生物传感器的制作方法

专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及用免疫学的测定方法分析液体试样中的分析对象物的作为片状分析 设备的生物传感器。
背景技术：
随着近年以来家庭护理、医院和诊所等社区医疗的充实，并伴随着早期诊断和 急性临床检查的增加等，非临床检查的专家也希望用上可实施简易、快速、高精度的测 定的分析设备。因此，无需复杂的操作就能够在短时间内完成可靠性高的测定的面向 POCT(即时检查，PointofCareTesting)的小型分析设备登场了。POCT—般是在开业医生、专科医生的诊所、病房和面向外来患者的诊所等 “近患者”场所进行体检的总称，作为医师当场判断体检结果、实施迅速处置、通过医
疗过程及预后的监控使得诊疗质量大大提高的方法备受瞩目。这种利用小型分析设备的 检查与中心体检室的检查相比，在检体的搬运、设备维护上省钱得多，更省却了不必要 的体检费用，压缩了总体检费用。在医院经营高度合理化的美国，POCT市场发展得很 快，预料在日本为首的全世界范围内都有市场。作为以免疫色谱传感器为代表的干式分析单元的生物传感器不需要试剂的调 整，只需简单地将作为测定对象的血液和尿等液体试样从生物传感器上滴下等简单的操 作，就可分析该液体试样所含的分析对象物，对于简单迅速地分析该液体试样中的分析 对象物非常有用，作为POCT的代表，今天已被大量实用化了。利用抗原抗体反应的免疫色谱传感器(以下，简称色谱传感器)的感知反应是靠 高度的特异性和超强的结合力来进行的，因此在以极低浓度存在的生理活性物质的分析 中显示了比其它的传感器出色的特性。今天，利用这个原理市场上出现了妊娠诊断药、 癌症标记诊断药、心肌标记诊断药等多种诊断药物。关于色谱传感器的构成，专利文献1揭示了以下的检验装置在同一平面上， 即在1张平板形状的固形支承体中，物质流动在能够互相以毛细管流连接的多个部分(区 域)，测定液体试样中是否有被分析体存在。又，专利文献2和专利文献3揭示了以下分析设备检出或测定在液体中存在的 具有免疫学结合特性的1对组合中的一方的成分。前述的专利文献1 3的方法均叙述了有关具备特异性反应的免疫学检验设备的 构成，该设备由利用毛细管力(毛细管现象产生的力)可使液体试料移动的材料构成。例 如专利文献1中，在平板形状的固形支承体上设有保持与分析对象物发生特异性反应的 示踪剂的区域(第1部分)和保持与分析对象物或示踪剂特异结合的结合体的区域(第2 部分)，这些区域(第1部分和第2部分)的特征是，存在于同一平面的固形支承体上， 形成为可互相靠毛细管流的连接的构成。另，在专利文献2和专利文献3中，这些区域 还具备以下特征相对于液体试样的流动方向互为前后地配置，且通过这些区域的边缘 互相为可吸收的接触状态的1个或1个以上碎片组成的片状区域，与固形支承体一起构成特征。这些专利文献1 3所代表的色谱传感器的一般构成的例子如

图14A 图14C、 图15A、图15B所示。色谱传感器的一般构成是在PET片等基板1上设置有展开流路 2、标记试剂保持部4、试样添加区域5和吸水部6，展开流路2由硝化纤维素或玻璃纤维 滤纸等多孔载体形成，部分展开流路2中设有将与分析对象物或示踪剂发生特异性反应 的试剂固定化的试剂固定化部3 ；标记试剂保持部4为使标记与分析对象物及固定化试剂 发生特异性反应的试剂的标记试剂易随着液体试样的渗透溶出而将其保持于液体透过性 材料；试样添加区域5用于添加液体试样，被设置在标记试剂保持部4上或较标记试剂保 持部4位于色谱传感器的展开方向的上游侧的位置；吸水部6用于在色谱展开方向的下游 区域对展开的液体试样进行吸水。在基板1的上面，从色谱展开方向的上游侧依次开始 试样添加区域5的下游端部与标记试剂保持部4的上游端部接触，标记试剂保持部4的下 游端部与展开流路2的上游端部接触，展开流路2下游端部与吸水部6的上游端部接触。 这里，基板1以外的传感器构成部件(试样添加区域5，标记试剂保持部4，展开流路2及 吸水部6)全部用液体透过性材料构成。大多数情况下，该色谱传感器如图15A，图15B 所示形成为以下构成试剂固定化部3和试样添加区域5以一部分外露的状态被收纳在设 有试样添加部50和结果确认窗52的由液体不透过性材料形成的中空套管51内部。对于该色谱传感器的液体试样等的流动及测定原理进行说明。首先，向中空套 管51的试样添加部50添加液体试样。被添加的液体试样通过试样添加部50，利用来自 各色谱传感器构成材料的毛细管现象吸水展开。从试样添加区域5展开并到达了标记试 剂保持部4的液体试样，一边溶出标记试剂，一边继续向下游方向展开，在展开流路2内 展开时通过试剂固定化部3，向更下游展开后到达吸水部6被吸水。如果液体试样中含 分析对象物的话，该分析对象物到达标记试剂保持部4的时候，首先，因跟标记试剂的 特异结合反应而形成“标记试剂-分析对象物的复合体”。该“标记试剂-分析对象物 的复合体”与液体试样一起展开至展开流路2，再到达试剂固定化部3。在试剂固定化 部3中，“标记试剂-分析对象物的复合体”与固定化试剂一起发生特异结合反应，形成
“标记试剂-分析对象物-固定化试剂的复合体”。并且，在试剂固定化部3中，与分 析对象物的浓度相适应的标记试剂的呈色反应可从结果确认窗52得到确认。代表该构成 的一般的色谱传感器在医院和一般家庭有着广泛的市场。这里，作为免疫反应的例子， 以形成“标记试剂-分析对象物-固定化试剂的复合体”的三明治反应为例叙述了测定 原理，但也常用到竞合反应。在色谱传感器的构成中，为了有利于液体试样的移动和保持展开了的液体试 样，将由对液体进行充分吸水的材料构成的吸水部6与展开流路2邻接设置。此外，如 果添加了液体试样，则标记试剂尽可能快且完全地从标记试剂保持部4释放并随着液体 的流动而移动是很重要的，因此，明确标记试剂保持部4的构成材料适用多孔性材料和 纤维材料。作为具体例，构成标记试剂保持部4的材料多用纸、羊毛、多孔性塑料层或 膜。但是，上述构成材料中保持的标识试剂因为渗透到材料深部，所以大多数情况下不 易溶出足够的液体试样，并且，由于干燥状态的构成材料和标记试剂的非特异吸附，保 持的标记试剂难以完全溶出，这样色谱传感器每次的标记试剂的溶出程度各不相同。因 此，使用免疫色谱传感器进行定量测定时，存在得不到高精度的问题和无法进行高灵敏度测定的问题。在图15A，图15B所示的现有的一般的色谱传感器中添加液体试样时液体试样 在色谱传感器上的展开情况用图16A 图16F进行说明(另外，在图16B 图16F中，只 显示了色谱传感器，省略了中空套管51)。首先，如图15A，图16A所示，用分配器或玻 璃吸管等用具(或注射器54)，往试样添加部50添加液体试样(图15A，图16A中，为血 液样品S)(步骤1)，如图16B所示，液体试样渗入扩展到整个试样添加区域5 (步骤2)。 乳化，如图16C所示，保持于试样添加区域5的液体试样展开到标记试剂保持部4(步骤 3)。这时，与液体试样的展开前端部接触的标记试剂很快地溶解，如图16D所示，溶出 的标记试剂与液体试样流一起展开。在液体试样展开的过程中，分析对象物和标记试剂 之间形成复合体，与液体一起移动。标记试剂被液体试样冲刷着溶解、溶出，如图16E 所示，拓展展开流路2，通过试剂固定化部3，在步骤5，如图16F所示，拓展至吸水部6 吸水(步骤6)。这样，标记试剂越靠液体试样的展开前端部越浓，能够与标记试剂接触 而形成复合体的分析对象物大部分在液体试样中的展开前方部分，展开后方的液体试样 中几乎不存在标记试剂，只有未反应的分析对象物展开。如前所述的色谱传感器的构成中，用色谱传感器进行评价的最后的液体试样实 际上不是整个的液体试样，不过是判断所添加的液体试样的一部分中分析对象物是否存 在或其存在量而已。因此，在液体试样中存在高浓度的分析对象物时完全有可能将其 检测出来，但在分析对象物是低浓度的情况下，全部的标记试剂和分析对象物的反应极 为良好的话虽然也能检测出来，但是基于以上的理由，现有结构的色谱传感器中不可能 很好地检测出，存在无法进行分析对象物的高灵敏度区域(纳米分子区域和皮可分子区 域 更低浓度区域)的检测的问题。如上所述，在现有构成中，因为有标记试剂不能完全溶出的问题和无法在液体 试样中均勻扩散、展开的问题的存在，所以在使用色谱传感器进行定量测定时，不但不 能精确测定，还存在着无法进行高灵敏度测定的问题。由于基板1以外的传感器构成部件全部是由玻璃纤维滤纸和多孔质膜等液体透 过性材料构成的，所以液体试样渗入到各传感器构成部件且被保水，产生不向下游侧流 出的液体量(死体积(dead volume))。因此，在现有的色谱传感器中，至少把在各传感 器构成部件保水的死体积也纳入了考虑之中，必须要添加大量的液体试样，如果液体试 样是血液等的话，则因该血液等的量微而无法测定。在专利文献4中揭示了具备在展开层的一部分形成有作为通过毛细管现象流入 的空间的间隙部的空间形成部的生物传感器。这里，试样添加部的空间是被液体不透过 性材料包围而形成的，所以能够保持一定量的液体试样。但是，标记试剂因为只在展开 层的一部分中形成，不能充分削减检体量，并且液体试样的展开所引起的标记试剂的溶 解及溶出的图形与专利文献1 3相同，所以不能达到改善专利文献1 3中的标记试剂 的溶出及展开情况的目的。专利文献1专利文献2专利文献3专利文献4
日本专利公报第2890384号 日本专利特公平7-78503号公报 日本专利公报第2504923号 日本专利公报第3553045号
发明的揭示如前所述，上述专利文献1 4所示的方法的把免疫反应作为基础的生物传感器 中，基本上除基板1以外的传感器构成部件都是由通过毛细管流(毛细管现象造成的流 动)形成互相可连通的状态的液体透过性材料构成的。本发明的思路是利用这些构成材 料的构成零部件及构成本身，简易迅速地分析液体试样中的分析对象物，这些技术使得 在今天的医疗现场实施诸多检查成为了可能。但是，在图14A 图14C、图16A 图16F所示的现有的一般的色谱传感器中， 液体试样为血液样品S时，一般必须用注射器54进行采血，由注射器54直接大量地添加 血液样品S，或用分配器或玻璃吸管等用具添加全血或血浆及血清。因此，对色谱传感 器的试样添加非常麻烦，作为简易迅速测定的POCT检查，的操作简单化就成为非常重 要的课题。又，所有的专利文献的发明中，标记试剂都是被多孔质材料等液体透过性材料 所保有。标记试剂在液体试样的展开的同时迅速溶出，在展开前端部以非常高的浓度存 在并展开，但存在保有的标记试剂不能完全溶出、保持载体中残留有数％ 数10%的标 记试剂的问题。另外，残留的标记试剂量因各生物传感器而异，通过试剂固定化部的标 记试剂量在各生物传感器之间不是一定的，即使分析对象物的量相同，显色也会在程度 上有差异，所以很难实现采用生物传感器的高精度定量测定。另外，被展开的标记试剂并不是向着所添加的全部液体试样扩散并与分析对象 物进行反应，而是停留在与展开前端部的一部分液体试样一起流出、与一部分的分析对 象物进行反应的程度，所以很难对低浓度的分析对象物进行检测，无法实现必须进行纳 米分子和皮可分子及更低浓度的浓度区域的检测及定量的高灵敏度测定。由于基板1以外的传感器构成部件用液体透过性材料构成，所以展开的液体试 样被各传感器构成部件材料保水而产生检体损失(死体积)。在液体展开中起着B/F分 离(与抗体结合的抗原和与抗体没结合的抗原的分离)作用的色谱传感器为了充分的展开 (B/F分离)，必须添加过剩的液体试样，在把检体量过剩的尿作为液体试样的场合虽然 没有问题，但是想检测血液中的分析对象物时，必须从上臂采集必须量以上的血，这就 不能称为简易迅速的检查体制。要解决这些问题，以更微量的液体试样(微量检体)实现准确且高精度、高灵敏 度的定量测定，重要且必须的要素是提供下述作为免疫色谱传感器的生物传感器死体 积小、可100%溶出标记试剂和其它的反应试剂、全部液体试样的分析对象物可反应的免 疫色谱传感器。作为液体试样添加血液样品S时，血液中存在的血细胞成分(特别是红血球)有 时会妨碍结果的确认且血细胞成分无法在展开流路中展开，因此使用现有的色谱传感器 或生物传感器时，必须采用预先进行离心分离等操作以除去血细胞成分而仅将血清或血 浆成分添加至试样添加部的方法，或必须在试样添加区域与展开流路之间设置可过滤血 细胞成分的血细胞过滤材料。本发明是以上述课题为鉴而完成的发明，其目的是提供下述准确且高精度、高 灵敏度的作为免疫色谱传感器的生物传感器，在实现以免疫反应为基础的生物传感器的 测定精度的提高的同时，不破坏现有的免疫色谱传感器所具备的便利性，无论什么时候什么场合谁都能测定，而且能实现以微量的血液等液体试样进行的测定。该生物传感器 即使不用分配器或玻璃吸管、注射器等，也能把作为一定量液体试样的血液良好地保持 且完全溶出标记试剂和其它的反应试剂，同时可大幅度削减所添加的血液的量，做到微 量化，而且可使标记试剂以均勻的状态溶出的血液很好地流入展开流路。为了解决上述课题，本发明的生物传感器包括添加液体试样的试样添加部、与 液体试样进行反应的反应试剂、展开混有反应试剂的液体试样或与反应试剂进行了反应 的液体试样的展开流路，用于测定液体试样中是否存在分析对象物或其浓度的生物传感 器，其特征在于，所述试样添加部通过用由液体不透过性材料形成的空间形成材料包围 添加空间而构成，所述反应试剂以可在添加于添加空间的液体试样中溶出的状态被保持 在所述试样添加部的空间形成材料的面向添加空间的位置，所述展开流路由所述试样添 加部内的液体试样和所述反应试剂可通过毛细管力而移动的材料构成，测定区域被配置 于展开流路的一部分。根据该构成，形成试样添加部的添加空间的空间形成材料由液体不透过性材料 形成，试样添加部保持的液体试样回避了被试样添加部保水，使得展开流路朝其展开方 向下游区域不停顿地展开成为可能，消除了在试样添加部停滞的死体积，大大地减少了 测定所必需的液体试样。这里的液体不透过性材料是指液体不浸润到该材料的内部的材料，例如可例举 例如ABS、聚苯乙烯、聚氯乙烯等合成树脂材料，此外还可例举金属，玻璃等。同时， 纸等液体可浸润至材料内部的液体透过性材料，如果在其表面涂抹树脂或膜等或作防水 加工等处理的话，也能归入防液体浸润的材料。又，展开流路具备通过毛细管力液体可移动的任意材料或构成即可，例如可举 出在微细空间形成的流路、形成有微细柱子(纳米柱子)的微细流路、多孔质膜和玻璃纤 维滤纸等任意的液体透过性材料，优选该展开流路是单层的结构，也可以采用以硝化纤 维素为代表的膜片过滤器或玻璃纤维滤纸、纤维素滤纸、用液体不透过性材料等形成的 微细流路等。根据上述的构成，反应试剂保持在由液体不透过性材料形成的空间形成材料所 构成的添加空间，因此所保持的反应试剂滞留在载体材料中或不被吸附而全部溶出，结 果，反应试剂的溶出程度大体上一定，过去的“反应试剂溶出多时灵敏度高”、“反应 试剂溶出少时灵敏度低”的产生灵敏度差的现象不见了，测定结果变得稳定。由此，可 得到更准确、高精度、高灵敏度的测定结果。反应试剂包括例如与液体试样反应的改性剂、酶反应所必须的任意的试剂、与 分析对象物及固定化试剂可发生特异性反应的具有示踪剂的标记试剂等。这里所谓的示 踪剂是指配体部分及与该配体部分结合的可测出的标记部分。可测出的标记可以是多种 多样的可测出的任意的标记，在本发明的优选方式中，可使用各种的色原体，如荧光性 物质、吸收性色素和发光物质，不溶性粒状载体，例如金属胶体和乳胶粒子等，还可使 用酶。所谓“与反应试剂反应的液体试样”是指与液体试样中的分析对象物和示踪剂反 应的状态，或者是指液体试样中任意的成分与反应试剂中任意的试剂反应的状态。作为测定区域，可以是一个或一个以上的任意数量的区域，任何场合均无问 题。展开流路具备靠毛细管力使得液体可移动的任意材料或构成，例如用微细空间形成的流路、形成有微细柱子(纳米柱)的微细流路、多孔质膜和玻璃纤维滤纸等任意的液体 透过性材料，不过展开流路最好为单层。本发明的生物传感器的特征是，反应试剂被配置于试样添加部的与展开流路的 延长线上的面不同的位置。又，本发明的生物传感器的特征是，展开流路沿作为支承体 的基板的表面配置，反应试剂被保持在空间形成材料的与上述基板的表面隔开距离对置 的上表面背面。这样，将反应试剂配置在试样添加部的与展开流路的延长线上的面不同的位 置，或被保持在空间形成材料的与上述基板的表面隔开距离对置的上表面背面，与反应 试剂被配置在试样添加部的展开流路的延长线上的面时相比，反应试剂能够以更均勻地 溶出于在试样添加部中添加的液体试样的状态被导入展开流路，获得更准确且高精度、 高灵敏度的测定结果。即，将反应试剂配置在试样添加部的展开流路的延长线上的面 时，由于保持反应试剂的地方和展开流路接触而极为接近，因此反应试剂刚溶出于液体 试样时的不均勻状态的液体试样就导入展开流路，这样可能会引起精度或灵敏度的降 低，但上述的构成能抑制这种不良情况的发生。这里，试样添加部的与沿着展开流路的厚度方向的该展开流路的延长线上的不 同位置是指例如沿着试样添加部的底面部分配置展开流路时，围着试样添加部而形成的 罩等空间形成材料的底面部分上方略偏的上表面背面或底面部向上延伸的侧面等位于与 展开流路的同一面的底面部以外的任意面。本发明的特征是，在基板上设置有作为规定添加空间厚度的间隔物发挥作用的 辅助基板。根据此构成，添加空间中可能保有的体积不单单可用添加空间的长度和宽度来 规定，也可通过起到间隔物功能的辅助基板的厚度来规定，变更辅助基板的厚度，可实 现能够保持各种体积的生物传感器。因此，在可进一步简化生物传感器的构造的同时能 够将生物传感器的结构的不稳定所造成的反应程度的不稳定极小化，从而实现更高精度 的测定。本发明的生物传感器的特征是，在空间形成材料上形成促进液体试样向添加空 间的吸引的气孔。根据该构成，通过在空间形成材料上形成气孔促进添加空间吸引液体试样，可 提高添加空间的毛细管力，给添加空间添上血液等液体试样的同时，添加空间内能很快 地吸引液体试样，使得一定量的液体试样更切实地在一瞬间被保持在添加空间，把添加 液体试样不足这样的情况的发生频率降到最低。又，本发明的生物传感器的特征是，测定区域由固定有可与分析对象物或反应 试剂发生特异性反应的试剂的试剂固定化部形成。又，本发明的生物传感器的特征是，反应试剂包含可与分析对象物或固定化试 剂发生特异性反应的标记试剂。根据此构成，因为反应试剂含标记试剂，所以液体试样与反应试剂一接触，标 记试剂就很快地溶解或水合，能与液体试样中的分析对象物反应。标记试剂和液体试样 反应后展开在展开流路，因此标记试剂能与分析对象物切实地反应，反应后的液体试样 通过试剂固定化部，可使试剂固定化部的反应也实现均一化，所以因反应不稳定而产生的测定偏差可得到改善，实现更高精度的测定。又，本发明的生物传感器的特征是，标记试剂中可与分析对象物或固定化试剂 发生特异性反应的试剂被标记于不溶性粒状标记物。此外，本发明的生物传感器的特征是，不溶性粒状标记物选自着色聚合物珠子 (beads)、金属、合金及聚合染料粒子。又，本发明的生物传感器的特征是，特异性反应为抗原抗体反应。根据此构成，生物传感器利用了抗原抗体反应等特异性反应，抑制了试样添加 部的液体试样的损失，使得用微量液体试样进行检测成为可能，载有标记试剂等的反应 试剂能充分溶解、流出，能将反应试剂很好地扩散至全部的液体试样使之反应。本发明的生物传感器的特征是，反应试剂是标记试剂以外的试剂。根据此构成，反应试剂因为是标记试剂以外的试剂，所以在反应系不需要示踪 剂，例如在H bAlc的测定中可实施血红蛋白的定量等的情况或标记试剂为酶的情况下， 通常必须将酶反应的底物试剂从后边开始展开，但现在就可以避免这种情况，可以应对 各种反应系。又，本发明的生物传感器的特征是，具有覆盖展开流路的表面的液体不透过性 片材。根据此构成，展开流路表面覆盖着液体不透过性片材，所以从试样添加部展开 的液体试样不会从展开流路表面蒸发、干燥，不但展开流路可展开到色谱下游区域，而 且可切实进行试剂固定化部的B/F分离(将特异性结合反应形成的复合体与没有反应的物 质进行分离)，因此能够进行更准确的测定，实现更高灵敏度和更高精度的测定。又，本发明的生物传感器的特征是，液体不透过性片材覆盖从试样添加部的添 加空间的一部分或近旁开始至少至试剂固定化部为止的范围。根据此构成，展开流路的设有试剂固定化部的位置的表面由液体不透过性片材 覆盖，因此从试样添加部的添加空间展开的液体试样在展开流路的试剂固定化部的表面 无蒸发地很好地展开。又，本发明的生物传感器的特征是，液体不透过性片材在展开流路的下游端部 不覆盖该展开流路。根据此构成，展开流路的下游端部，即，展开流路的试剂固定化部的下游的不 被液体不透过性片材覆盖的位置，由于展开液的蒸发干燥，不仅促进了液体试样从色谱 上游区域向下游区域的展开，而且可使试剂固定化部的B/F分离切实地完成，这样能够 进行更准确的测定，实现更高灵敏度和更高精度的测定。又，本发明的生物传感器的特征是，展开流路的沿流动方向的两个侧面被覆盖 或密封。根据此构成，由于展开流路的沿流动方向的两个侧面被覆盖或密封，所以能够 阻碍液体试样从两个侧面蒸发、干燥，并可促进容易溢至展开流路的两侧部分的液体试 样向色谱下游区域方向的展开。其结果是，可实现液体试样的展开的均一化，能够将液 体试样的展开的混乱所引起的反应不稳定的程度极小化，从而实现更高精度的测定。又，本发明的生物传感器的特征是，液体试样是血液样品。又，本发明的生物传感器的特征是，反应试剂包含细胞收缩剂，该细胞收缩剂与血液样品中的血细胞成分反应，使得血液样品以血细胞成分收缩的状态在展开流路中 展开或于血细胞成分收缩的同时在展开流路中展开。根据本发明的上述构成，通过在反应试剂中加细胞收缩剂或负载含细胞收缩剂 的混合试剂，血液样品中的血细胞成分在与作为反应试剂的细胞收缩剂接触的时候迅速 收缩，其尺寸被均一化。其结果是，大小不均一的血细胞成分引起的混乱的血液样品的 展开状态变得均一化了，反应程度也实现均一化，进而改善了测定偏差，使更高精度的 测定成为了可能。又，本发明的生物传感器的特征是，在试样添加部的添加空间可利用毛细管力 吸引指尖血。又，本发明的生物传感器的特征是，反应试剂及固定化试剂以干燥状态被生物 传感器保持及固定，并溶于液体试样或与液体试样发生水合。根据此构成，反应试剂及固定化试剂都处于干燥状态，生物传感器成了干燥的 分析单元，搬运和保管方便，无论什么时候在哪里都能使用。又，本发明的生物传感器的特征是，反应试剂以溶液状态被涂在空间形成材料 的内表面后干燥，固定化试剂以溶液状态被涂在展开流路后干燥。又，本发明的生物传感器的特征是，试样添加部的添加空间的吸引容量为10 μ 1 以下。根据此构成，与现有的色谱传感器相比较，可以大幅度削减检体量，用指尖血 等极微量的血液样品即可很好地定性或定量。又，本发明的生物传感器的特征是，上述试样添加部的添加空间被液体不透过 性材料形成的空间形成材料包围而构成，上述展开流路的上游部分从添加空间的一方的 端部侧进入添加空间，上述展开流路的上游端部的进入位置是比形成于上述添加空间的 其它另一端部侧的液体试样吸引用开口部更靠近吸引方向内侧的位置。根据此构成，用于添加一定量的血液样品等液体试样的分配器等用具和保持添 加血液的吸水垫已非必需，仅通过添加适量液体试样的操作就能保持一定量的微量的液 体试样，且可展开分析微量的液体试样。此外，由于展开流路的上游端部仅到达比添 加空间的液体试样吸引用开口部更靠近吸引方向内侧的位置，所以通过上述的开口部吸 引液体试样的时候，首先仅反应试剂在液体试样中溶出混合，然后，反应试剂已经很好 地溶出混合的液体试样或反应后的液体试样流入位于比开口部更靠近吸引方向内侧的位 置，即，流动方向的下游侧的展开流路的上游端部并展开。其结果是，反应试剂呈均勻 状态溶出的液体试样可顺利地流入展开流路，可以良好的精度进行定性或定量。又，本发明的生物传感器的特征是，展开流路被支承于基板上，添加空间作为 所要吸引的空间由与展开流路的上游端部对应的基板的一个端部与覆盖该基板的一个端 部的空间形成材料形成，展开流路具备规定厚度，在添加空间中设有辅助基板，该辅助 基板为了消除或减少与进入该添加空间的展开流路的上游端部和基板之间形成的展开流 路的厚度相当的阶差而对添加空间进行填补，藉此缩小试样添加部的厚度方向的尺寸， 保持毛细管力。根据此构成，设置了辅助基板，藉此由空间形成材料形成的试样添加部利用毛 细管力很好地吸引并保持血液样品等液体试样，能很好地吸引液体试样，不会出现吸引量不足的现象。又，本发明的生物传感器的特征是，展开流路被支承于基板上，添加空间由与 展开流路的上游端部对应的基板的一个端部构成，并作为所要的吸引空间由规定试样添 加部厚度的辅助基板和与基板对置并覆盖基板的一个端部的空间形成材料形成。根据此构成，在添加空间内可保持的体积不仅由添加空间的长度和宽度限定， 还可由辅助基板的厚度限定，变更辅助基板的厚度，可实现能够保持各种体积的生物传 感器。因此，可在进一步简化生物传感器的构造的同时将由生物传感器构造的偏差所导 致的反应不稳定的程度极小化，可实现更高精度的测定。根据上述的本发明，由液体不透过性材料制成的空间形成材料包围添加空间而 构成了试样添加部，所以液体试样不会滞留在试样添加部，能在展开流路展开。所以可 将目前的所添加的液体试样被保持在构成材料中而产生未展开的损失检体(死体积)的情 况的发生概率降到最低限度，其结果是，与现有的色谱传感器比较，可大幅度地削减检 体量(液体试样量)。而且，在试样添加部的添加空间中可由毛细管力吸引指尖血，此 时，添加空间的吸引容量，即，必需的血液量可降至10 μ 1以下。另外，由于反应试剂被液体不透过性的空间形成材料保持，所以反应试剂能够 以不会滞留在作为保持部的空间形成材料或被其吸附的状态完全溶出，这样不仅反应试 剂的溶出变得稳定，而且在添加空间与液体试样接触后溶解并扩展至全部液体试样而进 行反应后，可在展开流路中展开，从而避免了反应试剂的残留及与反应试剂未反应的液 体试样的展开。如上所述，实现了反应试剂的100%的溶出，避免了未反应液体试样的展开。同 时，通过由液体不透过性材料形成的空间形成材料包围而构成添加空间，可提供能实现 更准确且高精度、高灵敏度的测定的可简单迅速测定的生物传感器。另外，通过在试样添加部的与展开流路的延长线上的面不同的位置配设反应试 剂，或将反应试剂保持在空间形成材料的与基板的表面隔开距离对置的上表面背面，反 应试剂能够以更均一地在试样添加部的添加空间中添加的液体试样溶出的状态被导入展 开流路，可得到更准确且高精度、高灵敏度的测定结果。又，通过在基板上配置作为规定添加空间厚度的间隔物发挥作用的辅助基板， 仅改变作为间隔物发挥作用的辅助基板的厚度就能够容易地改变可在添加空间中保持的 血液等液体试样的体积。因此，可在进一步简化生物传感器的构造的同时将由生物传感 器构造的偏差所导致的反应不稳定的程度极小化，可实现更高精度的测定。又，通过在本发明的生物传感器的空间形成材料上设置促进液体试样向添加空 间的吸引的气孔，在向添加空间添加液体试样的同时，使得添加空间能很快地吸引液体 试样，在一瞬间能切实地保持一定量的液体试样，使得液体试样添加不足这样的情况的 发生概率极小化。
又，通过使反应试剂含有可与分析对象物或固定化试剂发生特异性反应的标记 试剂，由于标记试剂与液体试样反应后在展开流路中展开，因此标记试剂能切实地与分 析对象物反应，在试剂固定化部中的反应也能均一化。所以，反应不稳定而产生的测定 偏差也得到了改善，可实现更高精度的测定。又，通过用液体不透过性片材覆盖展开流路的表面，液体试样不会从展开流路的表面蒸发、干燥，展开流路可展开至色谱下游区域。同时，由于在试剂固定化部中的 B/F分离切实进行，所以可完成更准确的测定，从而实现更高灵敏度且高精度的测定。又，通过将展开流路的沿流动方向的两个侧面密封，可促进容易溢至展开流路 的两侧的液体试样向色谱下游区域方向展开，能够将液体试样的展开均一化，从而将液 体试样的展开的混乱所引起的反应不稳定的程度极小化。同时，液体试样为血液时，由于反应试剂中含有细胞收缩剂或包含细胞收缩剂 的混合试剂，所以血液中的血细胞成分与作为反应试剂的细胞收缩剂一接触就很快地收 缩，其尺寸被均一化，使得血液的展开状态也能均一化，从而实现更高精度的测定。又，根据本发明，通过在能够利用毛细管力吸引保持液体试样的添加空间中承 载反应试剂，且将展开流路配置成其上游端部仅进入到比添加空间内的血液液体试样吸 引用开口部更靠近吸引方向内侧的位置，使得在添加空间添加吸引血液样品等液体试样 时，反应试剂很好地溶解于液体试样后流入展开流路的上游端部并展开。藉此，反应试 剂以均一的状态溶出的液体试样能够很好地流入展开流路，可在高精度地进行定性或定 量的同时很好地进行高灵敏度测定。又，通过在添加空间中设置辅助基板，添加空间可使吸引液体试样的毛细管力 很好地发挥作用，这样也能够使定性或定量时的精度提高。该辅助基板为了消除或减少 与进入该添加空间的展开流路的上游端部和基板之间形成的展开流路的厚度相当的阶差 而对添加空间进行填补，藉此减小添加空间的厚度方向的尺寸，保持毛细管力。又，展开流路被支承于基板上，添加空间由与展开流路的上游端部对应的基板 的一个端部构成，并作为所要的吸引空间由规定添加空间厚度的辅助基板和与基板对置 并覆盖基板的一个端部的空间形成材料形成，因此只要改变辅助基板的厚度就可方便地 改变添加空间内可保持的血液样品的体积，可在进一步简化生物传感器的构造的同时将 由生物传感器构造的偏差所导致的反应不稳定的程度极小化，可实现更高精度的测定。附图的简单说明图IA为本发明的实施方式1的生物传感器的立体图。图IB为同一生物传感器的纵向剖面图。图IC为同一生物传感器的分解立体图。图2A为表示同一生物传感器中添加了液体试样时显示生物传感器中的液体试样 展开状况的剖视图。图2B为表示同一生物传感器中添加了液体试样时显示生物传感器中的液体试样 展开状况的剖视图。图2C为表示同一生物传感器中添加了液体试样时显示生物传感器中的液体试样 展开状况的剖视图。图2D为表示同一生物传感器中添加了液体试样时显示生物传感器中的液体试样 展开状况的剖视图。图2E为表示同一生物传感器中添加了液体试样时显示生物传感器中的液体试样 展开状况的剖视图。图3A为同一实施方式1的变形例的生物传感器的立体图。图3B为同一生物传感器的分解立体图。
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图3C为同一生物传感器的纵向剖面图。图4A为同一实施方式1的其它变形例的生物传感器的立体图。图4B为同一生物传感器的分解立体图。图5A为简单地表示通过比较例的生物传感器进行测定的状态的立体图。图5B为简单地表示通过本实施方式的生物传感器进行测定的状态的立体图。图6A为表示本发明的实施方式1的实施例1的测定结果的吸光度分布与CV值 的图。图6B为表示本发明的实施方式1的实施例1的测定结果的吸光度分布与CV值 的图。图7A为表示本发明的实施方式1的实施例2的测定结果的吸光度分布与CV值 的图。图7B为表示本发明的实施方式1的实施例2的测定结果的吸光度分布与CV值 的图。图8为表示本发明的实施方式2的生物传感器的构成的立体图。图9为简单地表示使用同一生物传感器和分析装置的分析状态的立体图。图IOA为同一生物传感器的立体图。图IOB为同一生物传感器的分解立体图。图IOC为沿长边方向切开同一生物传感器后的剖视图。图IOD为沿宽度方向切开同一生物传感器后的剖视图。图IlA为同一生物传感器的剖视图。图IlB为表示同一生物传感器中添加了血液样品时的展开状况的图像的剖视 图。图IlC为表示同一生物传感器中添加了血液样品时的展开状况的图像的剖视 图。图IlD为表示同一生物传感器中添加了血液样品时的展开状况的图像的剖视 图。图IlE为表示同一生物传感器中添加了血液样品时的展开状况的图像的剖视 图。图IlF为表示同一生物传感器中添加了血液样品时的展开状况的图像的剖视 图。图12A为形成同一生物传感器的试样添加部的空间形成材料的分解立体图。图12B为形成同一生物传感器的试样添加部的空间形成材料的立体图。图13为简单地表示通过测定同一生物传感器的分析装置进行分析的状态的图。图14A为现有的生物传感器的立体图。图14B为现有的生物传感器的纵向剖面图。图14C为现有的生物传感器的分解立体图。图15A为表示同一现有的生物传感器内藏于套管的最终状态的俯视图。图15B为表示同一现有的生物传感器内藏于套管的最终状态的侧面剖视图。图16A为表示同一现有的生物传感器内藏于套管的最后状态的剖视图。
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图16B为表示液体试样展开于同一现有的生物传感器上的状态的生物传感器的 剖视图。图16C为表示液体试样展开于同一现有的生物传感器上的状态的生物传感器的 剖视图。图16D为表示液体试样展开于同一现有的生物传感器上的状态的生物传感器的 剖视图。图16E为表示液体试样展开于同一现有的生物传感器上的状态的生物传感器的 剖视图。图16F为表示液体试样展开于同一现有的生物传感器上的状态的生物传感器的 剖视图。图17A为比较例的生物传感器的立体图。图17B为比较例的生物传感器的分解立体图。图18A为其它比较例的生物传感器的立体图。图18B为同一其它比较例的生物传感器的分解立体图。图18C为沿长边方向切开同一其它比较例的生物传感器后的剖视图。
具体实施例方式下面，就本发明的生物传感器的实施方式参照附图详细进行说明。所示的实施 方式仅为示例，并不限定于该实施方式。本实施方式中，被检测物质实质上与分析对象 物相同。图1A，图1B，图IC分别是表示本发明的实施方式1的生物传感器的构成的 图，图IA是生物传感器的立体图，图IB是生物传感器的纵向剖视图，图IC是生物传感 器的分解立体图。如图IA 图IC所示，生物传感器具备添加液体试样的试样添加部12(添加空 间9)、与液体试样反应的反应试剂14、展开混有反应试剂14的液体试样或与反应试剂14 进行了反应的液体试样的展开流路2、作为支承试样添加部12及展开流路2的支承体的基 板1，用免疫色谱法测定液体试样中有无分析对象物及其浓度。试样添加部12是由液体 不透过性材料形成的空间形成材料8包围着微小的添加空间9而构成的，含示踪剂(以下 也称为标记试剂)的反应试剂14以可溶出于添加空间9中添加的液体试样的状态被保持 在试样添加部12的微细空间形成材料8的面向添加空间9的位置。示踪剂由配体部分及 与配体部分结合的可检出的标记部分构成。在这里，含有示踪剂(标记试剂)的反应试剂14以不与展开流路2或基板1接 触的状态被保持在与相当于插入了试样添加部12的展开流路2的色谱展开方向上游区域 的添加空间9的底面部的基板1的上表面(试样添加部12的展开流路2的延长线上的面) 不同的位置。在该实施方式中，反应试剂14被保持在与配设有展开流路2的基板1的上 表面隔开规定距离对置的空间形成材料8的上表面部背面。又，作为测定对象的液体试样为不含血细胞等细胞成分的血浆或血清等时，反 应试剂14含标记试剂但不含收缩细胞成分的细胞收缩剂。与此对应，作为测定对象的液 体试样为包含血细胞等细胞成分的全血等时，反应试剂14包含标记试剂及细胞收缩剂。
在展开流路2的一部分中设有特异蛋白质被固定化了的可用作为测定区域的试 剂固定化部3。同时，展开流路2的表面除了位于色谱展开方向下游端区域(也称色谱下 游端)的开放部10以外，从色谱上游区域开始至少到包含试剂固定化部3的色谱下游区 域都被液体不透过性材料形成的液体不透过性片材7覆盖。在上述的色谱上游区域设置 着由液体不透过性材料形成的空间形成材料8包围微小的添加空间9而构成的试样添加部 12。如图IB所示，添加空间9是用于吸引一定量的液体试样(在该实施方式中利用毛细 管现象吸引一定量的液体试样)的位于色谱上游端的空间，该添加空间9的前端成为向生 物传感器供给液体试样的开口部11。又，在该实施方式中，仅在生物传感器的色谱上游区域，在作为生物传感器底 面部(支承体)的基板1上面重叠设置有作为间隔物发挥作用的辅助基板18(材料同基 板1，如后所述，由液体不透过性材料构成)。展开流路2的色谱上流区域端部只配置在 比添加空间9的开口部11更靠吸引方向内侧的位置，S卩，至色谱展开方向的下游侧的位 置，从该展开流路2的上游端部到开口部11为止的区域不设置展开流路2。上述的辅助 基板18在消除添加空间9的底面部侧的阶差的同时还具备调节添加空间9的厚度尺寸(上 下方向厚度)的功能，使得在接连开口部11的位置能够很好地利用毛细管现象吸引液体 试样。辅助基板18由液体不透过性材料构成，最好设置成与展开流路2同厚度，这样就 与展开流路2无阶差，但并不限于此，能减小与展开流路2的阶差的厚度即可，对材质和 厚度无特别规定。另外，如果该处的添加空间9的较薄，只要能保持毛细管力，即使有 阶差也丝毫没有影响。同时，辅助基板18不一定非得同基板1分为两块板，也可把相当 于辅助基板18的厚度部分与基板1形成一体。把相当于辅助基板18的厚度部分与基板1 形成一体或把另外的辅助基板18精度很好地与基板1接合，在为了形成添加空间9而把 空间形成材料8安装到基板1上时，可将空间形成材料8平直地安装到基板1上，具有提 高安装精度的优点。接着，用图2A，图2B，图2C，图2D，图2E说明生物传感器上的液体试样的 展开状况。图2A 图2E分别为表示本发明的实施方式的生物传感器中添加了液体试样 时的生物传感器中的液体试样的展开状况的剖视图。如图2A所示，在试样添加部12的开口部11点上(添加)了血液样品S等液体 试样(步骤1)后，如图2B所示，一定量的液体试样通过毛细管现象被吸引入添加空间 9，添加空间9内充满液体试样(步骤2)。如果添加空间9中吸引了液体试样后，反应 试剂14的试剂(标记试剂，或标记试剂及细胞收缩剂)与液体试样接触，很快地开始溶 解。如果添加空间9中充满液体试样，则溶解了的标记试剂或标记试剂及细胞收缩剂(以 下简称为标记试剂等与液体试样反应后扩散到整个添加空间9，并同时如图2C所示，液 体试样向展开流路2展开(步骤3)。展开流路2中展开的液体试样以与标记试剂等反应后的状态展开，如图2D所 示，到达并通过试剂固定化部3 (步骤4)。一到达试剂固定化部3之后，如果液体试样中 存在分析对象物，则标记试剂及分析对象物和固定化试剂之间发生特异性反应，在试剂 固定化部3产生来自标记试剂的呈色反应。在展开流路2中继续展开的液体试样在展开 流路2的覆盖着液体不透过性片材7的区域中因液体不透过性片材7的作用，表面的水分 蒸发被阻止，到达未被液体不透过性片材7覆盖的开放部10才开始水分的蒸发(参照图2E)。这个干燥过程有助于液体试样的移动，促进从试样添加部12向开放部10的液体试 样的展开。试样添加部12是由液体不透过性材料构成的微细空间，在微细空间内没有保 留，通过液体的展开移动，向着色谱下游方向移动(步骤5)。经过以上的步骤在试剂固 定化部分3出现了的标记试剂的反应可通过目测或采用测定装置测出，据此可确认液体 试样中的分析对象物的存在或其浓度。这里所示的展开流路2是由可通过毛细管力(由毛细管现象产生的力)而移动的 任意材料构成的、液体试样可展开的流路。该展开流路2只要是被液体试样湿润、能形 成可展开液体试样的流路的材料即可，可以是滤纸、无纺布、膜片、布、玻璃纤维等多 孔质的任意材料。或者，也可用中空的毛细管形成流路，这种情况下的中空的毛细管材 料可用树脂材料等构成。又，标记试剂是在抗体上用胶体金等标记物进行了标记的试剂，可用作为检测 上述试剂固定化部3中的结合的手段。前述的胶体金不过是标记试剂的一个例子，可根 据需要任意选择金属或非金属胶体粒子、酶、蛋白质、色素、荧光色素、发光物质、乳 胶等着色粒子等。又，试剂固定化部3使用的抗体只要能形成标记试剂及与被检物质的复合体即 可，因此抗体针对被检物质的表位或与被检物质的亲和性可以相同也可不同。2个抗体的 亲和性不同但表位相同也没有问题。又，图IA 图IC和图2A 图2E所示的生物传感器的构成的例子中，试剂固 定化部3只设置了 1处，但并不是限定只能有1处，多处也行，如果是1处以上，可按照 目的自行选择。此外，展开流路2上的试剂固定化部3形状不限定为线状，也可以是点 状或文字形状、钥匙形状等，可自由选择。在设定多个试剂固定化部时，可设置为空间 上分离的形态或外观上看上去象一条线那样接触的形态等各种位置关系。覆盖展开流路2的液体不透过性片材7例如由透明PET带构成。除了与作为试 样添加部的添加空间9连接的部分和上述液体试样到达的下游端以外，上述液体不透过 性片材7密合覆盖展开流路2。这样，通过用液体不透过性片材7覆盖展开流路2，防止试样点在试样添加部 12(添加空间9)之外，起到保护作用并同时起到可防止来自外部的污染的作用。不仅如 此，在液体试样展开的时候，防止液体试样一边展开一边蒸发，液体试样必定通过作为 展开流路2上的反应部分的试剂固定化部3，在上述试剂固定化部3中，与液体试样中的 被检物质的反应能高效地进行。这里所谓的来自外部的污染是指液体试样无意间与该展 开流路2上的反应部分的接触，或被验者的手等直接接触了展开流路2等情况。覆盖上 述展开流路2的液体不透过性片材7优选使用透明的材料，覆盖所述试剂固定化部3的部 分因是测定信号的部分，所以最好保持为至少可透光的状态。在进行更高精度的测定时，将展开流路2的上表面及侧面、特别是包含上述试 剂固定化部3的部分密合密封，且对与液体试样的展开方向平行的侧面也同样地进行密 合密封。这样，不仅仅是展开流路2的上表面，两侧表面也被液体不透过性片材7覆盖， 能阻止液体试样从该侧面部蒸发、干燥，使得容易溢至展开流路2的两侧部分的液体试 样能向色谱下游区域方向展开。也可以如图3A所示密封两侧面部(在图3A所示为展开 流路2的两侧部及基板1的两侧面部也被密封的情况，但并不限于此)，以此替代用液体
17不透过性片材7覆盖两侧面部，作为进行密封的方法，可用密封材料17涂布或填充，但 不限于此，在展开流路2的制造工序中用激光扫描熔融或用激光切割，可在切割的同时 将两侧面部的孔部密封。此外，如图3A、图3B、图3C所示，可在上表面部分开口形成 促进向添加空间9的毛细管力的气孔13，以此替代在形成添加空间9的空间形成材料8的 一方端部的侧面部分形成该气孔。基板1用PET膜等液体不透过性片材构成，可以是透明、半透明、或不透明 的，如使用光学检测设备等情况下，需要测透射光时采用透明材料，测反射光时则要采 用不透明的材料。其材质为ABS、聚苯乙烯、聚氯乙烯等合成树脂材料，也可采用金 属、玻璃等液体不透过性材料。由形成试样添加部12的添加空间9的液体不透过性材料构成的微细空间形成材 料8不仅吸收保持一定量的液体试样，在使用添加试样后的生物传感器时，还起着防止 液体试样受外部污染的作用。微细空间形成材料8可用ABS、聚苯乙烯、聚乙烯树脂等 合成树脂材料形成，也可用金属、玻璃等液体不透过性材料形成，优选透明或半透明的 材料，也可以是不透明的有色材料，或者为该不透明的材料时可由任意的材料形成。在色谱下游端的开放部10没有设置液体不透过性片材7而保持开放状态。因为 是开放的，所以液体试样在中途或到达时已挥发或蒸发。更有甚者，液体试样渗出到开 放部10，仅在开放部10的展开流路2的上部，液体试样的高度与添加空间9内的展开流 路2的上部的液体试样的高度相同或至标准高度。实施例1(使用血浆的CRP定量)(a)比较例的生物传感器的制作首先说明比较例的生物传感器(免疫色谱传感器)的制造方法。这里，先对该 比较例的生物传感器的构造作一简单说明。图17A是比较例的生物传感器的立体图，图 17B是生物传感器的分解立体图。如图17A、图17B所示，虽然该传感器与图14A 图 14C所示的现有传感器在结构上大致相同，但在展开流路2上具有将抗CRP抗体A固定 化的第1试剂固定化部(也称为第1固定化抗体系)3A、和将抗CRP抗体B固定化的第 2试剂固定化部(也称为第2固定化抗体系)3B以及保持抗CRP抗体C和胶体金的复合 体(标记试剂)的标记试剂保持部4。该生物传感器按以下方法制造。准备用磷酸缓冲溶液稀释调节了浓度的抗CRP抗体A溶液。用溶液排出装置 将该抗体溶液涂布在硝化纤维素膜上。以下同样，将抗CRP抗体B溶液涂布在试样添 加部区域5的下游侧4_处。由此，在硝化纤维膜上获得作为试剂固定化部3的第1固 定化抗体系3A和第2固定化抗体系3B。该硝化纤维膜经干燥后浸渍于包含脱脂乳 的Tris-HCl缓冲溶液中，并进行30分钟的轻微振荡。30分钟后，将硝化纤维素膜移入 Tris-HCl缓冲溶液槽中，经10分钟轻微振荡后，再将它们移入另一只Tris-HCl缓冲溶液 槽中轻微振荡10分钟，之后，洗净硝化纤维素膜。再用包含0.05%蔗糖月桂酸单脂的 Tris-HCl缓冲溶液浸渍并轻微振荡10分钟后，从液槽中取出硝化纤维素膜，在室温下干 燥。藉此可获得展开流路2。标记试剂的胶体金是通过将的柠檬酸三钠溶液加入到回流中的0.01%的氯金酸100°C溶液中而制得的。连续回流15分钟后，在室温下放冷。然后用0.2M的碳酸 钾溶液将上述的调制好的胶体金溶液的pH值调节至8.9，向其中加入抗CRP抗体C，搅 拌数分钟后，在搅拌中加入pH8.9的10% BSA(牛血清白蛋白)溶液，直到它最终达到 1 %，调制出抗体_胶体金复合体(标记抗体)。在4V温度及20000G条件下离心分离上 述标记抗体溶液50分钟，分离出标记抗体后，将其悬浮于洗涤缓冲液(1% BSA和5%蔗 糖-磷酸缓冲液)中后，再经上述的离心分离处理，洗净离析标记抗体。将该标记抗体 用洗涤缓冲液悬浮，之后用0.8 μ m滤器过滤，接着将它们调制成在520nm处的吸光度为 150，在4°C下保存。在溶液排出装置中设置标记抗体溶液，然后，将反应试剂(标记试 剂)涂布在涂布有固定化抗CRP抗体A及固定化抗CRP抗体B的干燥膜上的离开第1固 定化抗体系3A及第2固定化抗体系3B的位置上。形成从液体试剂开始添加方向依次为 标记试剂保持部4、第1固定化抗体系3A、第2固定化抗体系3B的位置关系后，将硝化 纤维素膜在真空下冷冻干燥。藉此获得具有标记试剂保持部4及试剂固定化部3 (第1固 定化抗体系3A、第2固定化抗体系3B)的展开流路2。接着，将包含调制好的反应试剂(标记试剂)的展开流路2粘贴在厚度0.5mm的 白色PET制成的基板1上，为了借助毛细管流从展开流路末端(下游端)至展开下游侧能 够将吸水部6分别与展开流路2或标记试剂保持部4连接，将试样添加部区域5粘贴到较 标记保持部4的展开上游侧。之后，用激光以2.0mm宽度切割。这样就制成了作为具 有现有结构的免疫色谱传感器的生物传感器。(b)本发明的生物传感器的制作对本发明的生物传感器(免疫色谱传感器)的制作方法进行说明。图4A是本 发明的另一实施方式的生物传感器的立体图；图4B是该生物传感器的分解立体图。根 据图4A、图4B、图IA 图IC所示，虽然在结构上，本发明的生物传感器与图IA 图 IC所示的基本相同，但在由硝化纤维素膜制成的展开流路2上设有将抗CRP抗体A固定 化的第1试剂固定化部(也称为第1固定化抗体系)3A和将抗CRP抗体B固定化的第2 试剂固定化部(也称为第2固定化抗体系)3B，还设置有保持抗CRP抗体C与胶体金的 复合体(标记试剂)的反应试剂14。该生物传感器通过以下方法制得。准备用磷酸缓冲溶液稀释调节了浓度的抗CRP抗体A溶液。通过溶液排出装置 将该抗体溶液涂布在硝化纤维素膜上。以下按同样方法，抗CRP抗体B溶液涂布在试样 添加部12下游侧4mm处。藉此可以在硝化纤维素膜上获得作为试剂固定化部3的第1固 定化抗体系3A和第2固定化抗体系3B。将该硝化纤维素膜干燥后，浸渍于含脱脂乳 的Tris-HCl缓冲溶液中轻微振荡30分钟。30分钟之后，再将该膜移入Tris-HCl缓冲溶 液槽中，经10分钟轻微振荡后，再将它移入另一 Tris-HCl缓冲溶液槽中，再轻微振荡10 分钟，接着洗净硝化纤维素膜。然后，将它浸渍于含0.05%蔗糖月桂酸单酯的Tris-HCl 缓冲溶液中轻微振荡10分钟后，从液槽中取出硝化纤维素膜，放在室温下干燥。藉此制 得展开流路2。反应试剂(标记试剂)14的胶体金是通过将柠檬酸三钠溶液加到回流中的 0.01%的氯金酸100°C溶液中而制得的。连续回流15分钟后，在室温下放冷。然后，用 0.2M的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH值调节到8.9，再向其中加入抗CRP抗体C搅拌数分钟后，在搅拌中加入pH8.9的10% BSA(牛血清白蛋白)溶液，直到它最终达到1%， 调制出抗体-胶体金复合体(标记抗体)。然后，在4°C、20000G条件下离心分离上述 标记抗体溶液50分钟，分离出标记抗体，接着将其悬浮于洗涤缓冲液(1%BSA_5%蔗糖 磷酸缓冲液)，再进行上述离心分离，使标记抗体洗净分离。用洗涤缓冲液悬浮该标记抗 体后通过0.8 μ m的滤器过滤，接着将其调制成在520nm处的吸光度为150，并在4°C下 保存。之后，粘贴将厚度100 μ m的透明PET层压而制成的空间形成材料8，形成微细 添加空间(宽2.0_X长7.0mmX高0.3mm) 9。在该添加空间9中涂布3 μ L上述标记 抗体溶液，经风干后获得反应试剂14。之后，将调制成的展开流路2粘贴在厚度0.5mm的白色PET制成的基板1上， 除了色谱展开的上下游两侧3mm以外，展开流路2的表面上都粘贴透明胶带。然后，按 2.0mm宽度用激光切割。切割后，将保持反应试剂14的空间形成材料8粘贴在未粘贴透 明胶带的始端部分(即，色谱上流侧)上，形成添加空间9。这样就制成了本发明的作为 免疫色谱传感器的生物传感器。(c)液体试样的调制从加入作为抗凝剂的肝素的人体血液中分离血浆，然后向其中加入已知浓度的 CRP溶液，调制出CRP浓度0.1mg/dL、lmg/dL的血浆。(d)生物传感器上呈色强弱的测定将通过以上(C)工序制得的含CRP的血浆加入到经以上(a)和(b)的制作工序制 得的生物传感器的试样添加部5和12中，然后朝着色谱下游方向进行展开处理，使抗原 抗体反应产生。将液体试样加入到通过(a)、(b)工序制得的生物传感器中5分钟后测定 试剂固定化部3A、3B处的呈色状况。图5A是简单地表示通过以上比较例的生物传感器 进行测定时的状态的立体图；图5B是简单地表示通过本实施方式的生物传感器进行测定 时的状态的立体图。图5A和图5B中，21是照射波长635nm的半导体激光形成的光源 的照射部；22是由接收来自生物传感器的反射散射光的受光元件(光电二极管)形成的 受光部。在该装置的构成中，扫描生物传感器后，演算处理来自展开流路2的反射散射 光，将第1试剂固定化部3A和第2试剂固定化部3B中的标记抗体结合量作为吸光度而 获得结果。图6A和6B示出的是对上述的(a)、(b)工序中制得的10个(N = 10)生物 传感器(现有的生物传感器(方法(a))和本发明的实施方式的传感器(方法(b)))进行 同时再现性测定时的测定结果。图6A和图6B分别示出的是第1试剂固定化部3A和第2试剂固定化部3B中的 吸光度的测定结果，由于定量演算中在CRP浓度为O.lmg/dL时使用第1试剂固定化部 3A，在CRP浓度为lmg/dL时使用第2试剂固定化部3B，因此，在O.lmg/dL时示出第 1试剂固定化部3A的吸光度和CV值，在lmg/L时示出第2试剂固定化部3B的吸光度 和CV值。所谓CV值指的是标准偏差/平均值X100而得的值。如图6A和6B所示，无论浓度如何，与方法(b)相比较，方法(a)的吸光度都 很低。如本发明之前所述，在现有的生物传感器中，由于展开流路2上承载的标记试剂 没有完全溶出，因此，与作为所添加的液体试样中的分析对象物的CRP和标记试剂的反 应不够充分，获得的是吸光度低的结果；而方法(b)，也就是本发明的生物传感器，其 获得的吸光度却很高，消除了这2点后标记试剂完全溶出，与分析对象物、CRP及标记
20试剂实现了充分的反应，且该反应后的液体试样能充分地在展开流路2中展开，因此可 以看出本发明的生物传感器是很成功的。此外，对CV值进行比较，两种不同方法所获得的CV值并没有出现很明显的差 别，将粘度低、展开性良好的血浆作为检体使用进行展开时，也没有发现很大的展开参 差不齐的现象。根据以上结果看，这两种方法中吸光度不同的主要原因是保持标记试剂 的部位和载体所引起的。采用本发明时，灵敏度提高了，可见它能实现高灵敏度测定。 此外，在使用本发明的实施例1的生物传感器时，由于减少了液体透过性构成部件，因 此可大幅度地减少样品检体量。[实施例2](使用全血的血中CRP的定量)(a)比较例的生物传感器的制作制造在硝化纤维素膜上包含将抗CPR抗体A固定化的第1试剂固定化部(也称 为第1固定化抗体系)3A、将抗CRP抗体B固定化的第2试剂固定化部(也称为第2固 定化抗体系)3B以及保持抗CRP抗体C和胶体金的复合体(标记试剂)的标记试剂保持 部4的生物传感器。图17A是比较例的生物传感器的立体图、图17B是生物传感器的分 解立体图。该免疫色谱传感器按以下方法制成。利用磷酸缓冲溶液进行稀释，制得浓度得到了调节的抗CRP抗体A溶液。用溶 液排出装置将该抗体溶液涂布在硝化纤维素膜上。以下同样，在试样添加部下游侧4_ 处涂布抗CRP抗体B溶液。藉此，在硝化纤维素膜上获得作为试剂固定化部3的第1固 定化抗体系3A和第2固定化抗体系3B。该硝化纤维素膜干燥后将其浸渍于含有脱脂 乳的Tris-HCl缓冲溶液中轻微振荡30钟。之后，再将该硝化纤维素膜移入Tris-HCl缓冲 溶液槽中轻微振荡10分钟。然后，再将其移至另一 Tris-HCl缓冲溶液槽中轻微振荡10 分钟，进行硝化纤维素膜的清洗。然后，将其浸入含有0.05%蔗糖月桂酸单脂的Tris-HCl 缓冲溶液中轻微振荡10分钟，从液槽中将硝化纤维素膜取出后经室温干燥，藉此获得展 开流路2。反应试剂(标记试剂)的胶体金是通过将柠檬酸三钠溶液加到回流中的 0.01%的氯金酸100°C溶液中而制得的。连续回流15分钟后，在室温下放置冷却。然 后，用0.2M的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH值调节到8.9，再向其中加入抗CRP抗体C 搅拌数分钟后，在搅拌中加入pH = 8.9的10% BSA(牛血清白蛋白)溶液，使其最终达 到1%，藉此制得抗体_胶体金复合体(标记抗体)。然后，在4°C、20000G的条件下离 心分离上述标记抗体溶液50分钟，分离出标记抗体。接着，将其悬浮于洗涤缓冲液(1% BSA-5%蔗糖磷酸缓冲液)中，再进行所述离心分离，将标记抗体洗涤分离。在洗涤缓 冲液中悬浮该标记抗体后通过0.8 μ m的滤器过滤，制成520nm处吸光度为150的制品， 在4°C下保存。将所述标记抗体溶液置于溶液排出装置中后，在涂布有固定化抗CRP抗 体A和固定化抗CRP抗体B的干燥膜上的离开第1固定化抗体系3A和第2固定化抗体 系3B的位置涂布反应试剂(标记试剂)，形成从液体试样添加开始方向依次为标记试剂 保持部4、第1固定化抗体系3A、第2固定化抗体系3B的位置关系后，将硝化纤维素膜 真空冷冻干燥。据此，获得了具有标记试剂保持部4和试剂固定化部3(第1固定化抗体系3A和第2固定化抗体系3B)的展开流路2。接着，将含有制得的标记试剂的反应层载体粘贴在厚度0.5mm的白色PET制成 的基板1上。从标记试剂保持部4到终端部分都粘贴上透明胶带。之后，按2.0mm宽 度用激光切割。切割后在未粘贴透明胶带的始端部分上粘贴将厚100 μ m的透明PET层 压而制成的空间形成材料8，形成微细添加空间(宽2.0mmX长7.00mmX高0.3mm)9。上述空间形成材料8是预先放入10%的氯化钾水溶液中浸润后直接通过液氮进 行冷冻干燥，从而制得具有保持以干燥状态保持氯化钾的细胞收缩剂的空间形成材料8 的生物传感器。藉此制得比较例的免疫色谱传感器。也就是说，在图17A和图17B中 虽然未示出，但比较例的生物传感器具备与图4A和图4B中所示相同的空间形成材料8。 但是，空间形成材料8中只是保持细胞收缩剂，标记试剂保持部4被设置在反应层载体 (展开流路2)的上游侧区域。b)本发明的免疫色谱传感器的制作制得硝化纤维素膜上含有第1试剂固定化部(也称为第1固定化抗体系)3A、 将抗CRP抗体B固定化的第2试剂固定化部(也称为第2固定化抗体系)3B以及保持抗 CRP抗体C和胶体金的复合体(标记试剂)及细胞收缩剂的反应试剂14的本发明生物传 感器。图4A所示的是该生物传感器的立体图；图4B所示的是分解立体图。该生物传感器如下制作。利用磷酸缓冲溶液稀释进行，制得浓度经调节的抗CRP抗体A溶液。利用溶液 排出装置将该抗体溶液涂布在硝化纤维素膜上。以下同样，在试样添加部12下游侧4_ 处涂布抗CRP抗体B溶液。藉此，在硝化纤维素膜上获得作为试剂固定化部3的第1固 定化抗体系3A和将抗CRP抗体B固定化的第2固定化抗体系3B。该硝基纤维素膜干燥 后浸渍于含1 %脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中轻微振荡30分钟。之后，再将该硝基纤维 素膜放入Tris-HCl缓冲溶液槽中轻微振荡10分钟，再将其移至另一 Tris-HCl缓冲溶液槽 中轻微振荡10分钟，之后进行该膜的洗净。接着，将它放入到包含0.05%蔗糖月桂酸单 脂的Tris-HCl缓冲溶液中轻微振荡10分钟后将膜从液槽取出，在室温下干燥。藉此获得 展开流路2。标记试剂的胶体金是将的柠檬酸三钠溶液加到回流中的0.01%的氯金酸 100°c溶液中而制得的。连续回流15分钟后在室温下放冷。然后，用0.2M的碳酸钾溶 液将胶体金溶液的pH值调节到8.9，并向其中加入抗CRP抗体C搅拌数分钟后，再在搅 拌中加入pH = 8.9的10% BSA(牛血清白蛋白)溶液使其最终达到1%，制得抗体-胶体 金复合体(标记抗体)。然后，在4°C、20000G的条件下离心分离上述标记抗体溶液50 分钟，分离出标记抗体，将其悬浮于洗涤缓冲液(1%BSA_5%蔗糖磷酸缓冲液)后，进 行上述离心分离，洗涤分离标记抗体。使该标记抗体悬浮于洗涤缓冲液中，通过0.8 μ m 的滤器过滤后，制成520nm处吸光度为150的制品。按照使最终浓度达到10%的条件在 上述标记抗体溶液中添加氯化钾溶液，制得标记抗体_细胞收缩剂混合溶液后将其于4°C 下保存。之后，粘贴将厚100 μ m的透明PET层压而制得的空间形成材料8，形成添加 空间(宽2.0mmX长7.00mmX高0.3mm) 9。在该添加空间9中涂布3 μ L上述标记抗 体-细胞收缩剂混合溶液，经风干后获得反应试剂14。之后，将制成的展开流路粘贴在厚0.5mm的白色PET制成的基板1上。除了色谱展开上下游侧3mm外的展开流路2的其它表面上全都粘贴有透明胶带。之后，按 2.0mm宽度用激光切割。切割后，在未粘贴透明胶带的始端部分(色谱上游侧)上粘贴 保持反应试剂14的空间形成材料8，形成添加空间9。这样便制成了本发明的生物传感器。c)液体试样的调制通过将已知浓度的CRP溶液加入到含有作为抗凝剂的肝素的人体血液中，制得 CRP浓度为0.1mg/dL、lmg/dL的血液(全血)。d)生物传感器上的呈色强弱的测定在通过以上(a)、(b)的制作工序获得的生物传感器的试样添加部5和12中添加 通过以上(C)工序制得的含CRP的全血，朝向色谱下游方向进行展开处理，使抗原抗体 反应产生。在通过(a)、(b)工序制得的生物传感器中加入液体试样的5分钟后测定试剂 固定化部3A、3B的呈色状况。图5A是简单地表示通过所述现有的生物传感器进行测定 时的状态的立体图；图5B是简单地表示通过本实施方式的生物传感器进行测定时的状态 的立体图。图5A和图5B中，21是照射波长635nm的半导体激光形成光源的照射部， 22是由接收来自生物传感器的反射散射光的受光元件(光电二极管)构成的受光部。在 该装置构成中，扫描生物传感器后，演算处理来自展开流路2的反射散射光，将第1试剂 固定化部3A和第2试剂固定化部3B中的标记抗体结合量作为吸光度而获得结果。图7A 和7B示出对上述的(a)、(b)各工序中制得的10个(N = 10)生物传感器(现有的生物 传感器(方法(a))和本发明的实施方式的生物传感器(方法(b)))进行同时再现性测定 时的测定结果。图7A和图7B分别示出第1试剂固定化部3A和第2试剂固定化部3B中的吸光 度测定结果，由于定量演算中在CRP浓度为O.lmg/dL时使用第1试剂固定化部3A，在 lmg/dL时使用第2试剂固定化部3B，因此，在O.lmg/dL时示出第1试剂固定化部3A的 吸光度和CV值，在lmg/L时示出第2试剂固定化部3B的吸光度和CV值。如图7A和图7B所示，在任一浓度下与方法(b)比较，方法(a)的吸光度都很 低。根据本发明之前所述，在现有的生物传感器中，由于展开流路2上承载的标记试剂 没有完全溶出，因此与作为所添加的液体试样中的分析对象的CRP和标记试剂没有充分 反应，获得了较低的吸光度结果；而方法(b)，即，本发明的生物传感器的吸光度之所 以较高可能是因为消除了这2点后标记试剂完全溶出，其与分析对象物、CRP及标记试 剂得以充分反应，而且该反应后的液体试样能够在展开流路2中充分展开的缘故。进一步对CV值进行比较，方法(b)，即，本发明的生物传感器获得了良好的 CV值。在本实施例中，由于是展开全血，所以展开流路2中的溶液展开并不均一，但方 法(b)的吸光度参差不齐的程度很小，因此并不比展开血浆的实施例1逊色。这是因为 在添加空间9内标记试剂、细胞收缩剂及全血均一地进行了反应。由于能与两种试剂同 时反应，因此实现了更加均一的反应状态，得到改善了溶液的展开性的效果。由上述实施例1和实施例2的结果可以确认，本发明能提供可实现更准确且高精 度和高灵敏度的测定的可简单、快速地完成测定的作为免疫色谱传感器的生物传感器。此外，在实施例1和2中，虽然使用了在硝化纤维素膜上设有试剂固定化部3、 3A、3B等的生物传感器，但作为展开流路2，并不局限于硝化纤维素膜，只要是能被液体试样润湿且能形成展开该液体试样的流路的材料都可以，可以是滤纸、无纺布、膜 片、布、玻璃纤维等多孔质的任意的材料。或者还可以通过中空毛细管形成流路，在这 种情况下，材料可由树脂材料等构成。作为构成标记试剂的标记物，虽然使用胶体金作为示例，但也可以是着色物 质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原物质、酶、核酸及小胞体。如果反应前 后发生了某种变化，使用任何一种都一样，可以根据需要进行任意选择。根据反应体系 可包含改性剂或底物等试剂。以上第1试剂固定化部3A和第2试剂固定化部3B中所使用的抗体只要能形成 标记试剂以及与分析对象物形成复合体即可，因此，抗体针对分析对象物的表位或者与 分析对象物的亲和性可以相同也可不同。2种抗体的亲和性不同但表位相同也没任何问题。作为读取呈色强弱程度的方法，可通过用照射部21和受光部22根据光学变化来 检知液体试样的展开状况的方法来示出结果，不过也可以采用其它的方法，如读取电气 变化及电磁变化的方法，或者作为图像读取的方法，总之可以采用任意方法。另外，示出了作为细胞收缩剂使用氯化钾的试剂构成，这种细胞收缩剂在以上 液体试样中包含细胞成分时是必须配置的试剂。使用不含细胞成分的液体试样时，并不 是必须的。细胞收缩剂是一种能达到细胞收缩效果的含氯化钾或氯化钠、磷酸钠等的无 机化合物；也可以使用甘氨酸、谷氨酸等氨基酸；脯氨酸等亚氨酸；葡萄糖、蔗糖、海 藻糖等糖类；山梨醇等糖醇类。含有这样的细胞收缩剂的体系在作为液体试样使用全血 的情况下特别有效。在本实施方式中，举例说明了在微细空间中承载标记试剂或在标记 试剂中承载混合了细胞收缩剂的溶液的情况，但除此以外的任何试剂单独地或者以混合 试剂的状态承载也都没任何问题。以上的实施方式中，对含有示踪剂的反应试剂14被保持在与配设有展开流路2 的基板1的上表面隔开一定距离对置的空间形成材料8的上表面部背面的情况进行了描 述，这样的情况与在基板1的上表面(添加空间的底面部)配设示踪剂(标记试剂)的情 况相比，反应试剂14能以更加均一地在液体试样中溶出的状态被导入展开流路2中，其 结果是，能够获得更准确且高精度和高灵敏度的测定结果。也就是说，在试样添加部12 的底面部分及基板1的上表面配设反应试剂14的情况下，由于反应试剂14与展开流路2 的色谱上游端区域接触或极为靠近，因此，在液体试样中标记试剂一溶出就会立即将非 均勻状态的液体试样导入展开流路2中，这有可能会降低精度或灵敏度，但以上的结构 能够防止这种情况的发生。此外，也不局限于以上构成，也可以在空间形成材料8的侧面部内表面等处配 设包含示踪剂的反应试剂14，但即使在这种情况下，也并不希望其与展开流路2的接 触，最好隔开。关于添加空间中的标记试剂，已举例说明涂布一定量试剂后进行干燥的方法， 但在从上表面部背面或底面向上延伸的整个侧面配置的方法或在任何一个面的一部分配 置的方法等在从上表面部背面或底面部向上延伸的侧面的任意位置配置的方法都没问 题。不限于涂布，也可以采用喷雾附着等方法在内的任意的方法，只要能使标识试剂以 在添加空间中所添加的液体试样中溶出的状态被保持即可。
作为被测定的液体试样，可例举有水或水溶液，、尿、血浆、血清、唾液等体 液，溶有固体、粉末或气体的溶液等，作为其用途，可例举例如血液检查、尿检、水质 检测、大小便检测、土壤分析及食品分析等。此外，作为被检物质，以C反应性蛋白质 (CRP)为例对实施例作了说明，还可以例举抗体、免疫球蛋白、激素、酶以及肽等蛋白 质及蛋白质的衍生物、细菌、病毒、真菌类、支原体、寄生虫及它们的产物和成分等感 染性物质、治疗药物、乱用药物等药物及肿瘤的标记物。具体而言，例如，人绒毛膜促 进性腺激素(hCG)、黄体化激素(LH)、甲状腺激素、卵泡形成激素、副甲状腺激素、肾 上腺脂质激素、雌二醇、前列腺特异抗原、乙型肝炎表面抗体、肌红蛋白、CRP、心肌 肌钙蛋白、HbAlc及白蛋白等都没问题。另外，还可用于水质检查或土壤分析等环境分 析、食品分析等。由于可实现简便且迅速、高灵敏度和高性能的测定，并且无论由谁在 任何地点和时间来完成这些测定都可以，所以也可用作为面向POCT(即时检测)的分析
直ο以下，参考附图对本发明的生物传感器的实施方式2作详细说明。在这里，所 示的实施方式仅作为一例予以说明，被不限定于该实施方式。图8为表示本实施方式的生物传感器的结构的立体图；图9为简单表示采用同一 生物传感器及分析装置的分析状态的立体图。图10A、图10B、图IOC及图IOD都是表 示图8所示的生物传感器的构成的图。其中，图IOA是生物传感器的立体图；图IOB是 生物传感器的分解立体图；图IOC是生物传感器的纵向剖视图；图IOD是生物传感器的 横向剖视图。如图IOA IOD所示，生物传感器(试验片)20包括利用毛细管力吸引并保 持作为液体试样添加的血液样品S的添加空间(毛细管室)9、使血液样品S和可与其中 的分析对象物发生特异性反应的反应试剂展开的展开流路2、作为形成添加空间9的底面 部的同时支承展开流路2的支承体的基板1等，该生物传感器利用色谱法测定血液样品S 中是否存在分析对象物及其浓度。添加空间9如下形成使空间形成材料8负载在基板 1的一端部(后述的色谱流向的上游端部)上，藉此从上方及两侧方包围作为微细空间的 添加空间9，然后将该空间形成材料8的两侧部下表面接合而形成。在添加空间9中通过 形成于一方端部的孔部，展开流路2的上游部分突入其中。此外，在添加空间9的另一 方的端部形成了添加血液样品的开口部11。另外，在形成添加空间9的空间形成材料8 的一方的端部的上表面部分开口，形成促进毛细管力的气孔13。在添加空间9中，包含标记试剂的反应试剂14以在添加空间9添加的血液样品 中溶出并混合、可进行反应的状态被保持。标记试剂由配体部分和与该配体部分结合的 可检出的标记部分构成。反应试剂14中除了标记试剂以外还包含与血液样品中的血细胞 成分发生反应、使血细胞成分收缩的血细胞收缩剂。这里，含有标记试剂的反应试剂14在添加空间9中，在不接触到展开流路2或 基板1的状态下被保持于与沿着展开流路的厚度方向的该展开流路2的延长线上的不同位 置。在本实施方式中，反应试剂14被保持于从配设了展开流路2的基板1的上表面开始 介以添加空间9在其厚度方向隔开规定距离对置的空间形成材料8的上表面部背面。在展开流路2的一部分中设有特异蛋白质被固定化了的可作为测定区域使用的 试剂固定化部3。此外，展开流路2的表面除了伸入添加空间9的展开流路2的上游端(色谱流动方向的上游端区域)和位于色谱流动方向的下游端区域(也称之为色谱下游 端)的开放部10以外，从添加空间9外的色谱上游区域开始至少至包含试剂固定化部3 的色谱下游区域为止都被液体不透过性材料形成的液体不透过性片材7覆盖。展开流路2 的色谱上游区域从空间形成材料8伸入添加空间9内。按图IOC所示，添加空间9是通 过毛细管现象吸引一定量的血液样品的位于色谱上游端的空间，该添加空间9的前端(另 一端部)成为吸引血液样品进入生物传感器的开口部11。如图IOB和图IOC所示，基板1和添加空间9的各端部(色谱上游区域的端部) 的位置以合并方式接合，从而形成所述开口部11。另一方面，展开流路2的上游端部， 即展开流路2的色谱上游区域的端部只被配置在比添加空间9中的血液样品吸引用开口部 更靠近吸引方向内侧的位置，即至色谱流动方向的下游侧的位置，在该展开流路2的上 游端部到开口部11的区域内并没有设置展开流路2。如果在该添加空间9的基板1上的没有设置上述展开流路2的区域，也就是说， 伸入添加空间9中的展开流路2的上游端部与基板1中的开口部11为止的区域没有任何 设置，则会产生段差，为消除或减少这种段差就需要进行填补，因此设置了使添加空间9 厚度方向的尺寸缩小以保持毛细管力的辅助基板(毛细管力保持用的填补部)18。该辅助 基板18在消除添加空间9的底面部一侧的段差的同时，在与开口部11的相连处通过毛细 管现象能顺利地吸引血液样品，因此辅助基板18还具有调节添加空间9的厚度尺寸(上 下方向厚度)的功能。辅助基板18由液体不透过性材料做成，优选与展开流路具有相同 厚度而消除与展开流路2的段差的方式来设置辅助基板，但对此并无限制，只要是能减 少与展开流路2的段差的厚度就可以，无论材质还是厚度上都没有问题。如果能缩小此 处的添加空间9的厚度以保持毛细管力，则即使存在段差也不会有任何问题。此外，辅 助基板18不一定非得同基板1分为两块板，也可把相当于辅助基板18的厚度部分与基板 1形成一体。把相当于辅助基板18的厚度部分与基板1形成一体或把另外的辅助基板18 精度很好地与基板1接合，在为了形成添加空间9而把空间形成材料8安装到基板1上 时，可将空间形成材料8平直地安装到基板1上，具有提高安装精度的优点。生物传感器20的色谱展开方向的两侧面(具体讲就是基板1、展开流路2及液体 不透过性性片材7的各自的两侧面部)被密封部17密封。因此，添加空间9中所添加的 血液样品在从添加空间出来在展开流路2中到达开放部10为止的区域，由于空气无释放 处，所以不会蒸发，在促进其向开放部10的方向展开的同时实现良好流动的效果。密封 部17可以是将密封材料充填或接合于两侧，但对此也没有特别的限制，例如，可以通过 激光照射等进行热熔融，使孔被溃塌，这样液体试样等就无法通过了。此外，图8及图 IOA IOC等中，对密封生物传感器20的两侧面的情况作了阐述，但并不限于此，也可 以是以下构成为了从生物传感器20两侧达到规定宽度的内侧，可以沿着色谱展开方向 照射激光，使其左右两侧形成热熔融后的沟槽，血液样品只会沿着该热熔融沟槽间的部 分展开。以下，通过图11A、图11B、图11C、图11D、图IlE及图IlF对生物传感器
20上的血样展开状况予以说明。图IlA是本发明的实施方式的生物传感器的剖视图；图 IlB IlF分别是表示在本发明的生物传感器中加入血样时的生物传感器中的血样展开状 况的剖视图。
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如图IlB所示，在添加空间9的开口部11处点上(添加)血样S (步骤1)后， 通过开口部11到达添加空间9的一定量的血样S通过毛细管现象被吸引，血样S填满添 加空间9 (图IlC :步骤2)。血样S被吸入添加空间9后，反应试剂14的试剂(标记试 剂和血细胞收缩剂)与血样S接触，开始快速溶解。血样S填满添加空间9后，已经溶 解的反应试剂与血样S反应并向整个添加空间9扩散，与此同时，血样S向展开流路2展 开(图IlD 步骤3)。在展开流路2中展开的血样S以与反应试剂反应的状态展开，到达试剂固定化部 3后通过(图IlE 步骤4)。一旦到达试剂固定化部3，在血样S中存在分析对象物的情 况下，反应试剂及分析对象物会与固定化试剂发生特异性反应，在试剂固定化部3发生 来自反应试剂的呈色反应。在展开流路2中进一步展开的血样S在展开流路2中的被液 体不透过性片材7覆盖的区域，由于液体不透过性片材7的作用，水分从表面的蒸发被阻 止，到达未被液体不透过性片材7覆盖的开放部10才开始水分的蒸发。这个干燥过程有 助于血液的移动，促进从添加空间9向开放部10的血液S的展开。添加空间9是由液体 不透过性材料构成的微细空间，血样S在微细空间内没有保留，通过血液的展开移动， 向着色谱下游方向移动(图IlF 步骤5)。经过以上的步骤在试剂固定化部分3出现的 反应试剂的反应可通过目测或采用测定装置测出，据此可确认血液S中的分析对象物的 存在或其浓度。这里所示的展开流路2是由血液可通过毛细管力(由毛细管现象产生的力)移动 的任意的材料构成的、血样S可展开的流路。该展开流路2只要是被血样润湿、能形成 可展开血样S的流路的材料即可，可以是滤纸、无纺布、膜片、布、玻璃纤维等多孔质 的任意材料。或者，也可用中空的毛细管形成流路，这种情况下的中空的毛细管材料可 用树脂材料等构成。又，反应试剂除血细胞收缩剂以外的成分主要由标记试剂构成，标记试剂是在 抗体上用胶体金等标记物进行了标记的试剂，可用作为检测上述试剂固定化部3中的结 合的手段。前述的胶体金不过是标记试剂的一个例子，可根据需要任意选择金属或非金 属胶体粒子、酶、蛋白质、色素、荧光色素、发光物质、乳胶等着色粒子等。又，试剂固定化部3使用的抗体只要能形成标记试剂及与分析对象物的复合体 即可，因此抗体针对分析对象物的表位或与分析对象物的亲和性可以相同也可不同。2个 抗体的亲和性不同但表位相同也没有问题。图IOA 图IOC所示的生物传感器的构成中，试剂固定化部3只设置了 1处， 但并不是限定只能有1处，多处也行(图8表示设有2处试剂固定化部3、3’的情况)， 如果是1处以上，可按照目的自行选择。此外，展开流路2上的试剂固定化部3的形状 不限定为线状，也可以是点状或文字形状、钥匙形状等，可自由选择。在设定多个试剂 固定化部3、3’时，可设置为空间上分离的形态或外观上看上去象一条线那样接触的形 态等各种位置关系。覆盖展开流路2的液体不透过性片材7例如由透明PET带构成。除了与作为试 样添加部的添加空间9连接的部分和上述血液到达的下游端以外，液体不透过性片材7以 将展开流路2密封的状态将其覆盖。这样，通过用液体不透过性片材7覆盖展开流路2，用密封部17对展开流路的两侧面进行密封，可防止试样点在添加空间9之外，起到保护作用并同时起到可防止来自 外部的污染的作用。不仅如此，在血样展开的时候，防止血样一边展开一边蒸发，血样 必定通过作为展开流路2上的反应部分的试剂固定化部3，在上述试剂固定化部3中，与 血样中的分析对象物的反应能高效地进行。这里所谓的来自外部的污染是指血样无意间 与该展开流路2上的反应部分的接触，或被验者的手等直接接触了展开流路2等情况。覆 盖上述展开流路2的液体不透过性片材7覆盖上述试剂固定化部3，该试剂固定化部3是 测定分析对象物的信号的部分，所以最好采用透明的材料并保持为至少可透光的状态。基板1用PET膜等液体不透过性片材构成，可以是透明、半透明、或不透明 的，如作为测定装置使用光学检测设备等情况下，需要测透射光时采用透明材料，测反 射光时则要采用不透明的材料。另外，基板1的材质为ABS、聚苯乙烯、聚氯乙烯等合 成树脂材料，也可采用金属、玻璃等液体不透过性材料。形成添加空间9的空间形成材料8不仅吸收保持一定量的血样，在使用添加血样 后的生物传感器时，还起着防止血样受外部污染的作用。该空间形成材料8可用ABS、 聚苯乙烯、聚乙烯树脂等合成树脂材料形成，也可用金属、玻璃等液体不透过性材料形 成，优选透明或半透明的材料，也可以是不透明的有色材料，或者为该不透明的材料时 可由任意的材料形成。图12A和图12B为表示本实施方式的添加空间9的空间形成材料8的结构的图， 图12A是空间形成材料8的分解立体图，图12B是空间形成材料8的立体图。如图12A 和图12B所示，在基板1的色谱展开方向下游侧部分上承载的添加空间9的空间形成材料 8例如可以由覆盖添加空间9的上表面部的片材19和覆盖添加空间9的两侧面部及一端面 部(色谱展开方向的下游侧面部)并规定作为微细空间的添加空间9的厚度尺寸的间隔物 16构成。在这种情况下，片材19和间隔物16可采用任意方法粘接。另外，在片材19 上设有气孔13，通过该气孔13来促进吸引血样的毛细管流。再有，通过调节添加空间9 的纵横向尺寸或间隔物16的厚度，能很好地确定添加空间9内可保持的血样体积。为了 促进毛细管力，可以对片材19作任意的处理。在展开流路2上的色谱下游端的开放部10未设置液体不透过性片材7，是开放 的，这样血样到达后或在到达过程中就会挥发或蒸发。此外，在开放部10液体试样会渗 出，只有在开放部10的展开流路2的上部，血样与添加空间9的展开流路2上部的液体 试样相同高度或至标准高度。据此，促进到达展开流路2上的开放部10处的血样的蒸发 和干燥，即使不在展开流路2设置吸水部也能促进色谱由上游侧向下游侧展开。按以上结构，使反应试剂承载于可利用毛细管力吸引血样并保持的添加空间9， 展开流路2被配设为其上游端部仅进入到比添加空间9内的血样吸引用开口部11更靠近 吸引方向内侧的位置为止，这样在将血样添加到添加空间9中并使其吸引时，反应试剂 很好地溶出于血样后再流入到展开流路2的上流端部展开。藉此，可使反应试剂以均一 状态溶出的血样流入展开流路2中，能以高精度进行定性或定量，并能很好地进行高灵 敏度测定。即，图18A 18C所示为比较例，和该比较例中的生物传感器一样，展开流路2 与基板1长度相同，展开流路2的上游端部跨越毛细管室12的流路长度方向的整个区域 伸入配置的情况下，在作为毛细管室12入口部分的开口部11及其附近不仅设置了反应试剂14，还设置了展开流路2的上游端部。因此，在毛细管室12中添加的液体试样中的一 部分会直接地、即在标记试剂不溶出的状态下流入到展开流路2中，其结果是，标记试 剂以不均一的状态溶出的液体试样在展开流路2中流动，这样在进行定量测定时就可能 无法获得足够的精度。与此对应，如果采用实施方式的生物传感器就不会发生以上所述 的不良情况。此外，在添加空间9的底面部分设置了辅助基板18进行填补以消除或减少与伸 入到该添加空间9中的展开流路2的上游端部和基板1之间形成的展开流路2的厚度相 当的段差，藉此缩小添加空间9的厚度方向的尺寸以保持毛细管力，因此，在添加空间9 中，吸引血样的毛细管力通常都能高效切实地发挥作用，这样就能提高定性或定量时的 精度。此外，反应试剂14在添加空间9中被承载于与沿着展开流路的厚度方向的该展 开流路2的延长线上的不同位置，因此，反应试剂以在加入添加空间9的血样中更加均一 地溶出的状态被导入展开流路2，能获得更准确且高精度和高灵敏度的测定结果。以上结构中，使反应试剂14中含有血细胞收缩剂，所以血样中的血细胞成分接 触到作为反应试剂的血细胞收缩剂时就会快速地收缩，实现其尺寸的均一化。其结果 是，可使不同大小的血细胞成分紊乱的血样的展开状态变得均一，并使反应变得均一， 进而使测定参差不齐的情况也得以改善，因此能够实现更高精度的测定。此外，通过使覆盖添加空间9中的基板1的一个端部的空间形成材料8由和基板 1对置的片材19以及决定添加空间9厚度的间隔物16构成，仅改变间隔物的厚度就能够 很容易地改变添加空间9内可保持的血样体积，因此，在可进一步简化生物传感器的构 造的同时能够将生物传感器的结构的不稳定所造成的反应程度的不稳定极小化，从而实 现更高精度的测定。以上结构中，设置了可通过毛细管力吸引并保持血样的添加空间9，藉此可切实 地吸引一定量的血样，而且，添加空间9中的至少面向添加空间9的地方由液体不透过性 材料构成，所以可实现添加空间9本身并不保持血样、能够保持10 μ L以下的血样的添加 空间9。S卩，本发明可将目前的所添加的液体试样被保留在构成材料中而产生未展开的 损失检体(死体积)的情况的发生概率降到最低限度，其结果是，与现有的色谱传感器比 较，可大幅度地削减检体(血样)量。此外，通过提供即使不用分配器或玻璃吸管、注射器等也能把作为一定量液体 试样的血液良好地保持且可完全溶出标记试剂和其它的反应试剂并同时能够大幅度削减 所添加的血液量、实现微量化，而且可使标记试剂以均勻的状态溶出的血液很好地流入 展开流路的生物传感器，能够提供下述准确且高精度、高灵敏度的作为免疫色谱传感器 的生物传感器在可实现以免疫反应为基础的生物传感器的测定精度的提高的同时，不 破坏现有的免疫色谱传感器所具备的便利性，无论什么时候什么场合谁都能测定，而且 能实现以微量的血液等液体试样进行的测定。另外，由于反应试剂14被保持在添加空间9内，所以反应试剂14不会滞留在添 加空间9或被吸附而是能够完全溶出，这样不仅反应试剂14的溶出变得稳定，而且在添 加空间9内与血样接触后溶解或发生水合，扩展至全部的血样中并进行反应后，可在展开流路2中展开，这样就避免了反应试剂14的残留及与反应试剂未反应的血样的展开。如上所述，实现了反应试剂14的100%的溶出，避免了未反应血样的展开，藉 此可实现更准确且高灵敏度的测定。以下，通过图9和图13简单地对分析装置104进行说明。如图9所示，分析装 置104以生物传感器20的一部分(未图示，为添加空间9的开口部11)露出在外部的状 态自由装载。如果以生物传感器20安装于分析装置104的状态添加指尖血等血样S，则 通过毛细管流血样被吸引向添加空间9。如图13所示，为了检测生物传感器20中的展开流路2的状况及试剂固定化部3 的反应程度，分析装置104上装有图像传感器102、照射光源(LED等)103及显示部106 等，通过图像传感器102获得的任意信息都被设置在分析装置104上的数据收集部105收 集，通过基于这些信息的演算处理，在显示部106上将血样中的分析对象物是否存在及 其浓度作为测定结果显示出来。所述分析装置104的分析方法仅是一个例子，可以采用除此以外的任意方法(例 如，图像传感器和光照、光电二极管与光照)。如上所述，只要进行向安装于分析装置104的生物传感器20添加血样的操作， 就可进行对分析对象物的定性或定量测定。产业上利用的可能性本发明的生物传感器在基于抗原抗体反应这样的反应检出液体试样中的分析对 象物并进行定量或半定量测定时，可用作为简便且迅速、可实现高灵敏度和高精度的测 定的、面向POCT的分析装置的生物传感器。
权利要求
1.生物传感器，所述生物传感器包括添加液体试样的试样添加部、与液体试样进行 反应的反应试剂、展开混有反应试剂的液体试样或与反应试剂进行了反应的液体试样的 展开流路，用于测定液体试样中是否存在分析对象物或其浓度，其特征在于，所述试样添加部通过用由液体不透过性材料形成的空间形成材料包围 添加空间而构成，所述反应试剂以可在添加于添加空间的液体试样中溶出的状态被保持 在所述试样添加部的空间形成材料的面向添加空间的位置，所述展开流路由所述试样添 加部内的液体试样和所述反应试剂可通过毛细管力而移动的材料构成，测定区域被配置 于展开流路的一部分。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，反应试剂被配置于试样添加部的与 展开流路的延长线上的面不同的位置。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，展开流路沿作为支承体的基板的表 面配置，反应试剂被保持在空间形成材料的与所述基板的表面隔开距离对置的上表面部 背面。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，基板配置有作为规定添加空间厚度 的间隔物发挥作用的辅助基板。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，空间形成材料上形成有促进液体试 样向添加空间的吸引的气孔。
6.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，测定区域由固定有可与分析对象物 或反应试剂发生特异性反应的试剂的试剂固定化部形成。
7.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，反应试剂包含可与分析对象物或固 定化试剂发生特异性反应的标记试剂。
8.如权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，标记试剂中可与分析对象物或固定 化试剂发生特异性反应的试剂被标记于不溶性粒状标记物。
9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，不溶性粒状标记物选自着色聚合物 珠子、金属、合金及聚合染料粒子。
10.如权利要求6所述的生物传感器，其特征在于，特异性反应为抗原抗体反应。
11.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，反应试剂为标记试剂以外的试剂。
12.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，具备覆盖展开流路的表面的液体 不透过性片材。
13.如权利要求12所述的生物传感器，其特征在于，液体不透过性片材覆盖从试样添 加部的添加空间的一部分或近旁开始至少至试剂固定化部为止的范围。
14.如权利要求12所述的生物传感器，其特征在于，液体不透过性片材在展开流路的 下游端部不覆盖该展开流路。
15.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，展开流路的沿流动方向的两个侧 面被覆盖或密封。
16.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，液体试样为血液。
17.如权利要求16所述的生物传感器，其特征在于，反应试剂为细胞收缩剂或含细胞 收缩剂的混合试剂，该细管收缩剂与血液中的血细胞成分反应，使得血液以血细胞成分收缩的状态在展开流路中展开或于血细胞成分收缩的同时在展开流路中展开。
18.如权利要求16所述的生物传感器，其特征在于，试样添加部的添加空间可利用毛 细管力吸引指尖血。
19.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，反应试剂及固定化试剂以干燥状 态被保持及固定于生物传感器，并溶于液体试样或与液体试样发生水合。
20.如权利要求19所述的生物传感器，其特征在于，反应试剂以溶液状态被涂布于空 间形成材料的内表面后干燥，固定化试剂以溶液状态被涂布于展开流路后干燥。
21.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，试样添加部的添加空间的吸引容 积为10 μ 1以下。
22.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述添加空间被液体不透过性材 料形成的空间形成材料包围而构成，所述展开流路的上游部分从添加空间的一方的端部 侧进入添加空间，所述展开流路的上游端部的进入位置是比形成于所述添加空间的另一 端部侧的液体试样吸引用开口部更靠近吸引方向内侧的位置。
23.如权利要求22所述的生物传感器，其特征在于，展开流路被支承于基板上，添加 空间作为所要的吸引空间由与展开流路的上游端部对应的基板的一个端部和覆盖该基板 的一个端部的空间形成材料形成，展开流路具备规定厚度，在添加空间设有辅助基板， 该辅助基板为了消除或减少与进入该添加空间的展开流路的上游端部和基板之间形成的 展开流路的厚度相当的阶差而对添加空间进行填补，缩小添加空间的厚度方向的尺寸， 保持毛细管力。
24.如权利要求22所述的生物传感器，其特征在于，展开流路被支承于基板上，添 加空间部由与展开流路的上游端部对应的基板的一个端部形成，并作为所要的吸引空间 由规定添加空间厚度的辅助基板和与基板对置并覆盖基板的一个端部的空间形成材料形 成。
全文摘要
本发明提供可提高测定精度的同时不论是谁在任何时间和地点都能进行测定、且可实现微量检体的测定的、准确且高精度和高灵敏度的生物传感器。包括试样添加部12和展开流路2的所述生物传感器中，试样添加部12通过用由液体不透过性材料形成的空间形成材料8包围添加空间9而构成，含标记试剂的反应试剂14以可在添加空间9中添加的液体试样可溶出的状态被保持在试样添加部12的空间形成材料8的面向添加空间9的位置。藉此，不仅可减少测定所需的检体量，而且标记试剂可完全溶出与全部液体试样反应并展开，能够实现高精度和高灵敏度的测定。
文档编号G01N33/543GK102016584SQ20098011589
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月23日 优先权日2008年5月7日
发明者川真田怜子, 高桥三枝 申请人:松下电器产业株式会社