专利名称：登革病毒血清学早期诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及登革病毒血清学检测，特别涉及登革病毒血清学早期诊断试剂。
背景技术：
登革病毒(dengue virus, DV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属 (Flavivirus)，分为4个血清型，即登革1、2、3、4型病毒。它可引起登革热(dengue fever, DF)，登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)，其中以登革热最为常见。主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播，近几十 年来，全球登革病毒的流行区域不断扩大。据世界卫生组织估计全球约有2. 5亿人口的健 康受到登革热威胁，每年约有5100万人感染登革病毒，其中约50万人为登革出血热，约2. 5 万例死亡，在流行区域其发病率和病死率均较高。1873年，Monson最早报告我国厦门曾发 生DF感染，其后1 4型DV在我国均发生过流行，流行区域主要集中在广东、广西、云南、 福建、海南等南方地区，在一个地区往往存在不同血清型病毒的交替流行。目前对于登革热的严重临床病例尚无有效的特异性治疗方法，也没有商品化的疫 苗可以应用，但研究表明及早的临床处理可以减少DHF的发病率和病死率。由于多数登革 病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以和其它发热疾病 区分，必须依赖实验室的诊断加以确认。因此加强对登革热病毒感染早期诊断的研究，对于 该病的治疗和控制有相当重要的意义。目前DV感染的实验室诊断，主要有病毒分离、抗体 和抗原检测、基因诊断等。病毒分离仍然是登革热感染诊断的“金标准”，但登革热的病毒血症期很短，因此 病毒分离受到标本采集时间的限制，耗时较长、操作复杂且灵敏度低，达不到快速诊断的目 的。传统的血清学方法主要包括血凝抑制实验、补体结合实验和中和实验，但这些方法大多 敏感性或特异性不高，且操作繁烦，不适用于快速诊断。快速诊断方法包括间接免疫荧光 (IFA)、ELISA、PCR等方法，敏感、特异、快速，适于大量标本的检测。间接免疫荧光法需要经 验丰富的专业人员操作且需配备荧光显微镜，难以在基层推广。PCR技术有较好的敏感性和 特异性，可以用于登革病毒感染的型别鉴别，缺点是登革病毒基因在退烧后一般检测不到， 扩增过程中可能出现污染且需要一定的仪器设备和实验条件，目前难以在基层推广。ELISA 法由于具有敏感性高、快速简便等优点，因而被认为是登革病毒感染的诊断较佳的方案。然 而国外试剂盒价格昂贵，难以在基层普及应用。特别是目前还没有适用于登革病毒感染早 期诊断的试剂盒。DV基因组长约llkb，病毒RNA的5’端和3’端各有一段非编码区，中间是一个开放 读码框架0RF。该开放读码框架包括3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白前体PrM和包膜 蛋白E)和7种非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，5，端有I型帽子结构， 3，端未发现ployA结构。编码E蛋白的E基因由1484个碱基组成，编码大约489 495个 氨基酸，其相对分子质量(Mr)约60kD。E蛋白是DV最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白，构 成病毒颗粒表面的突起。E蛋白在病毒颗粒感染细胞过程中起重要作用，在中性和微碱性条件下，成熟病毒表面的E蛋白以同源二聚体的形式存在，病毒与细胞膜表面受体结合后，以内吞途径入胞，吞噬体所处的内环境的PH值下降，E蛋白构象由同源二聚体变为三聚体结 构。E蛋白构象的变化引起宿主细胞膜和病毒膜的融合，使得病毒基因组进入胞浆。此外， E蛋白还是影响病毒毒力、引起保护性免疫反应和免疫病理损伤的重要结构蛋白。Rey等通 过X线衍射研究表明E蛋白有三个结构域，即结构域I、II和III。结构域I含有约120个 氨基酸残基，分为1 51aa、137 189aa和285 302aa 3个片段，由8个β折叠形成，大 致与病毒的膜平行。结构域II形成指状结构，由52 135aa和190 284aa组成，与蛋白 的二聚体形成及病毒和细胞膜的融合相关。结构域III(EIII)为IgG免疫球蛋白样折叠， 包括E蛋白303-395aa，在介导病毒与宿主受体结合中具有重要的作用。发明人利用大肠杆菌表达系统表达了 1-4型DV的EIII蛋白，进行了纯化，并将 1-4型DV的EIII蛋白基因串联后融合表达纯化，制备了 1-4型抗EIII蛋白的抗血清，并以 重组EIII抗原和rEIII融合重组蛋白为基础，研究了上述重组蛋白在登革热血清学早期诊 断中的应用，以期探索一种较好的Mac-ELISA方法用于登革病毒感染的早期诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于登革病毒感染的血清学诊断试剂。为实现上述目的，本发明首先利用大肠杆菌表达系统制备了 1-4型DV的E蛋白 第三结构域(EIII)蛋白，并将1-4型DV的EIII蛋白基因串联后融合表达纯化，将得到的 EIII蛋白和融合蛋白rEIII用于血清学检验，发现其具有良好的抗原性，特别是融合蛋白 rEIII，其免疫原性显著高于其它重组蛋白。具体地，本发明通过提取登革病毒RNA并逆转录获得1-4型DV的EIII基因，通过 融合PCR的方法将DV1-4型的EIII基因片段连接后获得融合基因rEIII，分别将1_4型登 革病毒的EIII基因编码序列及rEIII融合基因克隆至原核表达载体pET30a。使用大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白，成功表达了 1-4型EIII重组蛋白及 rEIII融合蛋白，SDS-PAGE可溶性分析结果显示表达形式为包涵体。通过稀释复性的方法 在蛋白复性液中加入精氨酸和谷胱甘肽氧化还原体系促进蛋白复性，在使用金属螯合层析 及弱阴离子交换纯化了表达的重组蛋白。SDS-PAGE结果显示纯化后的蛋白有较高的纯度， Western blot结果显示表达的重组蛋白均能于登革热感染病人血清发生特异性反应，具有 良好的抗原性。进一步，本发明用标记酶标记1-4型DV的EIII重组蛋白及rEIII融合蛋白作为 标记抗原，用抗IgM抗体作为捕获抗体，建立Mac-ELISA检测法，用于登革热感染病人血清 检测，结果显示该方法具有良好的特异性和较高的准确率。在本发明实施例中，采用改良过碘酸盐氧化法分别将1-4型DV的EIII重组蛋白 及rEIII融合蛋白进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，酶标抗原经分子筛纯化。以HRP标 记的1-4型重组EIII蛋白为检测抗原的EIII-ELISA法和以rEIII融合蛋白为检测抗原 的rEIII-ELISA法。通过棋盘法确定最佳的酶标抗原稀释度和血清稀释度后，以IFA和 panbio试剂盒串联检测的结果为参照，EIII-ELISA的灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测 和阴性预测值分别为 86. 21%,98. 21%,0. 8442,96. 15%和 93. 22%, rEIII-ELISA 法分别 为93. 10%,100%,0. 9310,100%,96. 55%，可见rEIII在灵敏度、特异性等方面显著高于其它EIII重组蛋白EIII-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为 91. 95%和88. 50%，rEIII-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符 合率分别为95. 40%和90. 80%。用本发明方法检测5份乙脑I gM阳性血清、20份流行出血热病人及70份健康人血 清结果均为阴性，说明本发明试剂盒的特异性均较好。基于此，本发明将rEIII融合蛋白应用于登革病毒感染的血清诊断，制备登革病 毒感染的免疫诊断试剂。本发明中所述的免疫诊断试剂是以rEIII重组融合蛋白为基础，包括但不限于用 于胶体金免疫层析法、化学发光酶联免疫分析、Luminex液相芯片的试剂。此外，可以进一步将上述试剂与适当的其它辅助试剂组装成试剂盒，以方便使用。优选，本发明提供一种ELISA检测试剂盒，其是以IgM-μ链抗体作为捕获抗体，以 重组融合蛋白rEIII为标记抗原的Mac-ELISA检测试剂盒。本发明还提供一种制备上述重组融合蛋白的方法，包括通构建表达rEIII的重组 表达载体，将所述载体导入宿主，培养宿主表达rEIII重组蛋白。具体地，本发明的rEIII重组融合蛋白，其是将DV病毒1 4型EIII结构域通过 柔性linker串联起来得到的融合蛋白。这种linker通常选用G和/或S组成的氨基酸链， 也可以连用几个G。G的侧链比较小，不会形成空间阻碍。在本发明实施例中柔性linker 采用的是GGGGSGGGG氨基酸链，融合蛋白rEIII的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本领 域技术人员可以根据上述氨基酸序列，根据宿主的密码子偏爱性设计恰当的基因序列，在 本发明实施例中，根据大肠杆菌密码子的偏爱性设计合成了如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸 序列，用于融合蛋白rEIII的重组表达。通过上述技术方案，本发明为登革病毒感染的血清学检测提供了新的思路，利 用本发明诊断试剂可以对登革病毒感染进行有效的诊断，特别的是通过本发明提供的 Mac-ELISA诊断试剂盒可以有效用于登革病毒感染的早期血清学诊断，该诊断试剂具有良 好的特异性和灵敏度，操作简单，适合广泛推广使用。
图1显示的是PCR扩增DV EIII基因的凝胶电泳图，其中M :DNA Marker (DL2000)； 1 :DV1-GZ01/95EIII 基因；2 :DV2_ZS01/01 EIII 基因；3 :DV3-H87EIII 基因；4 DV4-H241EIII 基因。图2显示的是双酶切鉴定DV EIII-pET30a重组质粒，其中M =DNA Marker (DL2000) ；1 :DV1_GZ01/95EIII pET30a ；2 :DV2-ZS01/01EIII pET30a ；3 :DV3_H87 EIIIpET30a；4 :DV4-H241EIII pET30a。图3显示的是SDS-PAGE分析1 4型重组EIII蛋白在大肠杆菌中的表达情况， 其中 M 分子量标准；1 :DV1-GZ01/95EIII 蛋白；2 :DV2-ZS01/01EIII 蛋白；3 :DV3-H87EIII 蛋白；4 :DV4-H241EIII蛋白；5.阴性对照。图4显示的是DV2-ZS01/01-EIII-pET30a重组蛋白的可溶性检测，其中M 蛋白分 子量标准1 超声破碎的裂解液沉淀，2 超声破碎的裂解液上清。
图5显示的是重组EIII蛋白经亲和层析(a)和弱阴离子交换纯化(b) SDS-PAGE 结果，其中M 分子重量标准；1 :DV1-GZ01/95EIII蛋白；2 :DV2-ZS01/01EIII蛋白；3 DV3-H87EIII 蛋白；4 :DV4-H241EIII 蛋白。图6显示的是Western Blot分析登革1 4型重组EIII蛋白，其中M 分子重 量标准；1 :DV1-GZ01/95EIII 蛋白；2 :DV2-ZS01/01EIII 蛋白；3 :DV3-H87EIII 蛋白；4 DV4-H241EIII蛋白；5.阴性对照。 图7显示的是融合PCR扩增rEIII基因的凝胶电泳图，其中，M =DNA Marker (DL2000) 1 :DV1_GZ01/95EIII 基因；2 :DV2-ZS01/01EIII 基因；3 :DV3_H87 EIII 基 因；4 :DV4-H241 EIII 基因 5 :DVl/3 EIII 基因 6 :DV4/2EIII 基因 7. rEIII 基因。图8显示的是酶切鉴定重组rEIII表达质粒，其中M :DNA Marker(DL2000) 1 rEIII-pET30a。图9显示的是SDS-PAGE分析重组融合rEIII蛋白在大肠杆菌中的表达，其中M 分子重量标准；1.阴性对照2. rEIII蛋白图10显示的是重组rEIII蛋白经亲和层析和弱阴离子交换纯化SDS-PAGE结果， 其中M 分子重量标准；1 经Ni-NTA纯化后的rEIII蛋白；2 经ANX弱阴离子交换纯化后 的rEIII蛋白。图11显示的是Western Blot分析重组rEIII融合蛋白，其中M 分子重量标准； l.rEIII蛋白；5.阴性对照。图12显示的是使用不同酶标抗原对DV感染病人血清IgM抗体检测结果。图13显示的是EIII-ELISA法血清和酶标抗原稀释浓度棋盘滴定结果分析。图14显示的是rEIII-ELISA法血清和酶标抗原稀释浓度棋盘滴定结果分析。图15显示的是EIII-ELISA法(A)与rEIII-ELISA法⑶检测登革血清ROC曲线 图。在上述附图中Mr表示相对分子量，具体是指分子的平均原子质量与核素12C原子 质量的1/12之比。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1重组登革病毒E蛋白结构域III以及rEIII的表达材料和方法1. DV 1 4型EIII结构域以及rEIII融合重组表达载体的构建1. 1DV1-4型EIII区基因片段以及rEIII编码基因片段的获得本例中通过提取登革病毒RNA并逆转录获得1-4型DV的EIII基因，当然，本领域 技术人员可以通过公开的EIII结构域序列人工合成DVl 4型的EIII区基因片段以及 rEIII编码基因片段。1. 1. IcDNA 的获得
C6/36细胞使用1640生长液培养(含有30% eagle' s, 10%胎牛血清，1 %双抗， 谷氨酰胺)，于28°C，5% C02条件培养待细胞长成单层时，分别接种1-4型标准株登革
病毒(四型登革病毒标准株1型GZ01/95株、2型ZS01/01株、3型H87株、4型H241，中国疾 病预防控制中心病毒病所)。静置吸附lh，吸去上清，加入1640维持培养液(30% eagle's, 1 %双抗，1 %谷氨酰胺)，继续培养4-5天。 用Trizol LS Reagent (Invitrogen)参照说明书分别提取 DV1-4 型 RNA，使用 Invitrogen公司的SuperScript III第一链合成试剂盒进行RT反应，具体过程如下 在 0. 2ml PCR 管中力口入细胞总 RNA(10pg-5y g,8y 1)、Random hexamers (50ng/μ 1，1 μ 1) 以及dNTPs Mix(10mM, 1 μ 1)65°C温育5分钟，迅速放至冰浴至少1分钟，加入10 μ IcDNA Synthesis Mix(10XRT Buffer 2 μ 1,0. IM DTT 2 μ U40U/y 1 RNaseOUT Ιμ 、 25mMMgCl24 μ 1 以及 SuperScript IIIRT 1 μ 1) 25°C温育 10 分钟，在 50°C反应 50 分钟，最 后85°C处理5分钟终止反应，加入1 μ 1 RNase H，轻柔混勻，37°C温育20分钟，得到cDNA。1. 1. 2DV 1-4型EIII结构域基因片段的扩增分别设计4对引物用于扩增DV标准株1-4型E基因的第三结构域片段，引物设计 如表1所示。表1扩增1-4型登革EIII所用引物
、-
引物_Sequence 5'- 3，_
D1EIII-F GGAATTCCATATGTCATATGTAATGTGCAC
D1EIII-R CATTGCATAGCTCATaccgccaccgccgctaccgccaccgccTTTCCCTATACTGCT D2EIII-F ATGTCATATTCTATG
D2EI1I-R CCGCTCG AGTTAATGGTGATGGTGATGGTG TTGGCCA.ATAGAGCT D3EIII-F GGAATTCCATATGTGCTTGAATACCTTTGTGT
D3EIII-R CCGCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGCTTCCCAATCGAGCTTCCC D4EIII-F GGAATTCCATATGTGCTCAGGAAAGTTCTCAA
D4EIII-R CCGCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGCTTGCCAATGGAACTCCCT -—_. \分别以上述获得的DV1 4型cDNA为模板，以相应的表1中的引物扩增DV标准 株1-4型E基因的第三结构域片段。反应体系如下IOmMdNTP1. 5μ 1上游引物，10μ M1. 5μ 1下游引物，10μ M1. 5μ 1cDNA 模板2 μ 1IOXBuffer5μ 1PfxDNA 聚合酶0· 5 μ 1MgS0450mM1 μ 1双蒸水37 μ 1
_总体积50 μ 1反应程序为94°C30sec ；94°C 15sec, 55°C 30sec,68°C 3min, 30 个循环；最后 68°C 延伸10分钟。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。1. 1. 3rEIII融合蛋白基因片段的获得根据融合PCR引物设计原则，设计4对可将DV1-4型EIII基因融合扩增的引物， 具体引物序列如表2所示。表2DV1-4型EIII结构域蛋白的融合表达所用引物
权利要求
一种重组融合蛋白rEIII，其包括登革病毒1、2、3和4型的EIII结构域。
2.如权利要求1所述的重组融合蛋白rEIII，其特征在于，所述登革病毒1、2、3和4型 结构域由柔性linker连接。
3.如权利要求2所述的重组融合蛋白rEIII，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
4.权利要求1 3任一项所述重组融合蛋白在制备登革病毒感染诊断试剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂为登革病毒感染早期诊断试剂。
6.编码权利要求1 3任一项所述重组融合蛋白rEIII的核苷酸。
7.含有权利要求1 3任一项所述重组融合蛋白的免疫诊断试剂。
8.登革病毒感染诊断试剂盒，其为以IgM-μ链抗体作为捕获抗体，以权利要求1 3 任一项所述重组融合蛋白rEIII为标记抗原的Mac-ELISA检测试剂盒。
9.如权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述标记抗原为HRP标记抗原。
10.权利要求1 3任一项所述重组融合蛋白rEIII的重组表达方法，包括构建表达 rEIII的重组表达载体，将所述载体导入宿主，培养宿主表达rEIII重组蛋白。
全文摘要
本发明提供了登革病毒血清学诊断试剂，具体地是将登革病毒1、2、3和4型的EIII结构域串联得到重组融合蛋白rEIII，用于登革病毒感染的血清学诊断。此外，本发明还提供了适用于登革病毒感染的早期诊断试剂盒。本发明为登革病毒感染的血清学检测提供了新的思路，利用本发明诊断试剂可以对登革病毒感染进行有效的诊断，特别的是通过本发明提供的Mac-ELISA诊断试剂盒可以有效用于登革病毒感染的早期血清学诊断，该诊断试剂具有良好的特异性和灵敏度，操作简单，适合广泛推广使用。
文档编号G01N33/569GK101962411SQ20091009001
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月24日 优先权日2009年7月24日
发明者张全福, 李建东, 李德新, 梁米芳, 王晓芳, 陆鹏 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所