专利名称：测量样品耐受活性氧物质(ros)的能力的方法
测量样品耐受活性氧物质(R0S)的能力的方法本发明涉及测量得自人或动物有机体的生物样品的总抗氧化状态(TAS)、即耐受 活性氧物质(R0S)的方法，还涉及特别适合用于能够实施所述方法的测试试剂盒。更特别地，本发明涉及使用光化学反应测量生物液体、组织或组织提取物、更通常 是得自活的或死的人或动物有机体的材料耐受在正常或病理代谢期间所产生的或当实施 处理时所诱导的氧化应激和活性氧物质(R0S)的能力的方法。氧化应激已是近几年中大量研究的主题，因为其参予许多正常的、病理性的或 治疗性的过程。已经设计出对参与抵抗R0S的因子进行定量的试验。还开发了能够测 量总体抗氧化状态(TAS)的系统ImanoxTAS试剂盒，Randox试剂盒(EP-0563114)，W0 03/016527。本发明属于测量TAS的背景。另外，已经鉴定了 R0S的可能来源，并且在它们 中间，已经表明光化学反应产生R0S，该R0S的性质和量随着光敏剂的化学性质、被递送至 光敏剂的光强度以及在光照射之前已被光敏剂敏化的组织性质而变化。在这方面，以最大 量形成的反应性最大的初级R0S是单线态氧C02)。氧化应激和R0S在材料暴露于化学或物理试剂时产生，例如，塑料材料暴露于阳 光下，或在生物学中例如由白血球进行的导致细菌破坏的生理学吞噬反应中产生，以及还 在并且最主要在正常或病理代谢的许多生物化学反应期间产生。过量产生的或未被充分中 和的R0S将具有有害效应，可导致生物或其它成分的加速老化，导致生物组织乃至材料的 过早降解。在与R0S直接或间接相关的病变中，可提及的有阿尔茨海默病，糖尿病及其后 果，某些癌，骨组织和软骨的某些变性病变以及动脉粥样硬化。更笼统地说，关于生物老化 的一种假设还依赖于R0S有害的氧化作用以扩散的方式破坏所有的蛋白质、脂质和/或谷 胱甘肽(glutide)生物组分。在活性氧物质中，可提及的有超氧化物自由基02_，过羟基自由基H00‘，羟基自由基 H0 ’，过氧基自由基R00 ，烷氧基自由基R0 和硝酰自由基NO 。所有这些R0S都是自由基， 即，在它们的外围层中具有孤电子的化学物质。其间的这些自由基在氧原子上具有孤电子。 单线态氧力2是氧的两种激发形式之一。单线态氧不是自由基且不具有孤电子。单线态氧的寿命在水性介质中是几微秒。单线态氧是通过电极之间的放电、或化学方式或光化学反应，使用在产生丸中具 有约0. 75的极高量子效率的玫瑰红(rose bengal)产生的。单线态氧与多种底物反应形 成活性氧物质(初级R0S)，它们自己通过随着时间而形成氧化电位较低的次级R0S等，而变 得逐渐失去活性。自由基破坏多种生物靶标，特别是脂质、蛋白质和核酸。这些自由基物质参予许多 病变，它们一起被分组在术语氧化应激下。增加R0S作用的因素为数众多，并且至关重要的 一种因素是组织中的氧分压，并进而是其PH，以及从生物学观点看是调节细胞死亡的全部 的酶。降低R0S的作用的因素也是为数众多的蛋白质，维生素，过氧化物歧化酶(S0D)，谷 胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶体系，等等。R0S的作用是在R0S反应性、R0S的寿命以及R0S 相对于这样那样的生物成分或靶标的亲合力之间的某种折中。抗氧化物质呈现出与R0S的 极高亲合力，从而使得R0S偏离一些本来将会被其攻击的其它成分。虽然如此，但任何经历
4R0S攻击并且可能包括抗氧化物质的化合物将又变得具有氧化性并可能变得有害，虽然具 有的反应性小于R0S的反应性。任何被加入的试剂，包括被加入用于检测、并且更不必说用 于引起或抑制氧化反应的试剂，在某种情况下还可以在R0S存在时以相同方式起作用。因 此，使R0S失去毒性是导致R0S随时间被逐渐中和的一类级联事件。为了研究R0S，可以通过直接或间接检测R0S来分析R0S生成，然而直接检测对于 大多数物质是不可能的，特别是对于丸而言是困难的(在水中在1270纳米(nm)下测得的 02发光寿命是5微妙(y s))；并且对于大多数的R0S而言，不可能在给定的材料或组织中 简单地开展，特别是对于基本组织或生物液体而言，因为反应性迅速降低以及因为不可能 在长持续时间内进行实时测量。在影响R0S产生或循环的条件下，有可能分析有色或荧光 标记的转化。然而，导致R0S生成的反应还通常导致标记被破坏。在市售的测试中，使氧化 性化学物质与底物反应，希望测量所述底物耐受ROS(TAS)的能力。然而，在该测试中，在溶 液中余留的试剂形成测量值的一部分，因为所述物质没有被中和并从而成为假象的来源。 例如，这适用于Franklin R. Vargas 等人的文章"Antioxidant and scavenging activity of emodin, aloe-emodin, andrhein on free radical and active oxygen species，，， Pharmaceutical Biology, Vol. 42, No. 4-5, June 2004(2004-06)，pp. 342—348。 i亥 述了测定几个有机化合物的抗氧化状态的方法。该方法基于力2形式的氧与所提及的化合 物的反应，并基于在反应期间通过荧光检测丸的浓度。在其实施中，产生单线态氧生产的 光化学反应在显影剂即比色化合物特别是鲁米诺(luminol)存在下进行。使鲁米诺经历光 照射产生假象。结果是，在该文章中，鲁米诺直接检测由光化学反应产生的单线态氧。P.Bilski 等人的文章"Photosensitized oxidation of 2 ‘, 7 ‘ -dichlorofluoresceine single oxygen does not contribute to the formationof fluorescent oxidation product 2' ,7' dichlorofluoresceine" , Free RadicalBiology&Medicine, Oct. 1,2002，Vol.33，No. 7，October 1，2002(2002-10-01)， PP. 936-946，在其标题中提到了单线态氧对形成荧光二氯荧光素没有贡献。在其用生物样 品进行的实验中，Bilski再次以类似于Vargas的方法进行实验，即，他照射比色组分，假设 任何的其它作用，特别是与诸如二氯荧光素的试剂的作用，将导致错误的或不可解释的结 文件W0 92/10759没有描述任何的光化学反应。对于文献W02004/034058而言也 是如此。另外，前面提到的申请未提及在组织水平下进行的总体测量。最后，有可能通过检 测个体因素或通过测量它们在R0S的影响下如何发生转化来研究影响R0S反应性的个体因 素，但是这是耗时的，昂贵的，并且没有考虑猝灭剂之间的相互作用。为了减轻这些困难并且为了满足能够进行总体测量耐受R0S、也称为TAS的需要， 并且与测量抑制R0S的能力相对应，开发了本发明的方法。因此，本发明的一个目的是提出了在实施时用来减少或消除假象源并获得可靠的 和可再现的测量值的测量方法。为此目的，本发明提供了测量得自人或动物有机体的生物样品的总抗氧化状态 (TAS)、即其耐受活性氧物质(R0S)的能力的方法，所述方法特征在于其至少包括以下步 骤
使供试的生物样品在液体介质中接触光敏剂，形成供试混合物； 使所述供试混合物经历处于被所述光敏剂吸收的波长下的一定剂量的光照射， 从而通过至少在光和光敏剂之间的光化学反应至少引起适合与所述样品协作以形成活性 氧物质(R0S)的单线态氧的生成； 在照射后加入化合物，该化合物在活性氧物质(R0S)存在下通过比色反应形成 发色团或荧光物质； 测量随时间生成的发色团或荧光物质的量，以便测定所述样品通过抑制活性氧 物质(R0S)而耐受它们的能力，低水平的发色团或荧光物质的生成与所述样品具有高的耐 受活性氧物质(R0S)的能力相对应； 使通过将得自推定健康的有机体的参比生物样品与光敏剂混合所形成的至少一 种参比混合物经历与供试混合物相同的光化学反应、比色反应以及测量反应；和 将供试混合物的测量结果与所述至少一种参比混合物获得的测量结果相比较。生成的发色团或荧光物质的量作为时间的函数测量。通过在光照射后向R0S中单独加入适于形成发色团或荧光物质的化合物，所述化 合物自身不被所述照射降解。另外，测量的不是发色团或荧光物质与单线态氧的反应，而是 测量发色团或荧光物质与得自单线态氧与供试生物样品的反应的活性氧物质自身的反应。 因此，单线态氧的短命性质变成了一个优点。应当注意到，还可能使用供试样品与光敏剂的混合物以及作为对照的参比样品与 光敏剂的混合物，以便通过使所述对照单独经历比色反应来校正通过光化学反应以及比色 反应获得的数据。当实施以下类型的方法时，其中在该类型的方法中，供试样品与光敏剂的混合物 以及参比样品与光敏剂的混合物都经历相同的光化学反应、比色反应和测量反应，所述方 法包括，在测量步骤期间，随时间测量每种混合物从所述物质生成的光或荧光信号的强度 形式的发色团或荧光物质的量，所述测量步骤之后是处理所述测量结果的步骤，在该步骤 期间，为每种混合物建立得自发色团物质的光信号的强度作为时间的函数的曲线，然后计 算曲线下面积并测量在供试混合物与参比混合物的所述面积之间的比率。如上所述，在不使供试混合物以及参比混合物经历光化学反应条件下得自比色反 应自身的结果，可从在光化学反应和比色反应之后获得的曲线中被减去。优选使用生成大部分单线态氧丸的光敏剂，所述光敏剂优选选自玫瑰红和四 (4-磺酸根合_苯基)卟啉(TPPS)。还优选光敏剂选自在无光下不与供试的生物样品反应的那些，并且所述光敏剂在 与所述光敏剂的光谱最大吸收相对应的选择波长下经历照射。一般地，在使供试样品与参比样品接触光照射用光敏剂之前，测量供试样品与参 比样品的吸光度。重点是测量其中希望测量TAS的溶液的最终的吸光度，并且在通过光照射引起光 化学反应之前完成。用于激发光敏剂的光将受到所述吸光度的影响，光敏剂造成能够进行 TAS测量的光化学反应，因此用于测量TAS的光化学反应的强度将被改变，特别是如果吸光 度太大时将被减少。类似地，在光化学反应之后发射的荧光的测量将受到溶液的吸光度的 影响。因此曲线下面积的测量必须被计算为吸光度的函数，并且对于引起曲线下面积线性变化的全部吸光度值必须这样作，这提示了校准是必要的。换句话说，供试样品的吸光度值，例如代表样品混浊或颜色过重，用于从分析的其 余值中排除所述样品，因为这样的样品显然将产生问题，特别是因为其在光化学反应期间 不允许充分光通过且因此在比色反应期间引起错误的光学测量。优选，进行反应以形成发色团物质的化合物是还原的二氯荧光素_ 二氯荧光素体 系(DCFH-DCF)。一般地，光化学反应和比色反应在中性或接近生物pH的pH下在恒温外壳中进行。优选，得自人或动物有机体的供试的生物样品是生物流体诸如血清、血浆或在溶 液中的组织提取物。参比生物样品与供试的生物样品具有相同的性质并且来自推定健康的 载体有机体。优选，对于每种混合物而言，生成的发色团或荧光物质的量经过不少于45分 钟(min)的时间、优选在50分钟到90分钟的范围内，以来自所述样品的光或荧光信号的强 度的形式被测量。本发明还提供了用于测量得自人或动物有机体的生物样品的总抗氧化状态 (TAS)、即其耐受活性氧物质(R0S)的能力测试试剂盒，所述试剂盒特征在于其包括适于通 过光化学反应至少生成适合与所述样品协作以形成活性氧物质的单线态氧的至少一种光 敏剂，适于在活性氧物质的存在下形成发色团或荧光物质的试剂，以及根据上述明确说明 的方法使用它们的说明书。本发明还提供了测试试剂盒，其特征在于该测试试剂盒至少首先包括限定至少两 个隔室的支座，其次包括光敏剂和适于形成发色团或荧光物质的试剂，各自布置在所述支 座的相应隔室之一中的缓冲介质中，所述隔室适于彼此连通。本发明在阅读以下实施方案的描述并参考附图后，得以被更好地了解，其中
图1是本发明方法的总图示，该方法是用于测量生物材料或介质的总抗氧化状 态(TAS)的类型； 图2显示了以任意单位表示的得自二氯荧光素(DCF)的荧光信号作为时间函数 的变化，以及在浓度为10毫克/毫升(mg/mL)的玫瑰红存在下，在10焦耳/平方厘米(J/ cm2)照射之后供试样品中的胎牛血清(FCS)的浓度； 图3显示了对于胎牛血清(FCS)的相同样品的40次分析，以任意单位表示的二 氯荧光素(DCF)信号的荧光作为时间函数的平均变化，并且其显示了本发明方法的可重现 性； 图4显示了在标准大气下或在氩气或氮气饱和的气氛中，在含有血清并之前在 玫瑰红存在下经过光照射的介质中，以任意单位表示的二氯荧光素(DCF)信号的荧光作为 时间函数的变化； 图5显示了对于采自推定健康的24名男性和20名女性并在玫瑰红存在下经历 光照射的血清，二氯荧光素(DCF)荧光信号的作为年龄和性别的函数的曲线下面积； 图6显示了对于采自糖尿病患者并在玫瑰红存在下经历光照射的17个血清样 品，二氯荧光素(DCF)荧光信号的曲线下面积，与得自参比健康人的血清相比较；和 图7显示了对于采自不同物种的动物(每个物种个体的最小数目=8)并在玫瑰 红的存在下经历光照射的血清，二氯荧光素(DCF)荧光信号的曲线下面积。如上所述，本发明的方法，其在于测量生物样品耐受活性氧物质(R0S)的能力，至少包括以下的连续步骤a)使供试样品在液体介质中接触光敏剂以形成供试混合物的步骤；b)使所述供试混合物经历一定剂量的光照射以便至少引起适于与所述样品形成 活性氧物质的单线态氧生成的步骤；c)在照射后向所述被照射的混合物中加入化合物的步骤，所述化合物在活性氧物 质(R0S)的存在下发生比色反应以形成发色团或荧光物质；和d)测量生成的发色团或荧光物质的量以便测定所述样品耐受活性氧物质(R0S) 的能力的步骤。所述方法还包括使得自推定健康载体的参比生物样品经历上述步骤a)、b)、c)和 d)。所述方法的步骤a)到d)可以连续或平行的方式同样好地在供试样品和参比样品上实 施。 在光化学反应和比色反应步骤以及测量步骤之后是对结果进行比较的步骤。为了 形成这一比较步骤，为每种混合物建立了提供发色团物质的光信号强度作为时间的函数的 曲线，然后计算曲线下面积并测定供试混合物和参比混合物的该面积之间的比。所述方法的实施因此可包括加入光敏剂以浓度为5微克/毫升(P g/mL)存在 的玫瑰红；和供试的溶液(例如，血清，FCS或任何其它由生物材料、生物组织或生物液体构 成的底物，可能包含希望测量其抗氧化潜力并希望测量其抗氧化状态作为时间的函数的物 质)。供试样品的溶液的体积优选在1微升(PL)到50微升的范围内。全部物质都在水溶 液中并且通过加入浓磷酸盐缓冲液(250毫摩尔(mM))被缓冲到pH 7.2。例如，使用在514 纳米(nm)下以lj/cm2到lOJ/cm2能量密度(fluence)发射的激光进行照射(照射历时10 秒(s)到50s)。在光照射结束时通过自动装置加入显影剂，还原的二氯荧光素(DCFH)(或 还原的DCF)，并搅拌。化合物的浓度为0. 01 u g/mL到lmg/mL。因此在单线态氧已消失之 后加入DCFH并且开始生成活性氧物质。通常，在光照射结束时立即加入发色团物质。这两 个操作因此基本上是同步的。在同样恒温的体系中分析所有溶液的荧光。在相同的间隔获得全部溶液的测量结 果。在10分钟到60分钟时段结束时，计算曲线下面积，以及斜率，斜率用来表征曲线在不 同时间如在1、2、5、10、20、40和60分钟处显示的荧光变化。这些操作使得有可能获得作为 供试的血清、提取物等的浓度的函数而变化的曲线下面积的比率。因此，当供试物质表现为 抗氧化能力不足时，曲线下面积的比率增加，当存在超抗氧化保护或活性时，所述比率与对 照相比较降低。评价了相对于得自健康载体作为参比的正常血清或正常提取物的归一性 (Normality)。如上所述，所述方法的第一步骤用来在完全标准化的条件下特别借助于光敏剂实 施光化学反应，以便生成单线态氧Co2)。生成单线态氧的光敏剂置于溶液中，例如水中。光 敏剂的浓度优选为0. 01 u m/mL到lmg/mL。将样品加入到所述溶液中，例如，血清、基本生物 组织或生物液体，可能包含希望测量其抗氧化潜力的物质(例如，氨基硫醇(amiothiols)， 维生素C或E，等等)以及希望测量其抗氧化状态的物质，初级或次级R0S在光敏剂所吸收 的波长下进行光照射后会与所述抗氧化状态的物质反应。将混合物通过加入磷酸盐缓冲液 (250mM)被缓冲在pH 7. 2，并且被保持恒温。在光敏剂所吸收的波长下实施光照射。能量 传递使得不导致被照射的混合物升温，所述混合物被保持恒温。这一光照射从激光或任何
8其它类型的能够在适当的波长和强度下进行照射的光源中获得。同时，在照射包含光敏剂 和样品的混合物结束时，加入已知的或未知的显影剂，例如还原的二氯荧光素和二氯荧光 素(DCFH-DCF)体系，其在被残留的R0S攻击之后生成荧光，因为由最初的光化学反应生成 的R0S的反应性在级联中被去活化。其后，残留的R0S的氧化活性被测量为时间的函数并 且借助于所述荧光以恒温的方式进行。通过测量由DCFH-DCF所揭示的R0S的存在而观察到的R0S的消失代表了材料、生 物组织或生物液体作为时间的函数抑制R0S的并进而限制了其在希望测量TAS的样品内的 有害效应的能力。通过适当的有色或荧光试剂获得的信号的形式，可以例举在DCFH已受到 R0S攻击之后的荧光DCF，其是所述材料经历光化学反应的特征，并且与生物材料或液体不 存在时所获得的信号完全不同。另外，当在相同底物(胎牛血清(FCS))存在下对相同光敏 剂连续进行40次光照射后，在一个实验与另一个实验之间以完全可重现的方式发生荧光 变化(图3)。因此，的确，所得信号作为时间的函数变化，所得信号经过分析并且对应于所生成 的R0S的渐进去活化，R0S导致DCFH变为荧光DCF，荧光DCF随着与非荧光形式的DCFH-DCF 相互作用的R0S的数目增加而增加，描述了 DCFH。这不是任何类型的假象，即使不可能排除 在该阶段中DCFH自氧化形成DCF的某些贡献。然而，即使在这种情况下，该贡献自身与通 过光化学反应生成R0S的强度成正比并与经历测量的介质的TAS成反比。在测量结束时， 所测量的由R0S导致DCFH被氧化成DCF的荧光作为时间的函数的曲线下面积越大，则越少 的材料能够迅速地中和从标准化的最初光化学反应所生成的初级R0S。因此当曲线下面积 越小时TAS越大。这种曲线的一个实例如图2所示。每条曲线对应于供试样品的血清浓度。因此， 样品提供了 2%、5%、10%或15%的血清浓度。其中能够使初级R0S生成的光敏剂经历光照射并且其中随后通过如上所述的 DCFH-DCF体系检测R0S的溶液具有的pH被高浓缩的磷酸盐缓冲液(250mM)缓冲到pH 7. 2。 这一条件使得能够获得良好的荧光信号，消除由于加入溶质或化合物而导致的与PH变化 有关的假象，并与生物PH相容。在用于测量血清的抗氧化状态以便检测与疾病有关的所述抗氧化状态的异常的 应用中，R0S在供试的患者血清中直接被生成，并与在参比血清中获得的值以及与先前在健 康的对照样品中获得的正常值相比较。在这种情况下，所述方法至少包括一个步骤，即至少使第一参比混合物经历与供 试样品相同的光化学反应和比色反应。该第一混合物通过将光敏剂和得自健康对照组的血 清混合而成。该方法还包括使形成第二对照的所述参比混合物和供试混合物经历与供试混 合物相同的比色反应，但不经历任何先前的光化学反应。获得的结果能够对结果进行校正。在临床角度上看，血样可在治疗之前、治疗之后立刻、然后在更长时间之后被取 得。在治疗之后获得的结果与治疗之前的值相比较。因此，并且例如，有可能检验体外循环 对术后并发症率的影响或测量放疗对具体患者的影响。对于不同浓度的供试的并且可能包含希望测量抗氧化潜力的物质的生物组织或 生物液体而言，测量生物组织或生物液体对R0S消失的影响的连续步骤可重复。因此，描绘 由混合物中产生的R0S诱导的荧光变化的曲线下面积，作为由所述材料、生物组织或生物液体诱导的抗氧化能力的改变的函数而变化。当抗氧化能力增加时，曲线向下移动。当抗 氧化能力降低时，曲线向上移动。通过测量曲线的斜率，从而有可能非常准确地表征TAS并 由此可能进行随后的比较，例如与其中希望测量TAS的其它材料的比较。图2显示了得自供试样品与不同浓度的光敏剂的混合物的结果，样品单独形成的 对照构成参比。结果表示为参比对照值的百分数。计算了供试样品和参比样品的曲线下 面积。使用如上所述的本发明的方法进行测试，使得有可能测量健康人血清的抗氧化状态 (图5)。已有可能表明该潜力对于已可能计算两种平均值的男性和女性而言是不同的。以 相同的方式用于得自并发缺血的糖尿病患者的病理血清中时，测量到患有不稳定或并发症 的糖尿病患者中的测试值高于健康的对照值(图6)。还在进展性癌的癌学领域中进行了类 似的观察。最后，已分析了得自不同物种的动物的血清的抗氧化潜力。我们已经观察到在物 种之间具有显著差异以及在具体物种内的个体之间也具有显著差异，引起较大的但是小于 人血清的标准偏差(图7)。所述曲线显示了当DCFH转化为DCF时的荧光作为时间的函数在不同溶液中的变 化分析。根据相对于R0S的类型测量材料、生物组织或生物液体的状态的R0S类型的不同， 有可能选择适于优先生成这样那样类型的R0S的光敏剂。然而，优选选择生成大部分的具 有最高活力的物质即丸的光敏剂。因此，适用的光稳定剂的实例可为玫瑰红，另一个实例 可为四(4-磺酸根合-苯基)卟啉(TPPS)，它们在生成丸中都具有0.75的量子效率。另 一个选择标准是当混合物避光时在光稳定剂和供试样品之间不存在化学反应。光照射应当 在光敏剂光谱的最大吸收处进行，在优选实施例的背景中玫瑰红为520nm下。被递送到样 品和光敏剂的混合物的能量在优选应用中是lOJ/cm2。光照射和随后的荧光检测必须在严 格的恒温条件下进行。图4显示了最初的光化学反应实际上确实引起R0S、特别是丸的生成，因为该反 应当在用氮气饱和的气氛下、或者甚至更明显地在用氩气饱和的气氛下进行照射时，部分 地受到抑制(图6)。存在多种试验使得有可能评价生物材料的抗氧化能力。在这些方法中，参考方法 被称作“Randox”。本发明的方法在使用生成R0S的光学方法的方面与该试验显著不同(从 而限制与潜在的污染物如重金属或医原性反应有关的假象)。另外，对于这种反应使用单线 态氧丸(寿命极短，在介质中氧的消费最低并从而使假象的风险最小化)，具有最大氧化能 力，使得能够完全彻底地检测诱导的R0S。另外，因为照射的持续时间极短，并且在任何情况 下总是当在光照射结束后立即加入用于检测被诱导的R0S的试剂时被终止，DCF试剂相对 于光的反应性无关紧要并且所述试剂只测量被俘获的R0S。这还导致没有假象。另外，在 Randox反应之后获得的荧光非常不稳定，在测量时间之后60秒信号下降50%，由供应商推 荐的最佳时间为约3分钟，从而使得不可能进行R0S作为时间的函数消失的方式的任何分 析。本发明的方法可特别地在整体式组件、优选在便携式组件的形式的装置中实施， 所述装置至少包括优选保持恒温的外壳，用于在所述外壳内实施光照射的机构，用于测量 在所述外壳内的光信号强度的机构，和用于从测量机构中获得和处理数据的机构。术语“整体式组件”用来指包括所有上述元件和形成一件式组件的装置。用于在外壳中提供光照射 的机构可由简单二极管组成。用于测量光信号强度的机构可由一排二极管或光电倍增器组 成。所述外壳可限定至少两个隔室，一个隔室用于接受光敏剂，另一个隔室用于接受适于形 成发色团或荧光物质的试剂。所述隔室适于互相连通，所述连通通过将一个隔室的内容物 倾入另一个隔室内或通过将隔室之间的连接区打破来进行，从而使得能够在照射之后进行 比色反应。可提供第三个隔室用于接受供试样品和用于测量其吸光度。借助于这种装置， 操作者只需将样品插入恒温外壳中即可。从测量机构获得和/或处理数据的机构是指可类 似地被简单化并可能基本上以计算机处理的形式被执行。 所述方法还可借助于测试试剂盒来实施，所述测试试剂盒至少首先包括限定至少 两个隔室的支座，其次包括光敏剂和适于形成发色团或荧光物质的试剂，各自在支座的隔 室之一的缓冲介质中，所述间隔适于彼此连通。再者，所述隔室可相对于彼此移动以便使得 它们中一个的内容物能被倾入到另一个的内容物中。所述隔室还可装备有可拆卸的或可破 坏的分隔区，其使得有可能在施加光照射之后使所述隔室的内容物彼此连通。试剂盒可由 获得以下机构的操作者来使用照射机构；用于测量光信号强度的机构；和从测量机构获 得和/或处理数据的机构。
权利要求
测量得自人或动物有机体的生物样品的总抗氧化状态(TAS)、即其耐受活性氧物质(ROS)的能力的方法，所述方法特征在于其至少包括以下步骤使供试的生物样品在液体介质中接触光敏剂，形成供试混合物；使所述供试混合物经历处于被所述光敏剂吸收的波长下的一定剂量的光照射，从而通过至少在光和光敏剂之间的光化学反应至少引起适合与所述样品协作以形成活性氧物质(ROS)的单线态氧的生成；在照射后加入化合物，所述化合物在活性氧物质(ROS)存在下通过比色反应形成发色团或荧光物质；测量随时间生成的发色团或荧光物质的量，以便测定所述样品通过抑制活性氧物质(ROS)而耐受它们的能力，低水平的发色团或荧光物质的生成与所述样品具有高的耐受活性氧物质(ROS)的能力相对应；使通过将得自推定健康的有机体的参比生物样品与光敏剂混合所形成的至少一种参比混合物经历与供试混合物相同的光化学反应、比色反应以及测量反应；和将供试混合物的测量结果与所述至少一种参比混合物获得的测量结果相比较。
2.权利要求1的方法，特征在于其包括在测量步骤期间随时间测量每种混合物从所述 物质生成的光或荧光信号强度形式的发色团或荧光物质的量，所述测量步骤之后是处理所 述测量结果的步骤，在该步骤期间，为每种混合物建立得自发色团物质的光信号的强度作 为时间的函数的曲线，然后计算曲线下面积并测量在供试混合物和参比混合物的所述面积 之间的比率。
3.权利要求1或权利要求2的方法，特征在于在使所述供试样品与参比样品接触光敏 剂以便接受光照射之前，测量所述供试样品和参比样品的吸光度。
4.权利要求1-3中任一项的方法，特征在于使用生成大部分单线态氧1O2的光敏剂，所 述光敏剂优选选自玫瑰红和四(4-磺酸根合-苯基)卟啉(TPPS)。
5.权利要求1-4中任一项的方法，特征在于光敏剂选自在无光下不与供试的生物样品 反应的那些，以及特征在于所述光敏剂在与所述光敏剂的光谱最大吸收相对应的选择波长 下经历照射。
6.权利要求1-5中任一项的方法，特征在于进行反应以形成发色团物质的化合物是还 原的二氯荧光素_ 二氯荧光素体系(DCFH-DCF)。
7.权利要求1-6中任一项的方法，特征在于光化学反应和比色反应在中性或接近生物 PH的pH下在恒温外壳中进行。
8.权利要求1-7中任一项的方法，特征在于得自人或动物有机体的供试的生物样品是 生物流体诸如血清、血浆或在溶液中的组织提取物。
9.权利要求1-8中任一项的方法，特征在于对于每种混合物而言，生成的发色团或荧 光物质的量经过不少于45分钟的时间、优选在50分钟到90分钟的范围内，以来自所述样 品的光或荧光信号的强度的形式被测量。
10.用于测量得自人或动物有机体的生物样品的总抗氧化状态(TAS)、即其耐受活性 氧物质(ROS)的能力的测试试剂盒，所述试剂盒特征在于其包括适于通过光化学反应至少 生成适合与所述样品协作以形成活性氧物质的单线态氧的至少一种光敏剂，适于在活性氧 物质的存在下形成发色团或荧光物质的试剂，以及根据权利要求1-9的方法使用它们的说明书。
11.权利要求10的测试试剂盒，特征在于该测试试剂盒至少首先包括限定至少两个隔 室的支座，其次包括光敏剂和适于形成发色团或荧光物质的试剂，各自布置在所述支座的 相应隔室之一中的缓冲介质中，所述间隔适于彼此连通。
全文摘要
本发明涉及测量生物样品耐受活性氧物质(ROS)的能力的方法。所述方法的特征在于其至少包括以下步骤使供试样品在液体介质中接触光敏剂以形成供试混合物，使所述供试混合物经历一定剂量的光照射以便通过光化学反应引起活性氧物质的产生，然后在照射后加入化合物，所述化合物在活性氧物质(ROS)存在下通过比色反应形成发色团或荧光物质，和测量生成的发色团或荧光物质的量，以及还使参比混合物经历与供试混合物相同的光化学反应、比色反应和测量反应。
文档编号G01N21/64GK101855538SQ200880115860
公开日2010年10月6日 申请日期2008年11月13日 优先权日2007年11月13日
发明者蒂埃里·帕特里斯 申请人:蒂埃里·帕特里斯