Kounaves) 中。此现有说明公开了一种电极组件形式，其包括安置在基底上的超微电极的阵列，每一个 超微电极包括铱上汞。在US-A-5 378 343中公开的电极是为了用于通过阳极溶出伏安法 的手段检测水中的各种重金属而提出的，其中，最初，向汞施加负电势，使得溶液中的金属 离子电化学还原并且集中到汞中，随后，在正向上缓慢扫描施加的电势，这产生在每一种金 属的氧化电势处与其浓度成比例的峰值电流。然而，在US-A-5 378 343中没有为了研究具 有生物膜活性的物种的目的用磷脂包覆汞的公开内容。根据本发明的第一方面的电极组件具有许多优点。具体地，电极组件坚固(与悬 汞滴电极的略微易碎的本性相反)，因而允许结合了这种电极组件的生物传感器具有许多 在实验室外的用途。固定的磷脂层可以产生比悬滴汞电极体系更尖锐的峰，峰越尖锐越有 利于分析目的。另外，与悬滴汞电极相比，电极所需的汞的量可以显著减少，从而显著降低 毒性。此外，存在关于取决于边缘与表面积的比率的磷脂层的稳定性的优点(与悬汞滴电 极相比)。在根据本发明的电极组件的情况下，工作电极的边缘与表面积的比率可以远大于在汞滴的情况下，从而表面上磷脂层的稳定性更高。在这方面，本发明人显示(参见下面的实施例6)，可以通过循环伏安法对根据本发明的电极组件(即具有沉积在汞覆层上的磷 脂)进行反复询问并且在很长时间内产生可重现的结果。此外，可以将磷脂层从汞覆层清 除，并且包覆新鲜的层。在一系列测试中(还参见下面的实施例6)，本发明人证实了(对于 特定的包括具有汞覆层的传导基底的复合电极)依次沉积的磷脂层提供在通过循环伏安 法询问层所得到的结果方面的高度再现性。方便地，从汞表面清除磷脂可以通过在阴极方向上扫描工作电极(例如在(-0. 2V 至-2. 625V)的范围内097VS-1)进行，其中电极浸入电解液中以便使任何污染有机物质脱附 到本体溶液中。令人惊讶地，本发明人发现类似的扫描条件当施加比用于清洁短得多的时 间时，可以用于在汞膜上沉积磷脂层。为了此沉积的目的，电极将被浸入到结合了要沉积的 磷脂的电解液中。可以以分散体的形式将磷脂加入水性电解液中，所述分散体通过将磷脂 在水性介质中搅动(例如使用超声)制备。在沉积程序的过程中，可以通过循环伏安法监测 汞电极，并且层的沉积可以通过循环伏安图中磷脂的径迹(trace)特征的显现来检测。在 此径迹显现的情况下，沉积程序完成。根据本发明的电极组件提供与由现有技术的悬汞滴电极得到的结果非常类似的 结果。因此，HMDE广泛记录的数据中的许多可以应用于根据本发明的电极组件。然而，与 HMDE相反，复合电极(即电极包括导电基底和汞覆层)的汞表面可以在下面步骤(i)至 (iii)的重复循环中再次使用(i)沉积新鲜的磷脂层；(ii)对样品进行测量；和(iii)清洁电极以移除“用过的”磷脂。因此，不需要为每一次测量再生汞覆层，对照HMDE，其为每一次连续测量原位产生汞滴。值得注意地，本发明人证实了汞层(即使其处于固定在表面上的液体的形式)具 有足够的对在其上沉积的导电基底的附着力，从而允许将电极组件用于本文中更全面描述 的流动池中。与上述特征组合，这样的流动池可以在包括下列各项的重复的一系列步骤中 运行(i)将磷脂沉积到汞覆层上(其中电解液流过所述池)；(ii)对通过所述池的样品进行测量；和(iii)将磷脂层从汞覆层清除。应当理解，这种流动池的运行可以容易地自动化，并且提供非常方便的测量技术。根据本发明的电极组件方便地设置在也结合了工作电极和参比电极的“芯片 (chip) ”组件上。这样的芯片组件突出地适用于上述流动池中。因而本发明的实施方案能 够提供功能上适用于在线测量目的的“芯片上实验室(lab-on-a-chip) ”。用于在本发明中使用的导电基底(即在其上沉积汞的基底)优选具有小于1欧姆 米、更优选小于1X 10_2欧姆米并且理想地小于1X 10_3欧姆米的电阻率。载体基底可以为选自由铱、钼、钯和钽组成的组的金属，它们被选作“载体”的原 因在于它们的难熔惰性性质和它们在汞中的低溶解度，还因为汞可以沉积在这样的金属上 (例如通过电沉积)以提供均勻的膜。平滑的汞表面允许无缺陷的磷脂层的形成。可以用于本发明中的其它导电载体基底为碳，例如以石墨或玻璃化炭黑的形式。铱是用于根据本发明使用的合适载体金属，原因在于其在汞中的低溶解度，还因 为金属的功函与汞的功函之间的差别较高，从而确保汞在金属上的最大润湿性。例如(并且不希望受理论所限)本发明人相信，钼具有特别合适的对于汞的溶解 度，从而允许“汞齐样”接合点的制备，其较牢固地将汞保持在钼上，同时为汞提供良好的表 面以允许磷脂沉积，并且提供良好的膜活性。另外，在“芯片”(例如基于硅晶片)上的根据 本发明的电极组件的构造中，钼作为导电载体基底的使用允许将参比电极容易地结合到同 一芯片上。本发明的第二方面的生物传感器通过监测脂质层特别是其由于具有生物膜活性 的物种在研究样品中的存在的改变而起作用。以与在GB-B 2 193326中公开的方式类似 的方式，测量通过循环伏安法进行，以确定作为相对于参比电极的电压的函数的磷脂的微 分电容的变化。最优选地，测量通过快速循环伏安法，优选使用变化速率> lVs—1(例如 40-100VS—1)的锯齿波形。在快速循环伏安法中使用的电压偏移可以为相对于Ag/AgCl 3. 5M KCl的-0.4V至-1.2V。如下列等式所示，输出电流(i)与微分电容(Cd)成比例Cd = i/(vXA)，其中A为电极面积而ν为变化速率。用于RCV的试验设置包括使用向电势恒定器输入的函数发生器施加锯齿波形，所 述电势恒定器向工作电极施加波形。所得到的电流响应经由采集板记录并且相对于施加的 波形绘制。DC循环伏安法提供在对于磷脂单层的结构和环境特定的限定的电势窗口中对层 的电容的快速估计。备选地，测量可以通过交流伏安法进行，其使用例如约5mV s—1的电压变化，频率f 约75赫兹的叠加正弦电压，和约0.005V的振幅ΔΕ。将输出交流电流分成同相和异相分 量。如下列等式所表达，异相电流(i")与微分电容(Cd)成比例Cd = i " /(2 π XfX Δ EXA)用于交流循环伏安法的试验设置包括向上述电压变化增加正弦波形并且输入到 向工作电极施加所得到的波形的电势恒定器。交流电流响应传送到锁定放大器，在所述 锁定放大器，将与施加的电流的交流波形同相和异相的分量分离并且在数据采集系统上记 录。将异相电流相对于变化电压绘制。本发明的第一方面的电极组件可以包含单个工作电极，但是更优选包含多个工作 电极。对于工作电极或每一个工作电极，应当没有暴露的自由的导电载体基底表面。这确 保通过由汞层提供的大的氢过电势，防止与在循环伏安法测量过程中在工作电极与水性介 质接触的情况下经由水还原产生氢气相关的不稳定性问题。工作电极可以例如为圆形和/或具有在任何方向上为2μπι至Imm的最大表面尺 寸，但不能排除在此范围之外的尺寸。下面描述的实施例采用直径为约960μπι的圆形电 极。备选地，工作电极可以为微电极并且优选定尺寸为使得汞具有在任何方向上为2 μ m至 10 μ m的最大表面尺寸。工作电极或每一个工作电极可以例如为直径2 μ m至10 μ m的圆 形。这样的尺寸起到最大化边缘比面积(edge-to area)的作用，从而提高磷脂层的稳定性。优选地，电极组件包括选自由钼、钯、钽和铱组成的组的导电载体基底的层，所述 层夹在第一和第二绝缘基底层(优选二氧化硅)之间，所述绝缘基底层中的一个(“第一”基底层)被至少一个贯穿孔穿透，其实际上限定所述载体金属为其提供底表面的井(well)， 该井结合了汞覆层(对于所述载体金属)，在所述汞覆层上设置磷脂层，从而形成所述工作 电极。在微电极的情况下，井或每一个井可以例如为圆形，并且具有在2 μ m至10 μ m的范围 内的选定直径，并且(考虑到汞层为半球形)可以具有从而对应于壁厚的约Iym的深度。 汞层及其磷脂覆层应当占据井的整个横截面(因而没有载体基底暴露)。在井的 底表面处载体基底的此完全覆盖抑制在伏安法测量过程中通过载体基底的水还原。还理 想的是，汞层及其磷脂覆层的构造使得磷脂覆层具有与第一绝缘基底层的表面齐平的平表 面。根据本发明的优选微电极阵列包括多个在第一绝缘体层中形成的所述井，在每一 个所述井的底部的载体基底包覆有汞，所述汞又设置有脂质层。这样的微电极阵列因而包 括设置在绝缘基底之间的载体金属层，所述载体金属层具有为各个井提供各自的底表面的 载体基底部分。方便地，电极组件可以结合被夹在第二绝缘基底和载体金属层之间的传导层(例 如金)，所述传导层与所述载体金属层处于电传导关系，从而改善器件的传导性。根据本发明的微电极阵列可以结合除“载体金属上汞(mercury-on-carrier metal)”电极以外的电极。因此，例如，阵列可以结合设置在第一绝缘基底的外表面上的参 比电极(例如Ag/AgCl) /伪-参比(例如Pt)和/或对电极(例如Pt)。根据本发明的优选的微电极阵列包括⑴第一和第二绝缘层，(ii)选自由钼、钯、钽和铱组成的组的载体金属的层，其设置在所述绝缘层之间，(iii)多个井，所述井形成在第一层中，使得载体金属层为井提供各自的底表面， 所述不连续部分各自形成工作电极的一部分，所述工作电极包括所述不连续部分、其汞覆 层和汞表面上的磷脂层，(iv)任选地，传导层，其设置在所述载体金属层与第二基底之间并且与其处于电 传导关系，(ν)对电极，其设置在第一绝缘层上，和(vi)参比电极，其设置在第一绝缘层上。第一绝缘层可以为例如二氧化硅或氮化硅。第二绝缘可以为二氧化硅并且可以形成在硅晶片上。在根据本发明的优选微电极阵列中，载体金属为钼，其除了提供汞在其上沉积的 表面以外，还起到提供将本发明的电极与设置在阵列上的电接触装置连接的传导径迹的作 用。在此实施方案中，可以省略分开的传导层(iv)。优选地，井为圆形，例如直径为2-ΙΟμπι，但可以使用在此范围以外的直径，参比电 极为Ag/AgCl和/或对电极为钼。由以上定义的(i)-(vi)构成的微电极阵列能够提供适用于在线使用的所谓的 “芯片上实验室”功能。根据本发明的电极组件可以用于静态池或流动池中。这样的流动池可以包括其中 工作电极被暴露的“测量池”(例如以室的形式)。流动池还包括与“测量池”连通的入口和 出口通道。在流动池的使用中，电解液和分析物经由一个或多个入口通道供给到“测量池”，它们在那里在工作电极上流过，然后通过一个或多个出口通道流出。在“测量池”中可以有多于一种类型的工作电极(本发明的)，各种电极区别在于在汞表面上沉积的具体磷脂。流 动池的每一个电极可以连接(例如通过合适的机械或电子开关装置)电势恒定器，使得可 以个别地访问(addressed)每一个工作电极。因此，可以对于各种不同磷脂得到个别的结 果。备选地，可以记录来自各种电极组件(具有它们的不同磷脂)的组合信号。以这些方式， 可以确定同一分析物对多种不同磷脂的影响并且提供该分析物的“指纹(fingerprint) ”。作为汞表面上的层提供的磷脂可以是饱和的或可以具有一定程度的不饱 和。合适的磷脂的实例包括二肉豆蔻酰，磷脂酰胆碱(DMPC-饱和的)、二油酰磷脂酰 (phosphhtidyl)胆碱(D0PC-不饱和的)和蛋黄卵磷脂(蛋PC-饱和的/不饱和的)。这 样的脂质结合胆碱-基头基，并且可以使用结合了此头基的其它脂质。然而，头基可以为胺 基如在二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)中，或羟基如在1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸(乙 二醇)(钠盐)中，或含有化学官能团的组合如在1，2- 二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇 胺-N-(琥珀酰)(钠盐)中。这些官能团可以存在于‘天然’脂质中或可以是合成的以给 予所需化学表面。作为均相单层存在或作为非均相单层的一部分存在的每一种脂质给予该 层独特的性质，其可以通过询问电势窗口由层电容观察。可以使用磷脂头基的改性，并且它 在传感器的操作中是重要的，因为这是直接为电解液提供的官能化表面。层性质可以通过 改变碳链的长度和它们的饱和度或通过头基的改性来调节。更具体地，具有两个9-顺式_十八碳烯酸链的磷脂在室温是流体，并且能够在汞 上形成不可渗透的单层。它们在通过快速循环伏安法询问的电势范围内显示出尖锐的假电 容相变。通过比较，二肉豆蔻酰脂质(结合了 C14饱和链)对于氧化具有比二油酰脂质较不 敏感的优点但是显示出较不显著的相转变。如果需要，磷脂层可以与另外的组分缔合以改变层的性质。这些组分可以结合在 层中或共价地固定在层上，实例包括肽(以形成离子通道)、低聚核苷酸或补充靶分子的分 子。根据本发明的微电极阵列可以通过下列方法制备在沉积另外的绝缘层(上述第 一层)之前，将任选的传导层(例如金)和载体金属层依次沉积到绝缘基底(其最终提供 上述第二绝缘基底)上(例如均通过E-束蒸发)以覆盖载体金属。第二绝缘层可以例如 为具有SiO2表面层的硅晶片。任选的传导层(例如金)和载体金属层的沉积可以例如为 E-束蒸发。如果需要，可以将钛粘附层沉积在(i)第二基底和传导层之间，(ii)传导层和 载体金属层之间，和(iii)载体金属层上。第一绝缘层可以为例如SiO2或氮化硅并且通过 低温等离子体增强化学气相沉积(PECVD)沉积。随后，第一绝缘层可以被蚀刻贯穿到达载 体金属，使得形成上述井，并且为井的底表面提供铱层。如果需要，在将汞沉积在载体金属上的制备程序的下一步骤之前，参比和/或对 电极可以形成在第一层上。汞层可以通过电沉积形成。沉积的汞的量应当足以在导电载体基底上提供汞的连 续膜。增加汞层的厚度将提高该层的稳定性并且允许重复汞层以允许重复的磷脂层沉积、 样品测量和磷脂层移除的循环，因而一个电极可以在不破坏汞的情况下使用多次。此外，汞 层的厚度对于电极组件在流动池中的使用是一个考虑因素，在流动池中汞层需要承受与流 过池的液体相关的力。电沉积工艺所需的电荷的量取决于所需的汞层的厚度，而这进一步取决于诸如导电基底(汞将电沉积到其上)的表面积和汞沉积电解液中的汞离子浓度的因 素。通过实施例，实施例4在特定的沉积电解液中汞浓度下使用1库仑的电荷将令人满意 的汞层沉积到直径960 μ m的圆形钼基底上。下面的实施例7 (示出流动池的使用)采用通 过使用2库仑的电荷将汞沉积到直径960 μ nm的圆形钼基底上所形成的电极。对于相同的 溶液浓度，较小直径的钼基底需要较少量的电荷。对于较大直径的基底情况是相反的。从含有Hg2+离子(例如由Hg(NO3)2提供)的溶液的汞的控制电沉积可以在电化学 池中进行。汞沉积电解液可以含有防止Hg物种氧化的HC104。然而，脂质询问将不在此酸 性溶液中进行而是在更温和的电解液如0. IMKCl中进行。备选地，汞的电沉积可以通过将 一滴基本电解液(baseelectrolyte)(例如HC104+Hg(II))移取到第一绝缘体的表面上而 进行。电沉积可以通过下列方法促进向沉积溶液中的工作电极表面施加相对于3. 5M KCl Ag/AgCl的 0. 4V的电势并且记录与沉积的汞的质量直接成比例的通过的电荷，沉积可以 通过 断开电路而停止。这允许精确控制沉积的Hg的量。一旦汞层被沉积，就可以将组件转移到中性电解液如0. IM KCl中，并且通过施加 < "2V的极值负电势来电化学地清洁电极表面，这释放氢气来‘擦洗(scrub)，没有有机物 的表面。随后可以将磷脂沉积在汞上。这可以通过许多方法进行，例如(a)沉积可以如之前使用HMDE所完成的进行，即通过将磷脂从作为液体上的膜提 供的过量磷脂转移到阵列上。通过溶液气体界面的垂直和水平插入均可以进行。此程序导 致作为汞表面上单层的磷脂的形成。(b)控制沉积可以在郎缪尔布洛尔杰特(Langmuir Blodgett)槽中通过将阵列垂 直插入通过在溶液气体界面处具有精确覆盖率的磷脂单层而进行。通过用在气体_溶液界 面处的磷脂覆盖率校准磷脂层的性质得到控制沉积的优点。如(a)的情况，在汞表面上形 成磷脂的单层。(c)通过在将阵列浸入含有感兴趣的磷脂的浓缩戊烷溶液中以后，允许溶液蒸发， 可以将磷脂层沉积到阵列表面上。然后可以通过将阵列淹没在水性电解液如0. IM KCl中 并且快速从-0. 2至-1. 2V连续循环电势使层均化。此方法通过经过施加快速电势变化促 进自组装而提供磷脂单层的形成，所述自组装导致表面上的磷脂连续自身重排成最低能量 构造(即在接近汞的零电荷电势(PZC)的相对于3. 5M KCl Ag/AgCl的-0. 4V的单层)。(d)可以将一滴磷脂在硅晶片上蒸发。当不含溶剂时，将晶片转移至电化学池中。 在此情况下，通过使用RCV的连续扫描在电极阵列上得到单层。这允许磷脂退火成单层。(e)可以允许囊泡或磷脂分散体在流动池内流动的过程中吸附。如(d)的情况，通 过使用RCV在磷脂溶液在电极阵列上流过的同时连续扫描得到单层。使用上述沉积方法，可以使用RCV、ACV评价表面上的磷脂的构造，并且与原子力 显微镜(AFM)研究一起评价阻抗。在RCV和ACV中，对应于磷脂相转变的两种电容峰的特征 决定电极上的磷脂层的构造和覆盖率2°。可以检查沉积的磷脂的伏安图以检测代表磷脂相 转变的伏安峰(voltammometric peak)是否受电极尺寸的影响。实际上，不饱和的(例如 D0PC)、饱和的(例如DMPC)和饱和的/不饱和的(例如蛋黄卵磷脂(蛋PC))磷脂都可以 测试，以评价它们在空气存在下的稳定性。磷脂层可以在相对于3. 5M KCl Ag/AgCl的-2. 0 的极值电势通过脱附从电极表面移除。用此方法常规地清洁汞表面。
本发明的生物传感器可以用于例如确定(i)已知具有生物膜活性的物种在样品 中的存在或其它情况或(ii)特定的物质是否具有生物膜活性。测量可以通过伏安法进行 (例如快速循环伏安法或交流伏安法以常规方式进行，例如按照在GB-A-2 193 326中公开 的线路(参见例如其实施例1)。RCV用于传感器表面的快速询问，并且特别用于确定对相 互作用特别敏感的磷脂的两种电容的相互作用的效果。通常，确定程序包括水性电解质液体，电化学池中的电极组件将浸入在其中，如果 需要，可以向液体中加入电解质(例如KCl)。然而，还预想为了测量的目的而无需将组件在 电化学池中定位，可以向电极组件施加一滴或多滴电解质液体。在此情况下，必要的是使用 在空气存在下稳定的磷脂。饱和的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)显示为适于此并且还显 示了可用于分析应用的电势诱导相转变。也在本发明的范围内的是对于存在于气体或蒸气 样品中的具有生物膜活性的物种的气体或蒸气样品的分析。在此情况下，必要的是将电解 质液体设置在工作电极上。本发明在许多领域具有应用。这些包括(a)对于可能为有毒试剂的生物膜活性化合物的存在的饮用水常规检测；(b)对于潜在药物产品的生物膜活性的潜在药物产品检测；(c)有毒气体和爆炸性蒸气的检测，所述有毒气体和爆炸性蒸气(条件是它们与 单层表面相互作用)可以使用多变量分析途径根据与各种化学官能性的单层的相互作用 的强度诊断；和(d)环境应用，例如对于生物膜活性化合物的天然和海洋水的原位分析，所述生物 膜活性化合物例如(i)由蓝细菌和沟鞭藻类的繁盛(blooms)产生的有毒生物膜活性肽，或 ( )污染物。应当理解，该体系可以用已知改变电极上的磷脂层的结构的一系列化合物例如多 环芳族烃7、吩噻嗪药物8和抗微生物肽23对传感器应用进行校准。在每一种情况下，磷脂 层的破坏/改变被良好地电化学表征。在微电极阵列的情况下，各个工作电极可以结合磷脂，所述磷脂在以特定但不同 的方式响应于靶分析物的脂质头基的官能性方面变化。靶分析物的化学本性可以通过与阵 列单层表面提供的官能团的相互作用大小的多变量分析仔细分析(dissected)。具有两个 9_顺式-十八碳烯酸链的磷脂为18个碳原子长，是不饱和的，并且在室温为流体，能够在汞 上形成可半渗透的单层。它们在通过快速CV询问的电势区域内显示出尖锐的假电容相转 变。还有兴趣的是具有14个碳原子饱和链的二肉豆蔻酰脂质，其具有对于氧化比二油酰脂 质较不敏感的优点，但是显示出较不显著的相转变。传感器可以采用这些具有变化的官能 头基的脂质的组合，因而每一个阵列具有单一的均相的磷脂群体，其提供分析物可以与其 相互作用的官能化的表面。起到对相互作用的转换器(transducer)的作用的磷脂允许进 一步结合选择性要素(elements)，其为基于肽的，如免疫球蛋白、低聚核苷酸或对于结合在 层中或共价地固定到层上的靶分子的补充分子。通过实施例仅参照附图进一步描述本发明，在附图中

图1是根据本发明的电极组件的一个实施方案的示意性横截面(至放大许多的比 例)；图2是根据本发明的电极组件的制备的中间结构的透视图3(a)_(i)示出在图2显示其中间结构的类型的微电极阵列的制备中的步骤；图4示出根据本发明的微电极阵列的另一个实施方案；图5示意性示出结合了图4的微电极阵列的测量系统的主要组件；图6展示实施例1的结果，更具体地，与现有技术的悬滴汞电极 布置的结果相比的 根据本发明的生物传感器的试验结果；图7展示实施例2的结果，更具体地，根据本发明的微电极阵列的试验结果；图8是根据本发明的电极组件的另一个实施方案的示意性横截面(至放大许多的 比例)；图9是根据本发明的电极组件的另一个实施方案的示意性透视图(至放大许多的 比例)；图10(a)_(c)分别是根据本发明的流动池的一个实施方案的示意性截面视图、端 视图和俯视图(至放大许多的比例)；图11(a)和11(b)是对于具有汞覆层的包含钼的复合电极得到的循环伏安法扫 描；图13是对于悬汞滴电极的循环伏安法扫描；图14示出各种磷脂的化学式；图15(a)_(e)是结合了图14中所示磷脂的根据本发明的电极组件的比电容曲 线.
一入 ， 图16 (a) - (c)是显示如实施例6中进行的根据本发明的电极组件的稳定性的比电 容曲线；图17和18示出使用根据实施例7的程序的流动池得到的结果；图19 (a)和(b)是如按照实施例8的程序得到的对于悬汞滴电极和Pt/Hg电极的 比电容曲线；图20 (a)和(b)显示各自比较均结合了 DOPC的单层膜的HMDE电极和根据本发明 的电极的正向扫描和反向扫描；和图21至28示出分别在实施例10至17中得到的结果，其中每一个比较HMDE和根 据本发明的电极组件对于特定分析物和/或其量的分析所得到的结果。首先参照图1，根据本发明的电极组件1包括工作电极2，其包括具有汞的表面覆 层4的铱层3的组合，在所述汞的表面覆层4上沉积有磷脂单层5。如图1中所示，汞层4位于形成在上部二氧化硅层6中的井结构(铱层3为其提供 底表面)中，所述井为圆形，其选择的直径在2 μ m至10 μ m的范围内并且其深度为0. 5 μ m。 汞占据井结构的整个横截面，从而没有暴露的自由的铱。示出的电极组件的另外的主要特征是具有二氧化硅表面的下部硅基底7和与铱 层3为电传导关系的金传导层8。在硅/ 二氧化硅层7与金层8之间设置钛粘附层9，并且 分别设置类似的粘附层10和11(i)在铱层3和金层8之间，和(ii)在铱层3和上部绝缘层6之间。现在参照图2，其为基于图1中所示结构微电极阵列但为了清晰目的省略钛粘附 层9-11并且将井结构(在图2中表示为12)显示为“空”(即没有汞层4及其结合的磷脂单层5)的透视图。然而，图2也没有示出设置在上部绝缘层6上的圆形和部分圆形的参比 电极13，每个电极13的半径为50 μ m并且每个的中心为各个井12。
图3示出用于制备图2中示出的类型的电极组件的逐步程序。示出的程序以具有90nm 3丨02表面层的IOcmXlOcm硅晶片(例如可得自IDB Technologies)开始。这提供对于图1和2中示出的结构的层7。然后连续将下列各项沉积到SiO2表面层上(a)钛粘附层9(30nm)，(b)金导电层 8 (IOOnm)，(c)钛粘附层10 (30nm)，(d)铱层3 (30nm)和(e)钛粘附层ll(30nm)。这些层都 可以通过E-束蒸发沉积。应当指出，在此阶段，钛粘附层11作为连续层沉积。所得到的结 构显示于图3a中。在方法的下一步骤中，通过低温等离子体增强化学气相沉积(PECVD)将500nm SiO2层沉积在钛粘附层11上以提供层6 (但在此阶段没有在其中形成的井12)。此阶段的 产品显示于图3b中。对于方法的下一步骤，将正性抗蚀剂材料旋涂到SiO2层6上，然后在150°C烘烤并 且在氯苯中洗涤以提供由标记14(参见图3c)示出的“硬化的”表面抗蚀剂层。将结合了用于银环13的图案的掩模15放置在抗蚀剂层14上，然后使用光/E-束 平版印刷术将抗蚀剂层14图案化(图3(d))。现在移除掩模15，并且接着将抗蚀剂层14向下化学蚀刻至SiO2层6(图3e)。在图3(f)中示出的步骤中，将IOOnm银层16蒸发到抗蚀剂层14的表面上，但是 更重要地，还在其中限定的圆圈和弧的图案的通道中。随后将抗蚀剂层14移除以留下如图3(g)中所示的结构，其中上表面具有圆形和 部分圆形的径迹17。尽管没有在图中示出，程序通常可以沿对于图3(c)_(f)描述的线路重复以在二 氧化硅层6上提供钼对电极。现在将能够承受等离子蚀刻的另一抗蚀剂层18施加于二氧化硅层6 (并且覆盖银 径迹17)并且等离子蚀刻以形成圆形孔19的图案，其暴露铱层(图3(h)。换言之，蚀刻贯 穿SiO2层6并且还贯穿钛粘附层11。如果需要，可以在此阶段在孔19的底部向暴露的铱表面沉积IOnm金润湿层。抗蚀剂层18的移除产生图3 (i)中所示的结构，其中形成了井12 (对应于图2中 的那些)。银径迹12可以在富氯化物溶液(chloride rich solution)中被阳极化，以制备 具有快速动力学和稳定参比电势的稳定的Ag/Ag/Cl参比电极。汞层4(参照图1描述)可以电沉积(如上所述)到在井的底部暴露的铱层3的 那些部分。随后可以再次使用如上所述的技术沉积磷脂层。图4示出根据本发明的微电极阵列的一个具体实施方案。示出的电极组件100包括以如以上参照图3更全面描述的方法制备的10X10的 工作电极阵列101，并且因而包括在汞表面上具有磷脂层的汞包覆的铱，电极101与传导径 迹102连接。组件还包括与传导径迹103连接的Ag/Ag/Cl参比电极(没有单独提及但类似于 图2中所示)。还设置与传导径迹105连接的钼电极104。
传导径迹102、103和105与各个金接触垫106、107和108连接，以各自连接到电
子控制/测量系统，例如在图5中示意性显示的。尽管特别参照铱作为载体金属描述了传感器的结构，但是应当理解，相同的构造 原理可以用于可以根据本发明使用的其它载体金属(即，钯、钼和钽)。参照图8，其为在其上可以沉积磷脂层的复合Pt/Hg电极组件200的按放大许多的 比例的示意性横截面视图。电极组件200包括其上沉积碳化硅的层202 (例如厚度为500nm)的硅晶片201。 在氮化硅中形成至少一个井，在其底部上为钛粘附层203 (例如30nm)，其上沉积IOOnm厚的 钼层204。填充井的是设置在其上表面上的具有磷脂单层206的汞层205 (如图8中所见)。 图8中的标记207表示电解质溶液，使用中的电极将浸入其中。尽管没有在图8中示出，钼 层204与用于连接到电势恒定器的导电径迹相连。图9示出根据在以上图8中显示的一般原理构造并且参照以上图8描述的电极组 件 300。电极组件300基本上是矩形并且朝向其一个末端形成两个工作电极301和302，其 各自在氮化硅层303的井中。朝向电极组件301的相反末端是两个接触垫304和305。电 极301通过导电径迹306连接到接触垫304，而电极302通过导电径迹307连接到接触垫 305。现在参照图10(a)_(c)，其示出了为了证明原理的目的”而构造的(参见下面的实 施例7)并且结合了参照图9描述的类型的电极组件300的流动池400的一个实施方案的 示例性示意图。10 (a)-(c)的示意图分别示出流动池400的侧视图、端视图和俯视图，将看到该流 动池400(特别从图10(a)和(b))包括均以下面更全面地描述的方式形成的底部部分401 和顶部部分402。底部部分401的上表面形成有凹部(rebate)使得电极组件300可以安置在其中， 从而其末端具有从流动池伸出的接触垫304和305(特别参见图10(b))。从图10(b)应当 理解，在电极组件300的示出的位置中，电极301和302以及接触垫304和305是最上的。上部部分402的下表面具有中心凹口其(上部部分401和下部部分402以图10(a) 中示出的方式组装到一起)形成电极301和302对着的“测量池” 403。(如图(a)中看到 的，从测量池403通往左边的是电解液进入通道404，而通往右边的是电解液出口通道405。 与电解液入口通道404连通的是用于待分析样品的注射口 406，而从电解液入口通道404 引导的是钻孔407和408，一个用于结合Ag/AgCl参比电极，而另一个用于结合与电机组件 401分离的Pt辅助电极(均未显示)。在流动池400的上部部分402的下表面中形成环形槽并且接收密封0_环409。尽管没有在附图中示出，设置螺丝孔用于容纳螺丝以将上部部分和下部部分41 和42组装到一起。电极301和302中的每一个可以具有沉积在其中的不同磷脂。为了测量目的，将工作电极301和302以及辅助和参比电极以图5中示出的方式 连接到电势恒定器。布置使得电极301和302可以个别地访问。在流动池的使用中，电解液进入入口 404并且可以流动通过“测量井” 403然后通过出口通道405。可以将要分析的样品注射到部分406中。然后可以进行样品对电极301和302上的不同磷脂的影响的单独测量。通过下列非限制性实施例示出本发明。实施例1为了建立原理的证明，将汞电沉积在被作为绝缘体的玻璃围绕的Ir圆盘上。用去 离子水洗涤电极，然后通过将汞包覆的电极穿过在电解液-气体界面处的二油酰磷脂酰胆 碱(DOPC)在戊烷中的溶液的膜而在汞层上沉积磷脂。随后将戊烷挥发，以在汞表面上留下 DOPC。通过快速循环伏安法(RCV)在80V s—1监测磷脂层。在悬滴汞电极(现有技术)上使用DOPC进行比较试验。结果显示在图6(a)中，其中较轻的径迹显示汞包覆铱电极的结果，而较深的径迹 用于HMDE电极。从图6(a)看到，两种径迹基本上相同并且均显示了特征峰(1和2)。图6(b)显示在100V s—1扫描的汞包覆的铱电极的结果。再次可以清楚地看到两 个特征峰(1和2)。结果显示汞包覆的电极在快速扫描速率下显示了较尖锐的伏安峰(voltammetric peaks) 0此发现表明相转变的发生是电极尺寸的函数。较尖锐的伏安峰更适于分析目的并 且有利于微电极作为磷脂的载体(support)。本发明已经显示，磷脂从微电极表面的移除可 以通过施加相对于Ag/AgCl的-3. OV极端电势来实现。在图6(a)和(b)中在RCV中显示 的伏安峰可以用于许多在非常低的(毫微至ymol dm-3)水平溶解的有机物种的选择性分 析识别。这些结果显示可以将稳定的有序磷脂层沉积到Hg/Ir微电极上。实施例2将汞电沉积在紧密堆积的1800个钼微电极的六边形阵列上(在2mm直径的Pt基 体上)，微电极尺寸为ΙΟμπι直径并且中心至中心间距为20μπι。通过在阵列的表面上蒸发 磷脂的溶液将磷脂DOPC沉积在此微电极的阵列上。将阵列引入电解质溶液，将阵列在该溶液中在相对于Ag/AgCl的-0. 2和_2. OV的 电势之间伏安法循环。这将DOPC单层退火以形成稳定的有组织的层，如由图7的在30V S"1 下从-0.2V至-1.0V的循环伏安法图所示。此图显示了特征相转变。这些层显示为稳定历 时至少1小时。实施例3使用下面描述的程序制备在图9中示出的类型的电极组件，以制备其中在氮化硅 层303中的井的直径在960 μ m的组件。用piranha溶液(硫酸与过氧化氢的2 1 (体积体积)混合物)洗涤IOOmm 厚的硅晶片基底并且对其进行热氧化，以在晶片表面上生长致密氧化物的层。使用标准UV 照相平版印刷术技术在晶片上制备多个各自对应于一个电池组件的相同的抗蚀剂图案。各 个抗蚀剂图案在对应于工作电极301和302、接触垫304和305以及导电径迹306和307的 区域具有显影的(developed)正性抗蚀剂(没有抗蚀剂)。使用常规热蒸发技术将30nm厚的钛粘附层和然后IOOnm厚的钼层施加于基底 (参见图8中的层203和204)上。使用“金属搬离(metal lift-off) ”的标准实施通过将光致抗蚀剂溶解于丙酮中显露图案。然后使用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)沉积约500nm厚的氮化硅的层(参 见图8中的层202)。然后使用第二光掩模(蚀刻掩模)使用进一步UV照相平版印刷术将电极区域301 和302以及接触垫304和305图案化(在这些区域中选择地显影抗蚀剂)。然后使用氢氟 酸基湿蚀刻剂将下面的氮化硅向下蚀刻至钼层的表面，使得后者在氮化硅中的井的底部处 暴露并且提供接触垫304和305。
然后将剩余的抗蚀剂移除并且用piranha溶液洗涤器件。随后通过使用晶片锯切割晶片将各个电极组件与形成在晶片上的其它电极组件 分离。汞向钼盘工作电极上的电沉积在标准的三电极池中进行，所述三电极池含有均由 Metrohm供给的双接头参比电极(3. 5mol dm_3KCl，Ag/AgCl内填充，0. Imol dm_3高氯酸外 填充)和钼棒辅助电极。通过显微操纵器将工作电极引入池中并且经由连接到钼结合垫的 鳄鱼嘴夹连接。使用通过AUT0LAB软件控制的PGSTAT 12 (Ecochemie，Utrecht，荷兰)电 势恒定器设定在工作电极的表面处的电势。在电沉积之前，将硅晶片基工作电极在比例为 约3 1的硫酸(Fisher Scientific)和30%过氧化氢(Fluka)的热溶液中清洗，之后在 氮气下干燥。电沉积在相对于3. 5mol dm_3KCL Ag/AgCl参比的-0. 4V进行并且通过计时库 仑分析法监测。沉积通过打开电路终止，并且一旦通过了 1库仑的电荷就立即将电极从沉 积溶液移出。沉积在钼上的液态汞处于“变平的半球”的形式。汞被充分固定在钼上以允许在 不损失汞的条件下将电极组件“颠倒”转动。实施例4此实施例示出根据实施例3的程序制备的电极组件的稳定性。电极组件在三电极池中测试，所述三电极池控制在25°C的温度并且容纳了在pH 7. 4缓冲的0. Imol dnr3KCl磷酸盐。在引入电极组件之前，通过将氩气经过搅拌的溶液鼓 泡而将溶液除气。使用显微操纵器将电极组件下降到池中，并且用与电极接触垫中的一个 连接的鳄鱼嘴夹连接到外部电势恒定器。工作电极电势相对于通过多孔玻璃料与池分离的 Ag/AgCl 3. 5mol dm_3KCl参比电极设定。钼棒对电极完成电路。使用通过Scope 软件控 制的与Powerlab 4/25信号发生器和ADC(AD Instruments，Oxfordshire，英国)界面连接 的ACM研究电势恒定器(ACM instruments，Cumbria，英国)进行快速循环伏安法测量。电极组件在引入池中之前用Mili Q水的喷射流(jet)洗涤。然后使用在下一段 中描述的程序将其电化学清洗30秒。对于清洁程序，使用下列条件在阴极方向上扫描工作电极的电势，从而将任何污 染有机物质快速脱附到本体溶液中 范围(-0. 2V 至-2. 625V) §97V · S-1然后记录以下I/V曲线 范围(-0. 2V 至-2V) §40V · S-1(记录5次单一连续扫描+—旦径迹可见地稳定_在 2秒之后在重复循环之后 记录扫描)
随后连续运行上述清洁程序30分钟。然后再次记录以下I/V曲线 范围(-0. 2V 至-2V) §40V · S-1(记录5次单一连续扫描+—旦径迹可见地稳定_在 2秒之后在重复循环之后 记录扫描)结果提供在图11 (a)和11 (b)中，它们分别显示在初始清洁30秒之后和在30分 钟清洁之后得到的曲线。为了比较，图12显示对于钼电极(更具体地，根据以上实施例3所制备的类型的 电极组件但没有沉积汞)在与以上所述条件相同的条件下得到的Ι/ν曲线。图13显示使 用以上对于悬汞滴电极所述的条件得到的用表面积归一化的I/V曲线。首先参照图13，应当看到HMDE的I/V曲线显示特征的“水驼峰(waterhump) ”(参 见图13中示出的曲线的左手部分)。在图12中示出的钼的I/V曲线中没有看到此“水驼 峰”。现在参照图11(a)和11(b)，首先应当指出，曲线均显示了由汞显示的特征“水驼 峰”(参见图13)。因此根据实施例3制备的电极组件显示汞电极而非钼电极的特征。另 夕卜，分别为30分钟的清洁时期之前和之后的图11(a)和11(b)的比较显示曲线是相同的， 从而表明表面积没有显著损失并且表面特征保持相同。电极的表面积可以根据等式(1)从电容电流使用作为 40 μ F cm-2的在 _0. 3V 处的水驼峰测量的汞的比电容的值来精确计算[27])。
面积=(wk)⑴对于在以上试验中使用的Pe/Hg复合电极，这得到 0. 744mm2的电极表面积的 值。使用光学显微镜测量的钼盘电极(在汞沉积之前)的表面积为 0.724mm2。对于复合 电极(即在钼上沉积的汞)的计算值略微高于平盘的计算值，从而为变平的半球提供合理 的结果，因为其处于完全平坦的膜与半球的界限之间。用此方式计算的表面积值用于产生 在随后的实施例中用磷脂单层包覆的复合电极的比电容曲线。实施例5此实施例示出根据实施例3的程序制备的电极组件支撑磷脂单层的能力。下列5种磷脂被选择并且仅在它们的头基区域的化学官能性方面变化(a) 1，2- 二油酰-sn-甘油基_3_磷酸胆碱(DOPC)(b)l，2 二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(c)l，2_ 二油酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐)(DOPG)(d) 1，2- 二油酰-sn-甘油基_3_ [磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DOPS)(e) 1，2- 二油酰-sn-甘油基_3_磷酸(乙二醇)(钠盐)(DOPEG)磷脂(a)-(e)的化学结构式显示在图12中。分别制备重量浓度2mg -πιΓ1的溶解于1 4氯仿戊烷中的每一种脂质的溶液， 从而得到在2. 5mmol - dm"3至3mmol - dm"3的范围内的摩尔浓度。如实施例4中所述安装电 化学池，其容纳在0. Olmol · dm_3的浓度缓冲至pH7. 4的0. Imol · dm_3KCl磷酸盐，并且在引入工作电极之前用氩气除气30分钟。通过注射器将12. 5μ 1的每一种脂质溶液加入电解 液中，然后将工作电极降低通过溶液/氩气界面。使用实施例4中描述的原位电化学清洁 方法将电极清洁30秒，之后将电极升起短暂地通过溶液界面并且将其再次淹没以形成均 勻包覆的层。对于在开路包覆的电极在-0. 2V至-1. 2V的电势范围内、在电势保持在恒定-0. 2V 的情况下或在上述范围内重复循环的同时在40V s—1的重复扫描中没有观察到可辨别的差 异(数据未示出)。将在40V s—1记录的循环伏安图的阴极扫描转化成磷脂(a)DOPC，(b)DOPE, (c) DOPG，(d)DOPS和(e)DOPEG的比电容曲线。结果分别标示在图15 (a) - (e)中，其中粗线为 比电容曲线而细线用于电化学清洁的在实施例3中制备的类型的电极组件(即没有沉积的 磷脂)。从图15中提供的数据看到，磷脂在汞的零电荷电势(p.z.c.)和层的脱附电势之 间的电势范围内起到可变电介质的作用。磷脂向表面给予选择性化学官能性并且极大地影 响表面电势和电容曲线，从而产生与吸收层(absorbed layer)的复杂相转变相关的独特的 指纹峰。实施例6此实施例显示磷脂单层的稳定性。使用实施例5的程序，根据实施例4制备的电极组件的汞表面各自用磷脂D0PC、 DOPS 禾口 DOPG 包覆。对于DOPC包覆的电极，在-0. 2V至-1. 2V的电势范围内在40V. s—1记录循环伏安 图。然后使用实施例4中描述的清洁技术将电极原位电化学清洁30秒并且重复该程序6 次。将伏安图转化成比电容曲线并且标示平均径迹。结果显示在图16(a)中，其中窄的误 差棒(error bars)(误差棒=士 1SD)提供关于覆层之间的高水平测量再现性的良好指示。 因此，磷脂单层沉积显示出试验之间的高度类似性。对于DOPS包覆的电极，-0. 2V至-1. 2V的电势范围的初始扫描在40V. s—1记录。对 于连续的30分钟每隔1分钟的时间间隔重复和记录扫描。将循环伏安图转化成比电容曲 线，并且标示平均径迹。结果显示在图16(b)中，其中窄的误差棒(士 1SD)显示出在试验过 程中电容最小值和电流峰值保持稳定，因而表明单层完整性类似地保持稳定和可重现。为了测试在测量之间连续循环电势的情况下的稳定性和再现性，在-0. 2V 至-1. 2V的电势范围内在40V. s—1连续循环DOPG包覆的电极，从而导致对于变化+40ms软 件强制延迟，每秒询问 15次，循环持续50ms。初始地以及在5，15和25分钟之后记录扫 描。将循环伏安图转化成比电容曲线并且重叠径迹，以查看单层的电容的任何显著变化。结 果显示在图16(c)中，从其可以看到径迹几乎完全重叠，从而表明单层完整性在测量的时 期中足够稳定。实施例7此实施例示出在图10中示出的类型的原型流动池400的用途，构造该流动池以建立为了将根据本发明的电极组件用于流动池中的“原理的证明”。该流动池具有5cm的总长 度，3cm的高度(上部部分和下部部分401的402各自的高度为1. 5cm)和2cm的宽度。注 射部分406以及进入和离开通道404和405直径为4mm。钻孔407和408具有2mm的直径并且与离开通道405成45度角。根据实施例3的程序但是通过2C的电荷(而非1C)制备 电极组件300。电极组件300具有Icm的长度，5mm的宽度和0. 5mm的厚度。在钻孔407中设置Ag/AgCl微电极而在钻孔408中设置钼对电极。电极组件上的接触垫304和305各自连接到电势恒定器并且可以通过 双路开关独 立地访问。通过下列方法制备DOPC和DOPS的脂质囊泡沉积分散体将25mg的粉末状纯磷脂 溶解于50 50氯仿/甲醇中，并且在玻璃圆底烧瓶中在25°C在轻微真空下旋转蒸发直至 干燥。然后将残余物在12. 5ml的磷酸盐缓冲盐水(0. lmol. dm_3KCl，pH 7. 4)中再次悬浮以 制备Zmg.mr1分散体，然后将其尖端超声化(tip sonicated) 20分钟以制备囊泡。 通过下列方法沉积脂质层将 100 μ L的2mg. mL^DOPC或DOPS囊泡分散体注射 到电极上游的注射部分406中，同时电解液(缓冲(IOmM)至pH 7. 4的0. Im KCl磷酸盐) 组合物，流量？)以5ml/分钟的速率进入入口通道404并且沿入口通道404通过，通过测 量池403并且通过通道405流出。据发现，可以使用如对于在实施例4中描述的清洁程序所采用的相同的条件但是 施加约2秒沉积DOPC层。当完全覆盖的层变薄得足以显示出图17中所示的尖锐的相转变 峰时，通过打开电路停止电势循环，图17为用试验流动池测量的包覆有DOPC的电极(粗 线)在36V S—1的快速循环伏安图。为了比较的目的，图17还结合了没有脂质的Pt/Hg电 极(细线)的对应的径迹。在与DOPC不同的电势条件下沉积DOPS层，因为DOPS层在< -1. 4V的电势迅速 铺展。初始试验表明DOPS可以在较低电势范围中的阴极顶点为-1.1V的扫描沉积。允许 DOPS层随时间缓慢构造并且连续添加以产生如图18中看到的I/V曲线(粗线)，所述图18 为在试验流动池中测量的包覆有DOPS的电极在38V s—1的快速循环伏安图(粗线)。为了 比较目的，图18还结合了没有脂质的Pt/Hg电极在36V s—1的快速循环伏安图的径迹(细 线)。电极上的两种脂质层(D0PC和D0PS)证明为在电解液以 4. SmLmirT1流动的情 况下，在> 10分钟的时期内是稳定的，并且分别可以在原位清洁电极并且重复所述程序之 后，以合理的再现程度沉积。原型流动池的一个特征是当与在静态池中使用的Ag/AgCl (3. 5mol. dm_3)参比电 极相比时测量为+260mV的微参比电极电势的不稳定性。因此所有从流动池中的数据引用 的电势均相对于漂移的Ag/AgCl参比。精确的漂移可以通过比较在Hg表面上在确定电势 处发生的DOPC的第一或第二相转变峰的位置来评价。从图17和18可以观察到清楚的向径迹的倾斜以及电流峰的变宽。这可以归因于 三个影响因素。首先，发现池由于0-环的不完全密封而不是不漏水的。(任何小的电解液 泄露都可能在其发生与鳄鱼嘴夹和接触垫的接触时产生干扰的法拉第电流。)第二，电解液 含有比更有效地除气的静态池更大量的溶解氧。第三，参比电极距工作电极的距离略微更 大，并且在流动池中存在较高的溶液电阻，原因在于可能变得较容易被磷脂流阻塞的较小 的参比电极玻璃料(fritt)，较大的溶液电阻通过电阻电压降(Ohmic drop)的现象影响施 加于工作电极的电势。不论原型流动池的“不足”，此实施例清楚地示出许多有效点。首先，汞层在电解液流中是稳定的。第二，磷脂可以沉积到汞层上并且(当通过循环伏安法询问时)给出对应于在静态池中得到的那些的峰，从而虑及了原型流动池的“不足”。第三，脂质层在电解液流 中是稳定的。第四，通过向电极组件300的电极组件301和302施加合适的电势，可以方便 地从电解液流沉积脂质层。实施例8此实施例示出悬汞滴电极(HMDE)与如通过实施例3的程序制备的Pt/Hg电极的 性质的类似性。HMDE基于使用直径为0. Imm的毛细管，因而为汞滴提供与根据本发明的电极中的 汞的表面积大约相同的表面积。在静态池构造中并排比较HMDE和本发明的电极。所有试验在0. IM氯化钾溶液中 进行。测量在75Hz在-0. 4至-1. 15V之间用4. 95mV rms以5mV s"1的扫描速率进行。对于HMDE和复合Pt/Hg电极的电容-电势扫描分别显示在图19(a)和(b)中。尽 管在图19(a)和(b)中显示的电容值有轻微的差异，曲线的形状表明两种电极的性质的接 近的类似性。实施例9此实施例比较HMDE电极与如根据实施例3中制备的电极，二者均包覆有1，2_ 二 油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)的单层膜，在连续扫描之间沉积新的1，2_ 二油 酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)的层。试验在0. IM Kcl中进行。用4. 95mV rms以 SmVs"1的扫描速率在-0. 4V和-1. 15V之间进行负程(negative going) ‘正向，电势扫描， 然后立即接着从-1. 15V至-0. 4V进行正程(positive going) ‘反向’扫描。对于HMDE和 本发明的电极的结果分别显示在图20(a)和(b)中。对于在电解质溶液中的“裸露”电极的扫描(结果显示在图19中)，两种电极均显 示出可比较的结果。‘反向’电势扫描显示了本发明的电极比HMDE电极略微更稳定。实施例10重复实施例9的程序，但是以0. 5 μ mo 1 dm—3的浓度在电解液中结合氯丙嗪。氯丙
嗪的结构显示在下面
<formula>formula see original document page 21</formula>对于HMDE和本发明的电极的结果分别由图21(a)和21(b)中的暗线表示。为了 比较的目的，这些图还结合了在实施例9中得到的结果。再次，两种电极显示出非常类似的电容-电势扫描。实施例11重复实施例9的程序，但是以0. 5 μ mol dm—3的浓度在电解液中结合异丙嗪。异丙
嗪的结构显示在下面<formula>formula see original document page 22</formula>对于HMDE和本发明的电极的结果分别由图22(a)和22(b)中的暗线表示。为了 比较的目的，这些图还结合了在实施例9中得到的结果。在此情况下，两种电极均显示出对于测试化合物的响应，但是本发明的电极显示 比HMDE更强的响应(峰的较大降低)。实施例12重复实施例9的程序，但是以0. 5 μ mol dm_3的浓度在电解液中结合H16。H16的
结构显示在下面。<formula>formula see original document page 22</formula>对于HMDE和本发明的电极的结果分别由图23(a)和23(b)中的暗线表示。为了 比较的目的，这些图还结合了在实施例9中得到的结果。在此情况下，本发明的电极显示比在HMDE的情况下看到的响应远远更大的响应， 从而表明前者比后者更大的灵敏度。实施例13重复实施例12但是使用5 μ mol dm_3的H16。对于HMDE和本发明的电极的结果分别由图24(a)和(b)中的暗线表示。为了比 较的目的，这些图还结合在实施例9中得到的结果。图24(a)和(b)显示在两种电极上均容易可见的对测试化合物的大的响应，其中 本发明的电极仍显示略微更大的响应。实施例14按照实施例9的程序，评价根据实施例3的程序制备并且分别设置有DOPC、DOPE 和DOPS的单层的Pt/Hg复合电极。结果显示在图25 (a)-(c)中，图25 (a)-(c)分别显示对于D0PC、D0PE和DOPS的结 果(注意DOPS与显示的其它两种脂质相比在垂直比例上的差别)。结果显示所有三种类型的脂质的单层都可以形成在电极上并且在AC伏安法试验 中分别产生不同的特征径迹。实施例15重复实施例14的程序，但是将0. 5 μ mol dm—3氯丙嗪结合在电解质溶液中。结果由图26(a)_(c)中的暗线示出，图26 (a) - (c)分别显示对于DOPC、DOPE和 DOPS的结果。为了比较的目的，图26(a)-(c)还结合了显示在图25中的结果。图26清楚地示出氯丙嗪与脂质单层的相互作用(参见重叠的来自图25的对于 “非相互作用”单层的结果)。
实施例16对于根据实施例3制备并且结合了 DOPC单层的电极重复实施例10的程序以对下 列化合物评价该体系，所有化合物均以0. 5 μ mol dm—3的浓度提供在电解液中，除以5 μ mol dm-3的浓度使用的(f)苧烯以外(a)氯丙嗪
(b)异丙嗪(C)HI6(d)MB327(e)荧蒽(f)苧烯结果分别通过显示在图27 (a)-(f)中的暗线表示，图27 (a) - (f)还结合了测试的 化合物的结构式和对于在电解液中没有测试化合物的DOPC包覆电极得到的结果。结果显示所有六种化合物均可以通过该体系检测。另外，可以在可比的浓度在它 们之间进行区别。实施例17使用下列浓度的氯丙嗪重复实施例10的程序(a)0. 05 μ mol dnT3(b)0. 1 μ mol dnT3(c)0. 2 μ mol dnT3(d)0. 5 μ mol dnT3结果分别通过显示在图28(a)_(d)中的暗线表示，图28(a)_(d)还结合了对于没 有在电解液中结合氯丙嗪的DOPC电极得到的结果。如可以从图28(a)_(d)看到的，即使在测试的最低氯丙嗪浓度，即0.05μπιΟ1 dm—3，也存在来自体系的响应。 使用对于ppb的下列公式
每十亿的份数=
(溶液的质量J V !并且假设使用的溶液的密度为lg/ml，则0.05μπιΟ1 dm_3的灵敏度转化为约 18ppb。参考文献[1], Sackmann E；Science 1996,271,43.[2], ffanunu, Μ. ；Vaskevich, Α. ；Rubinstein, I. ;J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 5569.[3], Heyse, S. ；Vogel, H. ；Sanger, Μ. ；Sigrist, H. ；Protein Sci. 1995,4,2532.[4]. Shumyantseva, V. V. ；Ivanov, Y. D. ；Bistolas, N. ；Scheller, F. W.； Archakov, Α. I. ；Wollenberger, U. ；Anal. Chem. 2004，76，6046.[5]. Becucci, L. ；Leon, R. R. ；Moncelli, MR, ；Rovero,P. ；Guidelli, R. ；Langmuir 2006，22，6644.
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权利要求
一种电极组件，所述电极组件包括至少一个工作电极，所述工作电极包括导电载体基底，所述导电载体基底的表面包覆有固定在所述基底的所述表面上的汞，其中远离所述基底的所述汞的表面包覆有磷脂层。
2.根据权利要求1所述的组件，其中所述载体基底为选自由铱、钼、钯和钽组成的组的金属。
3.根据权利要求1所述的组件，其中所述载体基底为碳。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组件，所述组件包括多个工作电极。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组件，其中对于所述工作电极或每一个工作电 极，没有暴露的自由的导电载体基底表面。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组件，其中所述工作电极或每一个工作电极为 微电极。
7.根据权利要求6所述的组件，其中所述汞具有在任何方向上为2μ m至1000 μ m的最 大表面尺寸。
8.根据权利要求7所述的组件，其中所述工作电极或每一个工作电极是直径为2μ m至 1000 μ m的圆形。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组件，所述组件包括所述载体基底的层，所述层 夹在第一和第二绝缘基底层之间，所述绝缘基底层中的第一个被至少一个贯穿孔穿透，所 述贯穿孔限定所述载体金属为其提供底表面的井，所述井结合了汞覆层(对于所述载体金 属)，在所述汞覆层上设置所述磷脂层，从而形成所述工作电极。
10.根据权利要求9中所述的组件，所述组件还包括夹在所述第二绝缘基底与所述载 体金属层之间的传导层，所述传导层与所述载体金属层处于电传导关系。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组件，其中所述导电载体基底为钼。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组件，其中所述磷脂选自由DOPC、DOPE、 DOPG、DOPS和DOPEG组成的组。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组件，所述组件还包括参比电极和/或对电极。
14.一种微电极阵列形式的电极组件，所述电极组件包括 (i)第一和第二绝缘层，( )选自由铱、钼、钯和钽组成的组的导电载体基底金属的层，其设置在所述绝缘层之间，(iii)多个井，所述井形成在所述第一层中，使得所述金属层为所述井提供各自的底表 面，所述不连续部分各自形成工作电极的一部分，所述工作电极包括所述不连续部分、其汞 覆层和所述汞的表面上的磷脂层，(iv)任选地，传导层，其设置在所述金属层和所述第二基底之间并且与其处于电传导 关系，(ν)对电极，其设置在所述第一基底上， (vi)参比电极，其设置在所述第一基底上。
15.根据权利要求14所述的电极组件，其中所述导电基底为钼。
16.一种生物传感器，所述生物传感器包括(i)根据权利要求1至12中任一项所述的电极组件， ( )至少一个用于一个或多个所述工作电极的对电极，(iii)参比电极，(iv)用于向所述至少一个工作电极施加周期变化电压的装置，和(ν)用于确定作为相对于所述对电极的电势的函数的所述磷脂的微分电容变化的装置。
17.根据权利要求16所述的生物传感器，其中所述用于施加周期变化电压的装置适于 提供锯齿波形。
18.根据权利要求17所述的生物传感器，其中所述锯齿波形具有>IVs-1的用于通过 循环伏安法进行测量的变化速率。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的生物传感器，其中所述参比电极和所述工作 电极结合在所述电极组件中。
20.一种生物传感器，所述生物传感器包括 (i)如权利要求14或15中所述的电极组件，( )用于向所述至少一个工作电极施加周期变化电压的装置，和 (iii)用于确定相对于所述对电极的所述磷脂的微分电容变化的装置。
21.一种使用根据权利要求16或20所述的生物传感器分析样品以确定其中的生物膜 活性的方法，所述方法包括下列步骤(b)将所述样品暴露于所述电极组件的一个或多个所述工作电极和(c)使用伏安法技术确定所述生物膜活性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述伏安法技术为快速循环伏安法。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述变化速率为≥lVs—1。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，所述方法包括以下顺序的至少一次重复(a)通过在复合电极的汞覆层上沉积磷脂制备所述工作电极，所述复合电极包括所述 导电基底及其汞覆层；(b)将所述样品暴露于所述电极组件的一个或多个所述工作电极；(c)使用伏安法技术确定所述生物膜活性；和(d)从所述工作电极移除所述磷脂以留下所述复合电极。
25.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(a)通过在阴极方向上扫描所述复合电极 进行。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中(d)通过在阴极方向上扫描所述工作电极 进行。
27.一种在流动池中进行的根据权利要求21至26中任一项所述的方法。
28.一种流动池，所述流动池包括 ⑴测量池；( )至少一个根据本发明的工作电极，所述工作电极暴露在所述测量池中；(iii)通往所述测量池的电解液入口；(iv)离开所述测量池的电解液出口；(ν)参比电极；和 (Vi)对电极。
29.根据权利要求28所述的流动池，其中所述工作电极、参比电极和对电极设置在芯 片上。
30.根据权利要求29所述的流动池，其中所述芯片由根据权利要求14所述的电极组件提供。
全文摘要
一种可以用于例如电化学分析样品以确定具有生物膜活性的物种的存在(或其它情况)的电极组件，所述电极组件包括至少一个工作电极，所述工作电极包括导电载体基底，所述导电载体基底的表面包覆有固定在所述基底的表面上的汞。远离所述基底的所述汞的表面包覆有磷脂层。优选的载体基底为铂。所述电极组件可以结合在流动池中。
文档编号G01N33/487GK101809438SQ200880109572
公开日2010年8月18日 申请日期2008年7月30日 优先权日2007年7月31日
发明者劳伦斯·安德鲁·尼尔森, 扎卡里·科尔德里克 申请人:利兹大学