专利名称：：钒酸盐氧化法检测总胆红素试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物试剂技术。具体涉及一种钒酸盐氧化法检测总胆红素试剂盒。
背景技术：
：胆红素(bilirubin)是血红素的代谢产物，主要在肝脏内经结合作用转化、排泄；它在血清中可以三种形式存在未结合胆红素(BU，即游离胆红素)、结合胆红素(Be:单葡萄糖醛酸Bcm和双葡萄糖醛酸胆红素Bcc之和)以及胆红素(白蛋白共价连接胆红素)。胆红素为一种有效的抗氧化剂，具有捕获氧自由基的能力，能保护脂类和脂蛋白不被氧化。它与人体内其它抗氧化防御系统协同作用，与白蛋白结合后存在于心室的肌细胞部位，阻止该部位产生氧自由基，可调节心肌细胞的胆红素抗氧化活性，保护心室肌细胞不受氧自由基的损害。因此，当胆红素浓度降低时，冠心病的危险增加。胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。如果胆红素总量增高、间接胆红素增高，就意味着可能有下列症状溶血性贫血，血型不合输血，恶性疾病和新生儿黄疸等。如果直接与间接胆红素均增高，可能有下列症状急性黄疸型肝炎，慢性活动性肝炎和肝硬变等。而胆红素总量和直接胆红素增高，则表明可能为肝内及肝外阻塞性黄疸，胰腺癌，毛细胆管型肝炎及其他胆汁瘀滞综合症。中毒性肝炎会导致胆红素总量增高、直接与间接胆红素均增高。正常血清总胆红素浓度为1.717.1iimol/L，其中直接胆红素低于3.4ymol/L。当总胆红素达34iimol/L时，临床上即可发现黄疸；如血清总胆红素超过正常范围，而肉眼看不出黄疸时，则称为隐性黄疸，黄疸最常见于肝胆疾病，但其他系统疾病也可能出现。目前，总胆红素测定的方法主要有重氮法、钒酸盐氧化法和酶氧化法。重氮试剂法历史最久，至今仍应用最广。通常有J-G法和M-E法。前者是在胆红素与重氮试剂反应后产生的重氮胆红素使之在碱性条件下由红色变成绿色。光谱的转移增加了反应的灵敏度和特异性，在绿色环境中基本不干扰，但是这一改变增加了自动化的难度。因此采用该方法往往只能手工操作。M-E法是在重氮胆红素生成后直接比色(红色)，手续简单，易于自动化是优点，但特异性差，溶血样品的结果严重受扰。由于重氮法历史悠久，医学上有关胆红素的各种论述均以此法为基础。但是它存在缺陷其一是重氮试剂不稳定，它必须由亚硝酸钠和氨基苯磺酸临时生成，生成后最多只能用2天(一般6小时)；其二是重氮试剂与间胆和总胆的反应特异性不佳，在一定条件下测总胆，一部分间胆会参与反应，如果反应时间延长，参与的更多，导致测值的不准确，而且该方法的操作繁复、试剂不稳定、反应不专一。针对上述问题，人们作过无数的改良，但至今仍无满意的结果。氧化酶法，特异性好，但是酶的稳定性较差，价格偏高，成本高，不可能大面积普及。化学氧化法，使用化学氧化法测胆红素的渊源很早，70年代就采用铁氰化钾除滴定法测钙时的胆红素干扰，以后也曾有报道用铁氰化钾法测总胆。但也都停留在方法学的探讨上，而没有实际应用价值。1993年日本学者To-kuda发表钒酸盐氧化法测血清中胆红素。但该方法必须保证反应的专一性，还要防止氧化反应的早、中、晚期可能出现的干扰和副反应。这类化合物除钒酸和亚硝酸钠外还有过苯甲酸钠、过硫酸钠、乙酸锰(ni)、硫酸铜、硫酸铁等。从上述的比较来看，钒酸盐氧化法测定胆红素具有简单、特异的特点。目前钒酸盐氧化法测胆红素技术虽然已能进入临床应用.但还不完善，在总胆红素的测量过程中存在偏钒酸难于溶解的问题，在溶液中呈胶体状，使得试剂本底升高。特别是在酸性条件下溶解度会大大降低，偏钒酸根离子迅速析出，使溶液的本底升高，严重影响反应。如果降低浓度，会使反应不完全，测量结果降低！而升高试剂反应的pH值，会增加很多副反应，特别是抗坏血酸对试剂的干扰特别严重，严重影响检测结果。但是，钒酸完全溶解需要较高的温度，而自动生化仪上的温度一般是4-8度，钒酸在此温度下在一般的缓冲液中会立刻析出，导致检测不能进行。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种促进钒酸完全溶解，提高试剂抗干扰性的钒酸盐氧化法检测总胆红素的试剂盒。本发明基于下列原理(1)选用有效的物质来消除抗坏血酸干扰的反应。其中钒酸氧化的抗干扰剂为或TrionX-100(表面活性剂)；(2)增加增强钒酸的溶解，确保反应的完全。选用了碳酸盐和乙醇胺。实验表明复合物能明显增强偏钒酸根的溶解性。本发明提供了一种钒酸盐氧化法检效2以3:1比例混合组成试剂1:缓冲液10-300mmol/LFeCl25-100践ol/LTritonx-1000.01_40ml/L两性表面活性剂0.l-40ml/L试剂2:总胆红素试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和碳酸盐乙醇胺钒酸盐NaCl10-300mmol/L10-300mmol/L0.5-10,1/L10-500mmol/L0.01-0.9g/L制备方法1先取两个容器，每个容器加入为总量80%的去离子水；2.在容器一中依次加入缓冲物、FeCl2和Tritonx-100两性表面活性剂；3.在容器二中依次加入碳酸盐、乙醇胺、钒酸盐、NaCl和叠氮钠溶液进行充分的4.向每个容器再分别加入剩余的20%的水。本发明的试剂盒检测效果如下(1)碳酸盐和乙醇胺对钒酸盐溶解的影响混合物对反应的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)抗干扰剂对反应的影响FeCl2去除抗坏血酸对反应的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述检测结果表明本发明的试剂盒能很好的溶解钒酸盐，能够很好的去除抗坏血酸对总胆红素的干扰作用。本发明的试剂盒通过加入复合物，解决了钒酸盐低温下难溶于水的难题，增加了钒酸的溶解度，反应过程中不会析出，在酸性条件下溶解度也不会降低，从而加速了总胆红素的反应。加入了抗干扰物，提高了反应过程中抗坏血酸干扰反应的能力，使测试的结果与重氮盐法有很好的临床相关性，本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。图1为用于临床的相关比较。纵座标为重氮法，横座标为钒酸盐氧化法。具体实施例方式实施例11.先取两个一升容器，每个容器加入0.8L的去离子水；2.容器一中加入试剂1的物质拧檬酸钠29.4g、乳酸30g、FeC120.OOlg、Tritonx_1005ml、吐温5ml叠氮钠0.5g;3.容器二中加入试剂2的物质Na2C0320g、乙醇胺13.6g、偏钒酸铵0.5g、NaCl1.2g、叠氮钠0.5g;4.溶液进行充分的搅拌5.最后在两个容器中加入剩余的0.2L的水6.试剂在20度常温下放置1天后放入4度冰箱里保存。在奥林巴斯400检测仪器上检测，其参数为两点终点法，主波长450，副波长540，样本量为10微升，试剂一为280微升，试剂二为70微升。本实例试剂盒作了临床相关性比较取按本方法(钒酸氧化法)30例不同浓度的临床样本用3种方法平行进行检测，结果如下3种方法试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>8910111213141516171819202122232425262759.38.542.147.383.132.148.642.145.432.145.213.264.649.037.8415.410.217.46.567.8720.48.5958,38.552.167.393.112.138.652.165.452.155.213.274.679.057.8215.210.317.66.587.8820.58.5653.18.922.247.103.292.198.292.015,262.175.293.584.398.257.6114.99.216.56.327.2220.97.327262.252.13305.795.765.26本方法与重氮法相比的临床相关性R2=0.998，与氧化酶法的R2为0.999实施例2试剂11.先取两个一升容器，每个容器加入0.8L的去离子水；2.容器一中加入试剂1的物质甘氨酸7.5g、盐酸5ml、FeC12500.002、Tritonx_1005ml、吐温5ml、叠氮钠0.5g;3.容器二中加入试剂2的物质Na2C0318g、乙醇胺14g、偏钒酸铵0.5g、NaCl1.3g、叠氮钠0.5g;4.溶液进行充分的搅拌5.最后在两个容器中加入剩余的0.2L的水6.试剂在20度常温下放置1天后放入4度冰箱里保存。实施例31.先取两个一升容器，每个容器加入0.8L的去离子水；2.容器一中加入试剂1的物质邻苯二甲酸15g、乳酸28g、FeC120.010g、Tritonx_1005ml、吐温5ml、叠氮钠0.5g;3.容器二中加入试剂2的物质NaHC0315g、乙醇胺14g、偏钒酸锂0.6g、NaCl1.3g、叠氮钠0.5g;4.溶液进行充分的搅拌5.最后在两个容器中加入剩余的0.2L的水6.试剂在20度常温下放置1天后放入4度冰箱里保存。实施例41.先取两个一升容器，每个容器加入0.8L的去离子水；2.容器一中加入试剂1的物质乙酸5ml、乙酸钠10.8g、FeC120.001g、Tritonx_1005ml、吐温5ml、叠氮钠0.5g;3.容器二中加入试剂2的物质Na2C0315g、乙醇胺14g、偏钒酸铵0.6g、NaCl1.5g、叠氮钠0.5g;4.溶液进行充分的搅拌5.最后在两个容器中加入剩余的0.2L的水6.试剂在20度常温下放置1天后放入4度冰箱里保存。实施例51.先取两个一升容器，每个容器加入0.8L的去离子水；2.容器一中加入试剂1的物质8乙酸5ml、乙酸钠10.2g、FeC120.003g、Tritonx_1005ml、吐温5ml、叠氮钠0.5g;3.容器二中加入试剂2的物质K2C0318.3g、乙醇胺14.5g、偏钒酸铵0.6g、NaCl1.2g、叠氮钠0.5g;4.溶液进行充分的搅拌5.最后在两个容器中加入剩余的0.2L的水6.试剂在20度常温下放置1天后放入4度冰箱里保存。权利要求一种钒酸盐氧化法检测总胆红素试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂1和试剂2以3∶1的混合比例组成试剂1缓冲液10-200mmol/LFeCl210-100μmol/LTritonx-1000.01-20ml/L两性表面活性剂0.1-10ml/L试剂2碳酸盐10-200mmol/L乙醇胺10-200mmol/L钒酸盐0.5-8mmol/LNaCl10-500mmol/L叠氮钠0.01-0.8g/L。2.根据权利要求1所述的一种钒酸盐氧化法检测总胆红素试剂盒，其特征在于其中所述试剂1中的缓冲液为柠檬酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙酸_乙酸钠缓冲液或邻苯二甲酸_盐酸缓冲液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂1中的表面活性剂为吐温80或吐温20。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂2中的钒酸盐为偏钒酸铵、偏钒酸钠或偏钒酸锂。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂2中的碳酸盐为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸氢铵或碳酸钾。试剂1:缓冲液两性表面活性剂试剂2:碳酸盐乙醇胺钒酸盐NaCl全文摘要本发明公开了一种钒酸盐氧化法检测总胆红素试剂盒。本发明的试剂盒由试剂1和试剂2以3∶1的混合比例组成。本发明通过加入复合物，增加了钒酸的溶解度，在酸性条件下溶解度也不会降低，从而加速了总胆红素的反应。另外，在试剂盒中，加入抗干扰物，提高反应过程中抗坏血酸干扰反应的能力，使得测试的结果与重氮盐法有很好的临床相关性，本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。文档编号G01N33/72GK101776692SQ200910045128公开日2010年7月14日申请日期2009年1月9日优先权日2009年1月9日发明者张跃建,景晟申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星长征医学科学有限公司