用于流感免疫应答测量的阵列检测器系统的制作方法

专利名称：用于流感免疫应答测量的阵列检测器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及设计用于检测对于特定抗原的免疫应答的传感器芯片，其可用于检测 个体之前暴露于具有抗原的病原体，以为了流行病学目的来监测在个体群中传染的程度， 或测量疫苗针对所述病原体的效力。
背景技术：
流感病毒是膜包围的(membrane-enclosed)RNA病毒，其基因组由离散的阴性-正 义RNA的链段构成，并且主要是禽类和人的传染剂(Lamb et al. ,"The Gene Structure and Replication of Influenza Virus,，，Annu Rev Biochem52 :467-506 (1983))。负责 停靠的流感蛋白，血细胞凝集素(HA)和出芽神经氨酸酶(NA)锚定于病毒脂质膜中，并且 是预防和治疗传染的主要抗原关注点。有三种不同的流感病毒属-称为A、B和C，并且通 常区别在于结构蛋白-其引起不同严重程度的免疫学效果(Cox et al. ,"The Molecular Epidemiology of Influenza Viruses, " Semin Virol 6 :359-370 (1995))，例如和流感有 关的典型症状(Monto et al. , "Clinical Signs and Symptoms Predicting Influenza Infection, "Arch Intern Med 160:3243-3247(2000))。流感 A 和 B 是最免疫相关的，因 为它们在人群中具有共同循环传播的季节传染性(Lin et al. ,"Recent Changes Among Human Influenza Viruses, "Virus Resl03 :47-52 Q004))，并且流感 A 对于所有记录的大 流行负责。流感A传染除了人的多种不同的动物种，包括鸭子、鸡、猪、鲸、马和海豹。流感 B病毒通常只传染人。所有三种类型的流感病毒具有由8种不同RNA螺旋构成的基因组，所述螺旋编码 单独基因，并且结合决定病毒类型A、B或C的核蛋白。实际上，流感基因组由8种单独的核 酸片构成，当细胞受到多于一种病毒类型的共传染时，其可以一起形成具有新的病毒基因 组合的病毒。这些RNA螺旋中的两种编码重要的病毒表面蛋白-血细胞凝集素和神经氨酸 酶，它们嵌入成熟病毒颗粒的脂质双层中。病毒血细胞凝集素和神经氨酸酶的变化决定了病毒亚型。血细胞凝集素负责病毒 进入宿主细胞，而神经氨酸酶在新形成的病毒从传染的细胞中释放中是重要的。血细胞凝 集素的抗体可以中和病毒，并且是免疫性的主要决定簇。神经氨酸酶的抗体不中和病毒，但 是可限制病毒复制和传染过程。特定类型的血细胞凝集素和神经氨酸酶的宿主抗体预防并 通常改善相同病毒毒株的将来传染。然而，由于病毒毒株的基因构成是动态和不断变化的， 因此在传染一年的过程中获得的通过成功耐受一种毒株而具有的免疫性可能在下一年在 抵抗新的重组变异毒株中是无用的。
在由于抗原性漂移的过程病毒毒株跟随时间而变化时，流感流行被认为产生。抗 原性漂移(由主要病毒抗原基因的突变引起，特别是在血细胞凝集素或神经氨酸酶基因中 的突变)导致表面抗原较小改变，并且随着时间基本上连续地发生。当这些改变在基因中 的合适位置发生时，它们产生抗体不识别的新的抗原，所述抗体是在之前传染过程中针对 其他流感病毒毒株而产生的。流感大流行(或世界范围流行)由于“抗原性转变”而发生。抗原性转变是流感 A病毒中的突然、主要的改变，其源自在流感A毒株中出现的新的血细胞凝集素和/或新的 血细胞凝集素和神经氨酸酶蛋白。这种转变通常被认为是在下列条件下产生的产生病毒 基因组RNA的新的联合时，可能在非人种中，并且新的联合传播给人。当发生这种抗原性转 变时，大部分人对于病毒具有较小保护或没有保护，因此传染可以证明是致命的。周期性地，流感病毒的独特毒株可出现，并且病原体的抗原新颖性导致传染 率、传播率和死亡率增加。历史显示这些流感大流行可以是极度致死的。例如，“西 班牙流感”(Johnson et al. ,"Updating the Accounts :Global mortality of the 1918-1920 “Spanish” Influenza Pandemic，”Bull Hist Med76 :105-115(2002)) (H1N1 ； 1918-1920 超过 5 千万人死亡)、“亚洲流感”(Rajagopal et al.，"Pandemic (avian) Influenza，” Semin Respir Crit Care28 159-17(^2007)) (H2N2 ； 1957-1958，1 百万人死 亡)，禾口“香港、流感，，(Shalala et al. ,"Collaboration in the Fight Against Infectious Diseases，” Emerg Infect Dis 4 :354-357 (1998)) (H3N2 ; 1968-1969，700，000 死亡)证实 病毒的效力和其快速世界范围内传播的能力，另外，传染性毒株可出现的快速性和我们对 于它们先天的耐受性也明确地强调。为了抵抗这些大流行，在二十世纪四十年代中期开发 了第一种单价和二价流感疫苗，其由灭活流感病毒构成(Henle et al. ,"Demonstration of the Efficacy of Vaccination Against Influenza Type A by Experimental Infection of Human Beings, "J Immunol 46 :163-175 (1943),Francis et al. ,"Protective Effect of Vaccination Against Induced Influenza A,，，J Clin Invest 24:536-546(1945), Salk et al. , "Protective Effect of Vaccination Against Induced Influenza B,，，J Clin Invest24 :547-553(1945)).从那之后三价流感疫苗变得标准并且由三种灭活毒株 I^J(Halperin et al. , "Safety and Immunogenicity of a Trivalent, Inactivated, Mammalian Cell Culture-derived Influenza Vaccine in Healthy Adults, Seniors, and Children，” Vaccine 20 : 1M0-1247 Q002))，或由三种活的减毒毒株构成(Belshe et al. , "The Efficacy of Live Attenuated, Cold-adapted, Trivalent, Intranasal Influenzavirus Vaccine in Children, "New Engl J Med 338 1405-1412 (1998)) - Mft 流感A和一种流感B-以提供针对共循环传播的季节性毒株的更广的预防措施。由于这些 初期努力，已经进行了多种研究，所述研究基于重组技术针对开发改善的更多包膜疫苗以 不仅针对当前病毒毒株产生免疫(Kilbourne et al. ,"Future Influenza Vaccines and the Use of Genetic Recombinants, "Bull World Health Org 41 :643-645(1969),Webby et al. ,"Are We Ready for Pandemic Influenza ？ ，”Science 302 :1519-1522(2003), Treanor et al. , "Safety and Immunogenicity of a Baculovirus-Expressed Hemagglutinin Influenza Vaccine :A Randomized Controlled Trial,，，J Am MedAssoc 297 :1577-1582 (2007))，还提供针对过去流行的毒株的保护。
禽流感，命名为H5N1，是目前国际上主要研究努力的对象。过去的流感大流行已 经证明在缺乏合适的防护时，流感的新和高病原性毒株可以是极度致死的。随着全球人口 的增加和国际旅游和贸易的进展，大流行的后果将变得严重。自从其初始在1997分离以 来(de Jong et al.，“A Pandemic Warning ？ "Nature 389 :554(1997))，已近报道 380 M H5N1, -^ 240 A^t (World Health Organization, "Epidemic and Pandemic Alert and Response :Avian Influenza, "accessed online from the WHO on April 16,2008)。 这些报道的情况中的大多数都是从禽类传播至人，但也报道了人与人之间传播的分离的情 况(Ungchusak et al,"Probable Person-to-Person Transmission of Avian Influenza A(H5N1), "N Engl J Med 352 :333-340 (2005)) 近期报道了 A型H1N1，猪流感的毒株，其具有独特的基因性能并且能够在人与人 之间传播。初始发作出现在墨西哥，但现在病例已经在美国和世界其他地区的大多数城市 中心报道。截止2009年4月30日，世界卫生组织已经升至5期的警报水平。疫苗作为针对疾病的预防措施是必须的，但是传统药物基治疗法在疫苗供应受 到限制或无法获得的情况下、高毒力流行病毒毒株(例如禽类流感H5m)特别严重的情 况下也是需要的(Kilpatrick et al. ,"Predicting the Global Spread of H5N1 Avian Influenza, "Proc Natl Acad Sci USA103 19368-19373 (2006)) 例如，神经氨酸酶，控 制新包装的病毒从宿主细胞膜中释放的流感酶(Wagner et al. , ”Interdependence of Hemagglutinin Glycosylation Neuraminidase as Regulators of Influenza Virus Growth =AStudy by Reverse Genetics，，，J Virol 74 :6316-6323 (2000))在流感生命周 期中是吸引人的药物靶。奥塞米韦(TAMIFLU ) (Kim et al.，“ Influenza Neuraminidase Inhibitors Possessing a Novel Hydrophobic Interaction in the Enzyme Active Site :Design, Synthesis, and Structural Analysis of Carboxylic Acid Sialic Acid Analogues with Potent Anti-Influenza Activity, " J Am Chem Soc 119: 681-690(1997))是口服活性抗病毒剂，其起到神经氨酸酶的活性位点的转移状态模拟剂 的作用。目前显示，世界中心地区开始囤积TAMIFLU 供应(和其他抗病毒剂，例如在突 发流行的情况下(Moscona etal.，“Neuraminidase Inhibitors for Influenza,，，New Engl J Med353 :1363-1373(2005))扎那米韦(Itzstein et al.，“Rational Design of Potent Sialidase-Based Inhibitors of Influenza Virus Replication，，，Nature363 418-423(1993)))。尽管抗病毒剂能够起到治疗效果，预防而不是反应的措施将最终 确保针对致死性流感病毒大流行的长期成功，因为很容易出现流感的耐药性形式(de Jong et al. , "Oseltamivir Resistance During Treatment of Influenza A (H5N1) Infection, "New Engl J Med 353 :2667-2672 (2005)) 源自研究者的生产和扩增重组蛋 白和来自编码它们的基因的能力的辅助开发是高通量微阵列。尽管高通量筛选的初始应 ffl^^^SiailPi^J (Schena et al. ,"Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns With a Complementary DNA Microarray, "Science 270 :467-470(1995), Lipshutz et al. , "High density Synthetic Oligonucleotide Arrays, " Nat Genet 21 :20-M(1999))，但是已经发现蛋白微阵列也具有多种显著的应用。例如，通过蛋白 微阵列的蛋白组分布研究已经揭示了大量新的相互作用(MacBeath et al. , "Printing Proteins as Microarrays for High—Throughput Function Determination,，，Science289 :1760-1763(2000) , Michaud et al. ,"Analyzing Antibody Specificity With Whole Proteome Microarrays, "Nat Biotech 21 :1509-1512(2003), Chan et al., "Protein Microarrays for Multiplexed Analysis of Signal Transduction Pathway s," Nat Med 10 1390-1396 (2004)) 蛋白微阵列已经用于开发抗原蛋白和监控 对于它们的人免疫应答(Davies et al. , "Profiling the Humoral Immune Response to Infection by Using Proteome Microarrays High-Throughput Vaccine and Diagnostic Antigen Discovery,"Proc Natl Acad Sci USA 102 :547-552(2005), Li et al. , "Protein Microarray for Profiling Antibody Responses to Yersinia pestis Live Vaccine,，，Infect Immun 73 :3734-3739 (2005), Qiu et al. , "Antibody Responses to Individual Proteins of SARS Coronavirus and Their Neutralization Activities, "Microbes Infect7 =882-889 (2005)) 该策略之前没有用于多种同种型流感 抗原血细胞凝集素的固定。此外，在这种报道中的各种情况下，使用标记的试剂实现检测。将期望提供固定的抗原同种型阵列，其可用于在使用未标记的试剂的情况下筛选 针对传染剂的抗体和包括多种类似特异性(例如在传染剂的不同毒株之间的区分，所述传 染剂例如基于由这些传染剂或针对它们的疫苗所产生的免疫应答的流感)的疫苗。考虑到 可能的流感大流行，还期望开发能够筛选推定疫苗治疗的针对各种流感毒株的效力和/或 交叉保护。此外，在监控疾病的状态和传播时，能够快速筛选禽类流感或其他野生动物和家 畜中的毒株存在的系统具有显著的实用性。本发明旨在克服本领域这些和其他缺陷。

发明内容
本发明的第一方面涉及用于检测针对流感病毒的免疫应答的传感器芯片。传感器 芯片包括具有表面的基板和与所述基板的所述表面上的离散位置结合的多个血细胞凝集 素多肽，各血细胞凝集素多肽具有血细胞凝集素表位，优选其免疫显性表位。传感器芯片可 以任选地包括与所述基板的所述表面上的离散位置结合的多个神经氨酸酶多肽，各神经氨 酸酶多肽具有神经氨酸酶表位。在优选的实施方案中，传感器芯片适用于阵列成像反射测量术(“AIR”)检测系 统、表面等离子体共振(“SPR”)检测系统、Brewster角离散干涉测量术(Brewster Angle Straddle Interferometry) ( “BASI”)检测系统和椭圆对称检测系统。本发明的第二方面涉及检测系统，其包括根据本发明的第一方面的传感器芯片。 检测系统优选包括被定位以照射所述芯片的光源；以及检测器，所述检测器被定位以检测 从所述芯片表面反射的光线，从而测定抗体是否结合所述血细胞凝集素多肽。本发明的第三方面涉及用于检测样品中的抗-流感抗体的流通池。流通池包括 具有入口和出口的基底；透光盖，所述透光盖以基本上流体密封的方式设置在所述基底上， 并且和所述基底形成隔室，通过所述隔室流体可以从所述入口流到所述出口 ；并且根据本 发明的第一方面的传感器芯片；所述传感器芯片位于所述隔室中，并且通过所述透光盖暴 露于入射光，从而用于以合适的入射角照射所述芯片表面的入射光在不存在结合血细胞凝 集素多肽的抗体的情况下实现几乎完全相消干扰的条件，和在存在结合血细胞凝集素多肽 的抗体的情况下实现光反射率的实质性改变的条件。
本发明的第四方面涉及检测系统，包含根据本发明的第三方面的流通池；和所 述流通池的所述入口流体连通(fluid communicate)的流体样品源；被定位以照射所述芯 片的光源；以及检测器，所述检测器被定位以检测从所述芯片表面反射的光线，其中所述照 射光的所述入射角适于产生下列条件在不存在结合血细胞凝集素多肽的抗体的情况下几 乎完全相消干扰和在存在结合血细胞凝集素多肽的抗体的情况下光反射率的实质性改变。本发明的第五方面涉及传感样品中的抗-流感抗体的方法，该方法包括提供根 据本发明的第二或第四方面的检测系统；在所述传感器芯片表面处导向光线；在有效地允 许样品中的抗-流感抗体特异性结合被所述抗体识别的血细胞凝集素多肽的条件下使所 述传感器芯片和所述样品接触；以及在有效地鉴定结合所述样品的抗体的血细胞凝集素多 肽的条件下检测从所述芯片反射的光线。在优选的实施方案中，检测使用MR检测系统、Sra检测系统、BASI检测系统或椭 圆对称检测系统来进行。本发明的第六方面涉及使用根本本发明的第四方面的检测系统来传感抗-流感 抗体的方法，该方法包括下列步骤以有效地导致几乎完全相消干扰的条件的方式在所述 传感器芯片处导向光线；将流体样品加入所述流通池；测量从所述芯片反射的光线；以及 基于所述测量的反射光，提供鉴定结合所述流体样品的抗体的血细胞凝集素多肽的输出。本发明的第七方面涉及筛选流感疫苗的效力的方法。该方法包括下列步骤将流 感疫苗施用至一个或更多个个体；从所述一个或更多个个体获得血清样品；以及进行根据 本发明的第五或第六方面的方法，以测量由所述流感疫苗产生的抗-流感免疫应答。含有流感血细胞凝集素多肽阵列的本发明的传感器芯片已被证实在少于30分钟 内使用无标记“无试剂”技术产生检测结果，并且所述结果显示为和那些通过比较ELISA测 定衍生的结果一致，而比较ELISA测定采用更长的时间来进行并且根据样品和传感器芯片 的反应需要加入另外的标记的试剂。因此，本发明提供用于测量疫苗效力和流感病毒毒株 的交叉反应性的更快、可靠的检测系统。本文中的实施例证实通过使用A^检测系统来实 施，和ELISA相比可以在单独试验中筛选在更宽的动态范围的抗体滴度。附图简述

图1示意性示出A^检测系统。图2是本发明的流通池的剖视图，其包括适于在MR检测系统中用于水性环境的 传感器芯片。图3示意性示出椭圆对称检测系统。图4A示意性示出SPR检测系统。图4B示出SPR的输出。图5A-B是来自Genbank登录ABW80979 (毒株A/新喀里多尼亚/20/1999，H1N1) (SEQ ID NO :1)、ATO31033(毒株 A/怀俄明州/3/2003，H3N2) (SEQ ID NO :2)、EF541403 (毒 株A/越南/1203/2004，H5N1) (SEQ IDNO :3)、AF250479 (毒株A/短颈野鸭/香港/W312/199， H6N1) (SEQ ID NO 4)和 NC_004908 (毒株 A/ 香港 /1073/1999，H9N2) (SEQ ID NO 5) 的血细胞凝集素序列的比对，其均通过引用的方式整体并入。该比对使用Multalin版 5. 4. 1 (Corpet,"Multiple Sequence Alignment with Hierarchical Clustering,，，Nucl. Acids Res.，1602) :10881-10890(1988)来制备，其通过引用的方式整体并入。在共有序 列(SEQ ID NO 6)中，符号“！ ”表示I或V，符号“$”表示L或M，符号“ ％ ”表示F或Y和
9符号“#”表示N、D、Q、E、B或Z中的一个。X可以是任何氨基酸。共有序列中的大写字母表 示绝对保守氨基酸残基(100%同一性)，而小写字母表示优势残基(50-99%同一性)。图6示出血细胞凝集素的三维结构，不同颜色表示五种HA同种型H1N1、H3N2、 H5NUH6N1和H9N2的序列同源性。‘黑色，表示完全同一性，‘暗灰色，表示序列类似和‘浅 灰色，使各种序列符号化。左侧结构是HA病毒外结构域刺突的侧视图，右侧结构是HA受体 结合位点的俯视图。图7示意性示出手工制备本发明的血细胞凝集素阵列的关键。图8A-B分别是使用来自疫苗试验对象的未稀释的血清治疗前和后阵列化流感测 试芯片的图像。基于选择的抗原斑的反射强度差异的结果图示于图9中。图9是示出在暴露于来自六个临床对象的血清时所有HA同种型的反射率变化量 的图。参照图7中阵列关键中对于全抗原的描述，α-荧光素对照在图中表示为“抗-F”。图10是示出证实ELISA和western印迹结果的对象样品的A^数据的比较分析 的图。对象1是对象056 ；对象2是对象080 ；安慰剂对照是对象079。H5血细胞凝集素是 H5，3(越南 /1203/2004)。图11是示出H5N9禽类抗血清滴定结果的图。相对于α-荧光素阴性对照斑中的 改变，将所有反射率变化归一化。重组GFP起到第二阴性对照和补充阳性加标对照的作用。 IgY抗体起到试验阳性对照的作用。暴露于单独缓冲液的第二组芯片是0.0%对照阵列。图12是Η7Ν3抗血清试验的HA微阵列的AIR图像。所述芯片暴露于10% Η7Ν3 抗血清溶液。各探针类型以一列印刷8次。从左至右，探针分子是出1、!13、！15、!16、空白、 α -IgY > α-IgG和α-荧光素。注意α -荧光素阴性对照不容易看到，α-IgY在该浓度的 抗血清下是几乎没有活性的。图13是示出以连续10 稀释的形式进行的Η7Ν3禽类抗血清滴定结果的图。相 对于α-荧光素对照斑将所有变化归一化。将各浓度重复三次。图14是显示在5%稀释下筛选的对象抗血清的结果的图。“缓冲液”柱对应于来 自六个试验的MPBS-ET对照芯片的平均值和标准偏差，HA阵列应答根据对象数量和接受的 Η5剂量(微克)标记。图15是显示对于从5%至0. 04%的Iog5抗血清稀释对象06FR0033的接种前和 后的反射率变化的比较的图。图16是示对于从5%至0. 04%的抗血清滴定对象06FR0033的结果的图。图17Α-Β示出人抗血清试验的自动印刷的HA微阵列。示出背景图像(图17Α) 和暴露于5%抗血清的试验阵列的图像(图17Β ；对象071)。从左至右，斑身份是α -IgG, α -IgM, α -荧光素、HAS、空白、HI、H3、H5、H6 和 H9。图18示出用于安慰剂对象064的抗血清滴定。发明详述本发明的一个方面涉及用于检测针对流感病毒的免疫应答的传感器芯片。传感器 芯片包括具有表面的基板和与所述基板的所述表面上的离散位置结合的多个血细胞凝集 素多肽，各血细胞凝集素多肽具有血细胞凝集素表位，优选其免疫显性表位。传感器芯片的总体设计和构造可以根据其应用于的特定检测系统而改变。这些包 括例如但不限于设计用于MR检测系统、Sra检测系统、BASI检测系统和椭圆对称检测系统的传感器以及任何其他无标记或荧光标记的阵列技术。A^检测系统描述于美国专利No. 7，292，349 (Miller et al)，其通过引用的方式 整体并入，该构造示于图1。系统10包括光源12、偏振器14、受器16(即，本发明的功能化 传感器芯片)和检测器18。光源12产生和朝向受器的表面传输设定波长的光线(L)。一 个或更多个透镜和滤光器可用于优化所述系统。A^利用来自受器上的介质/覆层和覆层 /基板界面的反射之间的干扰，在使生物分子结合覆层时显示出反射率的变化。实际上，使 用具有氧化物覆层的硅晶片，入射角和波长的明智选择可使用S-偏振光以在不存在靶的 情况下(在该情况下是抗血细胞凝集素抗体)获得几乎完全相消干扰(即反射率优选小于 约10_5，或在一些情况下甚至小于10_6)。在靶结合后除去几乎完全(或几乎完美)相消干 扰的条件。因此，甚至更小量的抗-血细胞凝集素抗体的高灵敏度检测也是可能的。尽管使用S-偏振光的AIR已经证明具有高灵敏度，但是定量检测多种生物分子分 析物的简便分析方法，在上述参考文献美国专利No. 7，292，349 (Miller et al.)中所述的 系统，更容易在干燥状态下操作，即，利用空气/氧化物界面而不是水/氧化物界面。在水 环境中进行MR的改善系统在共同待审美国专利申请No. 12/261, 818 (Mace et al.)和PCT 国际申请No.PCT/2008/081804(Mace et al.)中有所描述，其通过引用的方式整体并入。基 本上，本文所述的流通池允许S-偏振光耦合到水性环境中以检测靶结合。使用该相同的流 通池，其含有功能化有多个血细胞凝集素多肽的传感器芯片，也在本文的涵盖中。流通池示于图2中。流通池包括基底112、90°棱镜形式的透光盖114、位于基底 和盖之间的衬垫116和一个或更多个安装支架118，所述安装支架118用于以基本上流体 密封的方式固定基底和盖。基底112包括形成在其一面中的孔120以及分别经过通道1 和1 和孔连通(communicate)的入口 122和出口 124。入口 122和出口 1 形成在基底 的相对端上，使得连通孔120的通道1 和1 确保当置于孔中时流体流过芯片130。为了 辅助就此而言的流体流过，凹痕131形成在孔的各端出的孔120的侧壁中，使得流体可以容 易地从通道1 流到孔中，和通过通道1 从孔中流出。通道1 和1 优选设置有配件 132，其允许导管或其他形式管连接至流通池。例如，流体样品源可以连接至入口 122，出口 IM可连接至另外的流体分析仪或仅连接至废液储库。芯片130优选通过成角度的芯片支 撑器140支撑在孔120中。在干式和湿式AIR系统中，传感器芯片具有相同的功能构造，具有基板、基板上的 一个或更多个覆层，然后探针分子-在该情况下血细胞凝集素多肽-结合覆层表面。在上 述参考文献美国专利No. 7，292, 349 (Miller et al.)，美国专利申请No. 12/261, 818 (Mace et al.)和PCT国际专利申请No. PCT/2008/081804(Mace et al.)中所述，多种不同材料可 被选择用于基板和一个或更多个覆层。任何合适基板和覆层的组合都涵盖于MR检测系统 中使用的传感器芯片中。BASI检测系统在美国专利公开No. 20070076214 (Rothberg)中有所描述，其通过 引用的方式整体并入。类似MR系统，BASI系统利用来自介质/覆层和覆层/基板界面的 反射之间的干扰，在使生物分子结合覆层时显示出反射率的变化。所述系统的基本设计类 似于图I(AIR)中所述，但是传感器芯片的结构有区别。BASI系统功能化有任何基板/覆层 组合，其中覆层非常薄(例如硅上的天然氧化物膜)，并且当两个界面(基板/覆层或覆层 /介质)中的一个上的入射角大于其Brewster角，两个界面中的另一者上的入射角小于其业开发用于入射s_偏振光的A^系统，BASI系统依赖ρ-偏振光的 检测。作为Brewster角离散和ρ-偏振光的结果，其中覆层厚度<< λ，反射偏振的相位翻 转允许几乎完全相消干扰(其中反射率优选小于约10_4，或甚至在不存在靶结合的情况下 小于10_5)。对于A^检测系统，甚至更小量的抗-血细胞凝集素抗体的灵敏度检测也是可 能的。椭圆对称检测系统测量反射光的偏振分量作为传感器芯片的表面上覆层厚度改 变的度量。当电磁辐射被样品反射或透射时，椭圆对称法灵敏地检测偏振态的改变。这种椭 圆对称检测系统的典型实施方案示于图3，包括发射准直光束的光源，所述准直光束通过由 线性偏振器(P)和四分之一波长试板(C)形式的补偿器的组合提供的可变偏振控制器。偏 振光束在已知斜角下入射到传感器表面( 上，从样品表面反射，并且通过连接至合适的 光检测器(统称A)的第二线性偏振器来分析。在该椭圆对称器构造中，测量可通过下列方 式进行改变组件P和A的方位角，同时C的光学轴保持为恒定方位角(例如相对于入射面 45° )，直到光检测器接受最小强度。对于该“无效”条件的组件P、C和A的方位角可用于 计算椭圆对称角Delta和I^si，它们对于在给定入射角和光线波长处的样品的光学参数是 特异性的。使用合适的光学模型和数值回归，量Delta和I^i可就其生长过程中的光学层的 厚度或改变而言重新计算。使用椭圆对称法监控生物分子的结合反应追溯到1942 (Rothen et al. ,"Serological Reactions of Protein Films and Denatured Proteins,"J. Exp. Med 76 :437(1942),其通过引用的方式整体并入)，其中在结合反应中在表面处吸附的生 物材料的量可从量Delta和Psi来重新计算。成像椭圆对称法，如美国专利No. 5，076，696 (Cohn et al.)中所述，其通过引用 的方式整体并入，使用空间解析检测器和成像光学仪以允许椭圆对称数据的大规模平行测 量，例如以Delta和/或I^i图的形式。这些图可进而转化成层厚度、光学折射率、在阵列 上的各斑的吸附的材料的化学组成或量的表面图。利用其内在平行检测方案的成像椭圆对 称法可有利地用作这些所谓的生物芯片、微阵列或微板的检测技术(Eing et al. ,Imaging Ellipsometry in Biotechnology, ISBN 3-9807279-6-3 U002)，其通过引用的方式整体并 入)。成像椭圆对称法已经证实利用用于测量照射到待测表面上的来自环境介质的光 线。其他测量构造基于全内反射，如美国专利NO.6，594，011(Kempen，)中所述，其通过引用 的方式整体并入。此处，来自光源的光线被导向通过内反射元件以将待检测的样本反射掉。检测信号的改善可使用sra椭圆对称法获得，如图4A中所示。在sra椭圆对称法 中使用的基板232使用薄金属层234以允许表面等离子体的激发和传播。尽管金属层234 的一侧和透明支撑结构236接触，但是通常连接棱镜238以允许光线在斜角下耦合进来，所 述层的另一侧暴露于环境介质M0。在环境中由于形成吸附层(例如抗体244结合表面结 合的血细胞凝集素多肽对2)而导致的光线折射率的改变被监控为入射角的偏移(△ Θ)， 其产生表面等离子体共振，从而引起反射光强度改变(参见图4B)。对于SI^R基传感器，已 知金属膜和探测的表面之间的中间电介质层可起到进一步增加灵敏度的构件的作用。一种示例性SI3R基板在美国专利No. 7，332，329 (ffark et al.)中有所描述，其通 过引用的方式整体并入。该sra基板特别适用于血细胞凝集素多肽的生物分子阵列，其中 基板包括多个金属岛，所述金属岛由疏水层或电介质材料包围，并且血细胞凝集素多肽结
无论旨在施用基板的传感器芯片基板或检测系统如何，传感器芯片包括与所述传 感器芯片的所述表面结合的多个血细胞凝集素多肽。结合至传感器芯片表面的各血细胞凝 集素多肽可以是全长蛋白或其多肽片段。所有生物传感器固有的特点，无论标记状态或信号转导的方式，都是探针固 定。二氧化硅表面的末端羟基的作用是在其可起到亲核试剂作用(Bikiaris et al., “Compatibilisation effect of PP-g-MA copolymer on iPP/Si02 nanocomposites prepared by melt mixing, " Eur Polym J 41 1965-1978 (2005) ；Tripp et al., “Chemical Attachment of Chlorosilanes to Silica :A Two-step Amine-promoted Reaction, "J Phys Chem 97 :5693-5698 (1993)，其均通过引用的方式整体并入)或支 持吸附时是高度挠性的。为此，二氧化硅容易通过多种化学方法来衍生化。这些化学 反应导致羟基有效地转变为多种化学官能团中的任一种，包括但不限于胺(Huang et al.，“Directed Assembly of One-dimensional Nanostructures Into Functional Networks，"Science 291 :630-633(2001),其通过引用的方式整体并入)或卤化物 (Hergenrother et al. ，“Small-molecule Microarrays :Covalent Attachment and Screening of Alcohol-containing Small Molecules on Glass Slides，”J Am Chem Soc 122 :7849-7850 (2001)，其通过引用的方式整体并入)。从各初始反应中，第二化学物 可加入以进一步改变表面反应性，或探针可直接偶接。另外，多种官能化硅烷，在二氧化硅 上偶联和自组装的分子(Onclin et al. ,"Engineering Silicon Oxide Surfaces Using Self-assembled Monolayers，，，Angew Chemie Int Ed 44 :2-24 (2005)，其均通过引用的方 式整体并入)是市售的，并且可赋予基板表面多种化学前景(landscape)(胺、环氧化物、链 烯烃等)。多种这样的方案一般描述于美国专利No. 7，2 ，733 (Chan et al.)和美国专利 No. 7, 292, 349 (Miller et al.)，其均通过引用的方式整体并入。美国临时专利申请序列No. 61/101，831 (Mace et al.)，其通过引用的方式整体并 入，教导在含有结合至阵列表面的探针分子的制剂中使用非亲核性添加剂。非亲核性添加 剂的用量为有效地避免或减小由于反应剂在结合反应剂的阵列上的斑上非均勻分布而引 起的表面形态性畸形的严重性。这些表面形态性畸形包括明亮中心斑和“咖啡渍”环(或 孔环)，其可以干扰在特定斑处靶分子结合的精确检测。换言之，使用有效量的非亲核性添 加剂促进反应剂在定位探针的阵列上的各斑上基本上均勻分布。通过均勻分布，旨在使在 斑表面上的反应剂浓度的变化最小化(相对于在不存在非亲核性添加剂的情况下制备的 斑)。另一种方式表示为，优选在阵列斑上的像素变化小于约10%，更优选变化小于5%，最 优选变化小于约3 %，变化小于2 %，或甚至变化小于约1 %。可以使用任何有效量的非亲核性添加剂。典型地，这种有效量为约0. 001至约3% v/v，更优选约0. 01至约ν/ν。非亲核性添加剂的一个实施方案包括具有下式(I)结构的化合物R1——0——[(CH2)mOJn——R2(I)其中，η是O至约250的整数；m是1至3的整数，优选1或2 ；并且R1和R2独立 地选自Cl至C3烷基或R1和R2 —起形成Cl至C3烷基，在该情况下式(I)的化合物具有环 状结构。R1和R2优选为甲基或乙基或一起形成乙基。这些添加剂优选分子量为约5000Da
13或更小，更优选约4000Da或更小，或约3000Da或更小，最优选约2000Da或更小，或甚至约 IOOODa或更小。式(I)的示例性非亲核性添加剂包括但不限于冠醚(18-冠-6，15-冠-5， 12-冠-4等)、双甲氧基乙基)醚、二烷基醚和聚乙二醇。根据另一个实施方案，非亲核性添加剂是二甲基亚砜(DMSO)。使用非亲核性添加剂(不参与反应剂(或探针前体)和官能化芯片基板的化学偶 接)的益处是添加剂促进探针分子在阵列上的它们各离散位置上的更好的分散。因此该改 善的分散使可降低检测系统的灵敏度的表面形态性畸形最小化或完全避免。结果，可以获 得检测靶分子的改善的灵敏度。血细胞凝集素Q22kDa的跨膜同源三聚体)是负责通过唾液酸受体介导宿主细 胞识另 1J的流感抗原(Copeland et al. ,"Assembly of Influenza Hemagglutinin Trimers and Its Role in Intracellular Transport,"J Cell Bioll03 :1179-1191(1986)，其 通过引用的方式整体并入)。目前，已经鉴定有16种主要HA同种型(Fouchier et al., “Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype(H16) Obtained from Black-headed Gulls, " JVirol 79 J814-2822 (2005)，其通过引用的方 式整体并入)，并且分离的病毒血清型和神经氨酸酶都基于它们的决定簇而被分类。当接 触宿主时，细胞尝试内吞病毒。内涵体的更低的PH环境引起HA的显著结构重排(Skehel et al. , "Changes in the confirmation of Influenza Virus Hemagglutinin at the pH Optimum of Virus-mediated Membrane Fusion,，，Proc Natl Acad Soc USA79 968-972 (1982)，其通过引用的方式整体并入)，这导致膜融合，并最终递送病毒有效负 荷(Skehel et al.,"Receptor Binding and Membrane Fusion in Virus Entry :the Influenza Hemagglutinin, ”Annu Rev Biochem 69 :531-569 Q000)，其通过引用的方式整 体并入)。编码HA的病毒RNA基因组的区域非常易于突变(Plotkin et al. ,"Codon Bias and Frequency-dependent Selection on the Hemagglutinin Epitopes of Influenza A Virus, "Proc Natl Acad Sci USA 100 :7152-7157 (2003)，其通过引用的方式整体并 入)，并且是流感病毒能够回避宿主防御的主要原因。这种类型的进化被分类为‘抗原 性漂移’或‘抗原性转变’‘抗原性漂移’是基因中编码抗原蛋白的突变的自然积累，其 中产生抗原的免疫原性的改变(Jin et al. ,"Two Residues in the Hemagglutinin of A/Fujian/411/02-1 ikeInfluenza Viruses are Responsible for Antigenic Drift from A/Panama/2007/99, "Virology 336 :113-119(2005),其通过引用的方式整体并 入)。另一方面，‘抗原性转变’是在两个同时传染宿主细胞的病毒毒株之间产生的显著 基因重组，并因此产生免疫学不同的抗原(Laver et al. ,"Studies on the Origin of Pandemic Influenza III.Evidence Implicating Duck and Equine Influenza Viruses as Possible Progenitors of the Hong Strain of Human Influenza, "Virology 51: 383-391 (1973)，其通过引用的方式整体并入)。通过理解和期望两种进化途径，可以通过 测序抗原决定簇在系统发育上追踪一种流感血清型至另一种的进程(Lindstrom et al., "Genetic Analysis of Human H2N2 and Early H3N2 Influenza Viruses,1957-1972 Evidence for Genetic Divergence and Multiple Reassortment Events, "Virology 328 :101-lliK2004)，其通过引用的方式整体并入)。例如，以这种方式绘制了人大流行H2N2 病毒至大流行 H3N2 病毒的偏离的图(Scholtissek，et al.，“0n the Origin of the Human Influenza Virus Subtypes H2N2 and H3N2, "Virology 87 :13-20 (1978)，其通过 引用的方式整体并入)。本发明的传感器芯片阵列旨在包括任何两种或更多种血细胞凝集素多肽，但优选 任何一种或更多种Hl多肽(例如来自Hmi-H1N9中的那些)、任何一种或更多种H2多肽 (例如来自H2m-H2N9中的那些)、任何一种或更多种H3多肽(例如来自H3m_H3N9中的那 些)、任何一种或更多种H4多肽(例如来自Η·1-Η4Ν9中的那些)、任何一种或更多种Η5多 肽(例如来自H5m-H5N9中的那些)、任何一种或更多种H6多肽(例如来自H6m_H6N9中 的那些)、任何一种或更多种H7多肽(例如来自H7m-H7N9中的那些)、任何一种或更多种 H8多肽(例如来自H8m-H8N9中的那些)、任何一种或更多种H9多肽(例如来自Η·1_Η9Ν9 中的那些)、任何一种或更多种HlO多肽(例如来自Η1(Μ1-Η10Ν9中的那些)、任何一种或 更多种Hll多肽(例如来自Himi-H11N9中的那些)、任何一种或更多种H12多肽(例如 来自H12N1-H12N9中的那些)、任何一种或更多种H13多肽(例如来自H13m_H13N9中的 那些)、任何一种或更多种H14多肽(例如来自Η1·1-Η14Ν9中的那些)、任何一种或更多 种Η15多肽(例如来自H15m-H15N9中的那些)、任何一种或更多种Η16多肽(例如来自 H16N1-H16N9中的那些)、及其所有可能的组合。任何新发现的血细胞凝集素变体也可加入 到本发明的传感器芯片上。除了血细胞凝集素多肽，本发明的传感器芯片阵列还可以包括任意两种或更多 种神经氨酸酶多肽。优选地，传感器芯片阵列包括任意一种或更多种W多肽(例如来自 Hmi-H16m中的那些)、任意一种或更多种N2多肽(例如来自H1N2-H16N2中的那些)、任意 一种或更多种N3多肽(例如来自H1N3-H16N3中的那些)、任意一种或更多种N4多肽(例 如来自H1N4-H16N4中的那些)、任意一种或更多种N5多肽(例如来自H1N5-H16N5中的那 些)、任意一种或更多种N6多肽(例如来自H1N6-H16N6中的那些)、任意一种或更多种N7 多肽(例如来自H1N7-H16N7中的那些)、任意一种或更多种N8多肽(例如来自H1N8-H16N8 中的那些)、任意一种或更多种N9多肽(例如来自H1N9-H16N9中的那些)、及其所有可能 的组合。任何新发现的神经氨酸酶变体也可加入到本发明的传感器芯片阵列上。如本领域技术人员所意识到的，抗原经历翻译后修饰，这种糖基化可包括在阵列 上。例如，在哺乳动物细胞或Baculovirus细胞中血细胞凝集素或神经氨酸酶多肽(待结 合阵列表面)的重组表达应该导致它们的糖基化。如本领域技术人员所意识到的，基于发生检测的位置的表面积，结合芯片上的各 离散位置的血细胞凝集素或神经氨酸酶的量可被优化。通过例子的方式，据信在血细胞凝 集素或神经氨酸酶多肽/位置的浓度为约100fg/mm2至约lOOng/mm2、优选约lpg/mm2至约 10ng/mm2时可以获得最佳结果。本发明中使用的试验HA阵列(下述)具有不同同种型和分离株。然而这不阻止 特异产生的抗血清与表面固定的重组血细胞凝集素的交叉反应性。因此，为了获得在抗原 阵列中的血细胞凝集素之间的细微区别的分子理解，对来自HlNl、H3N2、H5Nl、H6m和H9N2 毒株(得自Genbank-参见下文材料和方法)的血细胞凝集素进行多个氨基酸序列比对。如 图5中所示，发现5种蛋白序列的24. 5%的氨基酸具有完全同一性，和另外42. 4%序列类 似性。这认为是高的序列保守百分比，但这不保证在待被中和抗体识别的蛋白表面上可得共同表位。因此，获得结构信息以补充序列分析。为此，将来自1918流感大流行的Hmi 血细胞凝集素的已知结构(Gamblin et al.，“The Structure and Receptor Binding Properties of the 1918 Influenza Hemagglutinin, "Science303 1838-1842 (2004),^ 通过引用的方式整体并入)用作HA支架以三维表示序列同源性(图6)。HA结构被染色以 可视性表示同一性(黑色)，类似性(暗灰色)和多样性(浅灰色)。比对研究的结果(图 5)示出相当大程度的序列类似性依赖于血细胞凝集素作为可接近的潜在表位的表面。因 此，对于抗血清可预计某些程度的同种型之间交叉反应性，特别是当对象(人或其他)接种 重组病毒外结构域和非天然病毒锚定的血细胞凝集素时。另外，血细胞凝集素的活性位点 的俯视图(图6)揭示出在同种型之间蛋白的高度不类似区域。因此，一种同种型的受体结 合位点的抗体或小分子抑制剂不太可能针对其他血细胞凝集素具有广泛的活性。血细胞凝集素和神经氨酸酶多肽可使用任何合适的偶接多肽的化学法而偶接至 阵列表面。一些不同的结合化学方法描述于上述美国专利No. 7，292，349(Miller et al.), 其通过引用的方式整体并入。优选的方案，特别对于氧化物覆层，包括使用氨基烷基三烷氧 基硅烷，然后使用戊二醛，这赋予能够结合血细胞凝集素或神经氨酸酶多肽的氨基反应性 表面。血细胞凝集素或神经氨酸酶多肽结合各离散位置可以手工或使用自动系统来进 行。对于手工阵列化，在从&母液(修饰的磷酸盐-缓冲盐水(“MPBS”))至含有10%甘 油和0. 01 % Tween-20的溶液以1 1稀释后，多肽溶液可在最终浓度1_100 μ g/mL、优选 10-60 μ g/mL下以 1 μ L的体积进行阵列化。在周围环境中孵育10分钟后，芯片可浸入阻 断缓冲溶液中(在H印es缓冲盐水(“HBS，，)中的lmg/mL胎牛血清白蛋白(“BSA”))45分 钟，然后用含有另外的3mM EDTA和0. 005% Tween-20 ( "MPBS-ET")的MPBS缓冲液冲洗。 对于自动阵列化，在从h母液(MPBS)至含有MPBS中的0. 01-1 % (ν/ν) 12-冠-4醚的溶 液以1 1稀释后，多肽溶液可在最终浓度1-100 μ g/mL、优选40-60 μ g/mL下使用Virtek Chipffriter Pro或可相比装置通过自动印刷来进行阵列化。在微阵列室中在70 °F、70%相 对湿度下孵育60分钟后，芯片可浸入阻断缓冲溶液中(在HBS中的300 μ g/mL BSA) 60分 钟，然后使用MPBS-ET冲洗。一旦制得阵列，传感器芯片可暴露于得自个体的血清样品(或稀释的血清样品)， 然后存在(或不存在)一种或更多种特定流感毒株的抗体可以基于在将传感器芯片暴露于 血清样品后，检测器输出的变化(或缺少变化)的检测来测定。本领域中熟知的是，不存在 可检测的信号并不必然表示抗体不存在而是它们低于检测限，因此不太可能展示出来。图 像捕获可通过任何上述检测系统来获得，但优选通过捕获芯片表面的至少实质性部分的图 像的图像阵列检测器来获得。对于数百到数十万探针的阵列，自动芯片读取器可被编程以 基于捕获的图像来评价阵列上的各斑的反射率的改变。如本文所使用，获得血清样品的个体可以是任何易于被流感传染的动物，包括人 和非人灵长动物、家畜、驯化动物和野生动物(特别是禽类)。筛选家畜是特别期望的，因为 其有用于监控野生动物的流感的传播。血清样品可得自活的个体和死后的尸体。本发明的阵列特别有用于筛选流感疫苗的效力。基本上，阵列优选用于筛选得自 个体(其已经被施用疫苗)的免疫前和后的血清。在足够时间以允许免疫应答后，获得免疫后样品，然后针对本发明的阵列筛选。稀释血清样品，通常从约1 20至约1 2500，可 基于阵列的各离散位置上负载的血细胞凝集素或神经氨酸酶的量来优化。然而，在使样品 暴露于阵列后，可以通过AIR、SPR、BASI、椭圆对称法等使用用于读取传感器芯片表面的系 统的检测系统来评价抗体-血细胞凝集素或抗体-神经氨酸酶反应性的检测。可以评价免 疫反应性的定量测定。如果期望或需要，通过加入第二抗体，例如IgG的特异性抗体，可以进一步增强灵敏度。另外的分析可包括但不限于ELISA、PCR、实时-PCR，质谱法和液相色谱一NMR光谱 法。此外，在使用芯片的过程中检测到存在抗体后，抗体本身可从在使用装置的过程中与之 结合的血细胞凝集素或神经氨酸酶多肽中离解。离解可以通过多种方式的任一种来实现， 包括但不限于在低PH下的甘氨酸溶液、低pH水溶液、高pH水溶液、洗涤剂溶液(低、中或 高浓度)、低浓度变性剂溶液(例如脲)。在离解后抗体(现在没有芯片表面)可以回收， 然后如果需要进行分析。取决于随后下游分析的方案，可以直接或在一个或更多个浓缩目 标抗体的步骤后使用洗脱的样品。一旦传感器芯片清除之前的结合抗体，传感器芯片可重新使用以筛选其他血清样 品是否存在抗-流感抗体。
实施例本发明可通过参照下列例子来进一步阐述。实施例1-3的材料和方法血细胞凝集素对于HA阵列，下列同种型用于手工和自动阵列(分离自人，除非另有说明)A/新 喀里多尼亚 /20/1999 (HlNl)，A/ 怀俄明州 /3/2003 (H3N2)，A/ 香港 /56/1997 (H5N1)，A/ 香 港 /213/2003 (H5N1)，A/ 越南 /1203/2003 (H5N1)，A/ 短颈野鸭 / 香港 /W312/1997 (H6N1)， A/ 香港 /1073/1999 (H9N2)。所有 HA 购自 Protein Sciences, Corp. (Meriden, CT)和 / 或 ^ David Topham(University of Rochester, Rochester, NY)白勺石if@ilil#^。人、禽类和小鼠样品Η5 ^ftWAiilifiiyf/Λ University of Rochester Retrovirology Lab and Vaccine Evaluation Unit 获得。标记 9 个研究对象031、033 (前和后)、036、037、038、 064、067、069和071。血清的潜在病原性状态是未知的(即，关于HIV 1/2的测试的信息等 是未知的)，这样，当在BSL-2实验室中处理样品时要特别注意。针对禽类流感毒株H5N9和 H7N3 Wxlifiiiiyf Cornell University ^Whittaker lab of the College of Veterinary Medicine 惠赠。阴性对照小鼠血浆得自 University of Rochester Medical Center 的 Pearce Laboratory0在IP注射戊巴比妥和心脏右心室穿刺后，收集来自5只4个月大的 雌性129Sv/J鼠(原始来源Taconic，现在室内饲养)的全血样品。将血液在肝素上混合并 离心除去红血球。血细胞凝集素序列比对所有研究的血细胞凝集素的完全氨基酸序列通过NCBI (Genbank)检索和从基因 组核苷酸序列的转化(除了 H1N1，其作为肽序列进行保藏)而定位。各序列的Genbank登录号如下，其通过引用的方式整体并入ABW80979(A/新喀里多尼亚/20/1999，H1N1) (Bragstad et al. , "The Evolution of Human Influenza A Viruses from 1999 to 2006-A Complete Genome Study, "Virol J 5 :40 (2008)，其通过引用的方式整体并入)， AY531033(A/怀俄明州/3/2003，H3N2) (Bragstad et al. ,"New Avian Influenza A Virus Subtype Combination H5N7 Identified in Danish Mallard Ducks,，，Virus Res. 109 181-190(2005)，其通过引用的方式整体并入)，EF541403 (A/越南 /1203/2004, H5N1) (World Health Organization Global Influenza Program Surveillance Network, "Evolution of H5N1 Avian Influenza Viruses in Asia, "Emerg. Infect.Dis.11 1515-1521 (2005)，其通过引用的方式整体并入)，AF250479 (A/短颈野鸭/香港/ W312/1997,H6N1)(Hoffmann et al. ,‘‘Characterization of the Influenza A Virus Gene Pool in Avian Species in Southern China :ffas H6N1 a Derivative or a Precursor of H5N1 ？，” J. Virol. 74 :6309-6315(2000),其通过引用的方式整体并入)和 NC_004908 (A/ /1073/1999, H9N2) (Lin et al. , Avian-to-Human Transmission of H9N2 Subtype Influenza A Viruses-Relationship Between H9N2 and H5N1 Human Isolates,，，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :96M_9658 (2000)，其通过引用的方式整体并入)。一级结构比对 软件 Multalin (ν5· 4. 1) (Corpet, F. , "Multiple Sequence Alignment with Hierarchial Clustering，，，Nucl Acids Res 16 :10881-10890(1988) ；Combet et al. ,"NPSi =Network Protein Sequence Analysis, "Trends Biochem Sci. 25 :147-15(^2000)，其通过引用的方 式整体并入)用于比对约560-570个氨基酸的各HA序列。Multalin参数被设定以使用同 一性符号比较表和同一性评分方法。序列保守性的上限和下限分别设定为100%和50%。 比对输出示于图5。为了图示，经解析的血细胞凝集素结构Hmi的序列(Combet et al. ,"NPSi Network Protein Sequence Analysis, "Trends Biochem Sci. 25 :147-150 (2000),其通过 引用的方式整体并入)(PDB ID =IRUZ)被用作支架，并且使用MacPYMOL提供(DeLano，W. L.， The PyMOL Molecular Graphics System,DeLano Scientific，Palo Alto, CA,USA(2002), 其通过引用的方式整体并入)。为了证实各保守的/类似的氨基酸残基的位置，将其序列加入Multalin比对算法 中；在MacPYMOL中，100%保守的各残基被染色为‘黑色，50% -99%保守的各残基被染色为 ‘暗灰色’，并且< 50%保守的各残基被染色为‘浅灰色’。然后血细胞凝集素同源性结构被 射线追踪以显示‘刺突’(侧面)和‘活性位点’(俯视)取向(参见图6)。手工血细胞凝集素阵列试验制备MR基板以使初始SW2厚度为1381人，并且使用 PITC总胺连接化学法(general amine attachment chemistry)进行官能化。用于手工阵 列试验的HA是Hmi、H3N2、所有三个H5W和H6W。在从h母液(MPBQ至含有10%甘油 和0. 01 % Tween-20的溶液以1 1稀释后，HA在最终浓度20 μ g/mL下以1 μ L的体积进 行手工阵列化。以相同的体积和缓冲液稀释在最终浓度50 μ g/mL下将人IgG(阳性对照) 和荧光素抗体阵列化。探针溶液被允许在周围环境下孵育10分钟，之后将芯片立即浸入 阻断缓冲剂溶液(在HBS中的lmg/mL BSA)45分钟。然后将芯片用MPBS-ET冲洗，并且将 150 μ L 100%人血清样品滴在表面上(将发生一些可变的样品稀释)。在45分钟的孵育时 间后，将芯片用MPBS-ET冲洗并加入MPBS-ET的振荡浴5分钟。然后将芯片用ddH20冲洗，在氮气下干燥，并且在G3反射计上成像。将各斑的反射值和阴性对照芯片(只有MPBS-ET) 上的相应斑进行比较，并相对于α -荧光素阴性对照进行归一化。微阵列化血细胞凝集素试验制备A^基板以使初始SW2厚度为1393人，并且使用戊二醛总胺连接化学法进 行官能化。大和微阵列化HA测定所要求的氧化物厚度之间的差异推测是通过由于反射光 低效地耦合至G4反射计检测器而引起的A^反射最小值的轻微扩宽引起的。所有探针斑 以8个重复印刷。用于手工阵列试验的HA是HlNl、Η3Ν2、Η5Ν1 (越南/1203/2003)、H6W 和Η9Ν2 (只有人抗血清试验)。在从h母液(MPBQ至含有在MPBS中的0. 1 % 12-冠-4 的溶液以1 1稀释后，HA在最终浓度40 μ g/mL (对于H9N2是50 μ g/mL)下使用Virtek Chipffriter Pro自动印刷。人IgG和人IgM抗体(阳性对照)在100 μ g/mL阵列化。人血 清白蛋白(HSA)和α -荧光素(阴性对照)分别在最终浓度200 μ g/mL和10 μ g/mL在相 同缓冲液稀释液中阵列化。使探针溶液在微阵列室中在70下和70%相对湿度下孵育60分 钟。此后，芯片立即浸入阻断缓冲溶液中(在HBS中的300 μ g/mL BSA)60分钟。然后将芯 片用MPBS-ET冲洗，并且将50 μ L人血清样品滴在表面上(将发生一些可变的样品稀释)。 在60分钟的孵育时间后，将芯片用MPBS-ET冲洗并加入MPBS-ET的振荡浴5分钟。然后将 芯片用ddH20冲洗，在氮气下干燥，并且在G4反射计上成像。将各斑的反射值和阴性对照 芯片(只有MPBS-ET)上的相应斑进行比较，并相对于HSA阴性对照进行归一化。对于鸡Η5Ν9和Η7Ν3抗血清试验，所有方法保持相同，不同之处在于排除Η9Ν2 作为探针(缺乏可利用性)，除去HSA作为阴性对照，除去α-IgM作为阳性对照，并且将 α -IgG交换为α -IgY作为阳性对照。此外，重组绿色荧光蛋白(rGFP)在浓度50 μ g/mL下 阵列化为第二对照。在鸡抗血清存在下，rGFP起到另外的阴性对照的作用；在低抗血清稀 释，α -rGFP以浓度5 μ g/mL补充为阳性加标(spike)对照。实施例1-手工制备的血细胞凝集素阵列进行利用高浓度的手工阵列化的血细胞凝集素的初始试验以研究这些蛋白的阵 列能力和合适的初始芯片厚度。在lOOyg/mL A/越南/1203Λ004(H5m)，1360人的氧化 物被测得为理想膜厚度以给予合适的未结合的探针强度。尽管这些斑是可解析的，但是早 期试验的关注在于总胺连接化学法HA是同源三聚体的，并且含有约30个溶剂可及胺/单 体。因此，固定的分子的取向将是完全随机的。低聚状态可确保存在结合特异性抗体的溶 剂可及面，但是导致有效的无活性传感器的取向也是可能的。在这些高HA浓度下尝试观察在加入对于A/越南/1203/2004 (H5N1)血细胞凝集 素(eEnzyme产品号IA-005-01000)特异性的抗体后的信号改变失败，推测是因为阻碍大抗 体的表位识别的表面处的空间拥挤。理想地，由于各HA同种型尺寸相同-序列只有细微差 别-用于阵列的溶液浓度均还应该是相同的。A/新喀里多尼亚/20/1999 (HlNl)同种型在 最低母液浓度66 μ g/mL下供应，因此是该研究的限制探针；所有探针分子被稀释，使得它 们可以补充足够量的由甘油和Tween-20构成的稳定溶液。因此，随后试验对于所有HA使用 20 μ g/mL作为最终浓度来进行。在表面衍生化的过程中该低浓度和洗涤方案的细微改变使 新的最佳芯片初始厚度增加为1381人。试验阵列产生，并且由上述Hmi和H5m试验血细 胞凝集素探针斑、以及分别α-IgG和α-荧光素的阳性和阴性对照斑构成。这些阵列针对 特异性A/新喀里多尼亚/^20/1999 011^)抗体(Fitzgerald产品号M32210)以及H5W抗体而进行筛选。这些试验的有意思的结果是Hmi抗体似乎优选识别H5m同种型，而H5m 抗体仅仅适度识别两种HA。这并不完全是不可预见的，尽管由于抗血清交叉反应性由序列 同源性预测。在用于小规模临床试验的制备中手工产生全HA阵列，其含有6个同种型与阳性和 阴性对照(图7)。抗血清得自6个不同的对象在两个分别就诊时5个接种各种量的A/香 港/156/1997 (H5m)，并且1个对象只给予安慰剂注射剂(参见表1)。所有试验进行盲测。表1 来自接种变化量的抗原的各对象的传统接种效力试验的表格结果
对象量ELISAWesternNeutHAI, 1ΗΑΙ’3No.(Pg)OD印迹滴度滴度滴度05690/901.748阳性4532,5602006890/100.652阴性143201007625/251.677阴性20η/ρη/ρ079安慰剂0.235阴性10η/ρη/ρ08025/251.856阳性80η/ρη/ρ08190/601.160阴性1416020n/p =试验未进行等份未稀释的血清通过使用下列文献中所述类型的检测系统的A^用在全HA阵 列上美国专利申请序列No. 10/282, 274 (Miller et al.)，2002年10月28日提交，现在的 美国专利No. 7，292, 349，公布于2007年11月6日，其通过引用的方式整体并入。代表性暴 露前和暴露后图像示于图8A-B中，而所有芯片的反射率变化的全定量示于图9中。重要的是知道这些研究是进行盲测，事先不知道各对象接种的抗原量，由传统方 式监控的抗血清应答的结果，或安慰剂样品的身份。在它们第二次免疫后7天对于从对象 收集的血清进行传统测定ELISA、针对抗血清的western印迹、病毒中和以及血细胞凝集素 抑制(HAI)。这些结果示于表1中。从临床抗血清数据中立即显示一些特征证实研究具有纯化的抗体。首先，在对 新喀里多尼亚/20/1999和越南/1203/2004血细胞凝集素的应答之间有高度的相关性。其 次，与对象无关，来自香港/156/1997斑的应答有限。第三，特异性抗血清显示出引起比对 其他的更高的对一般HA表位的应答。然而，特别地，在香港/156/1997斑观察到非常少的 应答，因为这是用于接种患者群的重组同种型。然而，尽管该同种型已经证实在T-细胞测 定中的活性，但是不太可能以天然折叠构象存在。另外，产生的反射率变化相对于HA探针 是特异性的，因为α -荧光素对照斑强度改变对于所有测定可忽略(平均值5. 4个单位)。 考虑到试验使用的未稀释的抗血清，这是异常的结果。比较AIR结果和表1中示出的常规分析，观察到高度的类似性。来自对象056和 080的样品显示出高的MR反射率(图9和10) ,ELISA 0D、良好的中和滴度和阳性western 印迹。对象056示出高的新喀里多尼亚/20/1999交叉反应性(图9)。对象068具有高的 HA交叉反应性，如MR和HAI滴度(图9)所看到的。盲性研究的重要方面是确定是否安慰 剂对象可以由MR解析。基于AIR结果，安慰剂样品的三个候选物是对象068、076和079。 对象068由于低的应答而被鉴定，除了新喀里多尼亚/20/1999和越南/1203/2004HA。对象 076被鉴定因为该样品产生最低的两种总反应性中的一种。对象079也被鉴定，因为在所有H5血细胞凝集素斑上的低活性。实际上，安慰剂样品的身份稍后被传播为来自对象079。对象068的低反应性可由较小的第二次接种剂量来解释，所述剂量可导致第二免 疫应答降低，因此产生更少量的抗体。来自对象076的结果更难于解释。可能的是ELISA OD 是误导的，该对象对于接种具有非常弱的免疫应答，或者当香港/156/1997血细胞凝集素 表面固定时，对于该对象免疫原性HA表位不可获得。然而，一种不类似的情况是对象081。 通过传统方法，对象081表现出是成功接种的较差候选物，因为它们的抗血清中和滴度很 低并且western印迹是阴性，但是通过MR对象081在阵列上积累了一些最高的应答。然 而，具有以下可能通过将这些HA束缚到某些表位优选暴露或遮掩的基板表面。因此，对于 基于溶液或基于基质的测定，观察的反射率值将失真。重要地，这些结果一使用无标记、“无试剂”技术在不到30分钟获得一和通过比较 ELISA测定衍生的那些结果是完全一致的。实施例2-禽群(Avian Flock)中的病毒监测禽类与人接触是H5m流感病毒传播的主要途径(Sandrock et al. , "Clinical Review :Update of Avian Influenza A Infections in Humans,，，Crit Care 11: 209 (2007)，其通过引用的方式整体并入)。因此，监控全球家禽群的能力对于保护人的健康 是关键的。另外，监测也是农学和人类学的关注点截止2006年底，超过240百万家禽已经 被预防性杀死以制止禽流感病毒的传播(World Organization for Animal Health,Avian influenza =Fact Sheet, accessed April 16，2008，其通过引用的方式整体并入)。鸡H5N9 和 H7N3 抗血清的样品得自 Cornell University 的 the College of Veterinary Medicine的Whittaker lab。H5N9抗血清将起到替换禽类H5m的作用，而H7N3 病毒也显示了传染人的可能性(Tweed et al. ,"Human Illness from Avian Influenza H7N3, British Columbia, "Emerg. Infect. Dis. 10 :2196-2199 Q004)，其通过引用的方式整 体并入)。另外，禽类抗血清试验将起到优异的模型系统的作用以同时利用MR方法的改进 进行研究。这些试验使用上述自动印刷阵列来进行。对于禽类抗血清试验，产生含有新喀里多尼亚/20/1999 (HlNl)、怀俄明州 /3/2003 (H3N2)、越南/1203/2004 (H5N1)和短颈野鸭 / 香港/W312/1997 (H6m)的阵列。对 于这些阵列，加入α-IgY阳性对照和α-荧光素以及重组绿色萤光蛋白(rGFP)阴性对照。 rGFP斑将同时起到稀释溶液的阳性加标对照的作用。不幸地，H5N9抗血清以有限的体积供 应，只可以获得最初滴度，示于图11中。对于H3、H5和H6在更高浓度的抗血清处观察到相 当大的反射率增加。H3表现出较低的特异性，因为其不像引入的稀释那样良好地进行滴定， 而H5和H6良好地对应于浓度改变而改变。Hl血细胞凝集素示出对于所有筛选的浓度可忽 略的反射率变化。IgY抗体表现出比期望的、给定的大血清免疫球蛋白浓度更低的活性；例 如，当阵列补充另外的α-人IgG列时，人免疫球蛋白-特异性抗体展示出比对于鸡免疫球 蛋白的抗体更高的灵敏度(在Η7Ν3抗血清试验的上下文中)。重组GFP示出针对鸡抗血清 的小的、但是‘活性’非特异性吸附，因为通过将α-GFP加入稀释抗血清溶液中，其容易被 识别。50% Η5Ν9抗血清稀释也在一套芯片上进行，但是对于表面的非特异性结合排除结合 的可重复的定量。尽管Η5Ν9抗血清迅速耗尽，但是至少其提供滴定窗，在其中有效地研究Η7Ν3抗血 清活性。对于这些试验，稀释窗集中为从10%至0.37% (三个1呢3稀释)。处理更稀的抗血清浓度允许保存和进行大量的重复试验。图12示出在暴露于10% H7N3抗血清后在 64八顶反射计上成像的血细胞凝集素微阵列图像。斑形态是各探针类型典型的。图像的右 下角的较大亮点是由反射计成像系统上的颗粒引起的散射。这种反射异常在图像处理过程 中容易规避。H7N3抗血清滴定的结果非常不同于H5N9抗血清，如观察到的较大H3交叉反 应性(图13)。不幸地，重组H7N3血细胞凝集素不是市售的，因此不能在该阵列中实施。对 于所有阵列化血细胞凝集素都观察到中度反射率增加，并且在减小的抗血清浓度下所有HA 信号都滴定良好。MR的灵敏度由暴露于10%抗血清对3. 33%抗血清的基板的统计上不同 的反射率变化来明确证实。在平均观察到的信号改变中的标准偏差对于更稀的溶液较大， 但是这可以由系统误差负责，所述系统误差源自由加入靶溶液至湿芯片而引起的另外的样 品稀释。如预计的，在H5N9和H7N3禽类抗血清之间观察到明显的差异。单独高抗血清稀 释(如下述人抗血清所进行的)的比较建立在阵列化HA之间产生交叉反应性的趋势H5N9 抗血清特异于H5，并且在更少程度上特异于H6，尽管对于Hl或H3血细胞凝集素不展示出 反应性；另一方面，H7N3抗血清显示出在整个血细胞凝集素组的反应性，其中对于Hl和H3 具有轻微特异性。这些结果用于准备用于在将来进行的更深入的禽类监测研究，包括更大 的HA阵列和更多样的家禽群。实施例3-较大血细胞凝集素阵列利用下列五种血细胞凝集素同种型使用自动微阵列印刷器来制备阵列H1 =A/ 新喀里多尼亚 /20/1999 (HlNl) ；H3 = A/ 怀俄明州 /3/2003 (H3N2) ；H5 = A/ 越 南 /1203/^2004 015^) ；H6 = A/ 短颈野鸭 / 香港 /W312/1997 (H6N1)；和 H9 = A/ 香港 /1073/1999 (H9N2)。一些对照也包括在阵列上，包括人血清白蛋白(HSA)作为“归一化”阴 性对照，和抗-荧光素作为第二阴性对照元件。针对人IgG和人IgM的抗体起到阳性对照 的作用。尽管最初人抗血清结果在提供下列方面中是成功的义顶数据可以提高传统接种 测定的结果，但是存在两个不能由常规手工阵列化技术克服的主要限制扩大阵列以包括 增加的探针多余物和通过自动控制印刷阵列的体积和形态来除去“人的可变因素”。如前面 章节禽类抗血清试验所证实的，使用自动微阵列仪以控制和可重复的方式来解决两种技术 不足。另外，A/香港/1073/1999 (H9N2)血细胞凝集素补充到全阵列，同时还有两种或更多 种对照探针针对人IgM的抗体将起到第二阳性对照的作用(Lacroix-Desmazes et al., "Analysis of Antibody Reactivities Toward Self Antigens of IgM of Patients with Waldenstrom' s Macroglobulinemia," Int Immunol 9 :1175—1183(1997)，gilil弓IM的 方式整体并入)，和人血清白蛋白通过溶液-相位竞争效应，将是有效的另外阴性对照(图 14)。图17B示出在暴露于对象071的5%抗血清后在射计上成像的血细胞凝集素 微阵列的代表性图像。由对来自随机选择的对象(来自临床群)的血清进行的测定，人抗血清试验的有 效地试验滴定范围被测定为在5% (1 20稀释)至0.04% (1 2500稀释)之间。5% 抗血清被稀释至足以否定来自非特异性结合的信号，而保持大的非饱和反射率增加，并且 事实上0.04% (1 2，500稀释)被稀释至足以对于大多数样品滴定出至零的反射率变化。 对于所有滴定的样品该稀释系列以10 步骤进行。然而，大部分抗血清只在5%稀释下研究以定量在交叉反应性中的趋势和鉴定潜在的安慰剂对象。基于在上5 %滴度的低H5反射 率变化，来自06FR0037和06FR0069的样品可能是安慰剂接受者(图14)。此外，抗血清试 验的缓冲液对照阵列(N = 6)被分析以定量阵列-至-阵列的再现性。对于α -IgG斑观 察到在对照芯片之间最大的反射率变化(3.05+/-8. 1)，而大部分可重复的斑是α-荧光素 (2. 66+/-1. 8)。然后测定的“噪音”约3个单位，因此在该范围内的反射率变化被认为是可 忽略的。一个对象也具有接种前血清，其被等分以定量先天耐性和测得Η5接种的实际保 护效果。衍生自对象06FR0033的反射率变化指示针对Η3血细胞凝集素的中等应答，可能 由于衍生自现有流感感染的记忆免疫性和针对Hl和Η9血细胞凝集素的细微交叉反应性 (图15)。然而，在接种前抗血清等份中只观察到Η5和Η6血细胞凝集素的基础识别，由于 这些相互反应在试验的浓度范围内不是可滴定的，因此推测它们对于那些同种型不是特异 性的。然而，在接种Η5后，对象06FR0033获得针对阵列中的Η5和所有HA的相当大特异 性保护效果(图16)。此外，由于这些相互作用在筛选浓度-4个1呢5系列稀释(5%、1%、 0. 2%和0. 04% )内滴定良好，因此它们确实是特异性免疫应答的结果。此外，如所预期的，在稀释过程中在信号中有剂量-依赖性改变。A^的灵敏度由 暴露于小至0. 2%抗血清的基板的统计上不同的反射率变化来明确证实。安慰剂样品鉴定为衍生自对象064，其在图14中展示的反射率数据中明确观察 到。然后进行全抗血清滴定以监控针对HA的信号耗尽的速度。类似于使用对象033的接 种前样品所观察到的，在非接种群中存在非常微小地基础识别H5和H6 ；然而，在正常人血 清中存在针对H1、H3和H9血细胞凝集素的抗体。这示于图18。对于所有通过MR筛选的 对象，通过 National Institutes of Health, John Treanor (University of Rochester, Rochester,NY)提供H5血细胞凝集素抑制数据(表2)。除了对象036和067，在用于接种 对象的H5的量和它们产生抑制性抗血清能力(通过H5HAI滴度观察)之间表现出较小的 相关性。感兴趣的是，和在接种过程中检测到的情况相比，在研究得出结论后6个月对象 031和036具有更高的HAI滴度(表2中的接种后就诊1和2)。然而，AIR结果很少有差 别。在剂量、HAI滴度(接种后就诊2)和MR反射率改变之间有明确的差异，典型为源自 衍生自对象036、067和071的样品。尽管期望由于针对血细胞凝集素-特异性表位产生的 所有抗体具有引起反射率增加的潜力，但是并不是抑制活性的那些。然而，不可能断定通过 A^监控的HA阵列明确能够识别接种前和后的抗血清以及衍生自安慰剂和试验对象的样 品。此外，关于与HAI滴度和接种剂量的一致，这些结果和从类似进行的ELISA和western 印迹试验中预期的那些一致，而大量增加可从单独对象衍生的样品获得的数据的量。表2 在各个临床研究阶段进行的H5血细胞凝集素抑制滴度的比较
权利要求
1.一种用于检测针对流感病毒的免疫应答的传感器芯片，所述传感器芯片包括具有表 面的基板和与所述基板的所述表面上的离散位置结合的多个血细胞凝集素多肽，各血细胞 凝集素多肽包含血细胞凝集素表位。
2.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中所述血细胞凝集素多肽是全长血细胞凝集 素蛋白。
3.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中所述血细胞凝集素多肽是全长血细胞凝集 素蛋白的片段。
4.根据权利要求3所述的传感器芯片，其中所述血细胞凝集素多肽片段包含免疫显性 血细胞凝集素表位。
5.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中所述传感器芯片适用于阵列成像反射测量 术(“AIR”)检测系统、表面等离子体共振(“SPR”)检测系统、Brewster角离散干涉测量 术(“BASI”)检测系统或椭圆对称法。
6.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中所述血细胞凝集素多肽通过戊二醛接头结 合所述基板。
7.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中各离散位置包含的血细胞凝集素多肽的浓 度为约 IOOfg/mm2 至约 100ng/mm2。
8.根据权利要求1所述的传感器芯片，还包含与所述基板的所述表面上的离散位置结 合的多个神经氨酸酶多肽，各神经氨酸酶多肽包含神经氨酸酶表位。
9.根据权利要求8所述的传感器芯片，其中所述神经氨酸酶多肽是全长神经氨酸酶蛋白。
10.根据权利要求8所述的传感器芯片，其中所述神经氨酸酶多肽是全长神经氨酸酶 蛋白的片段。
11.根据权利要求10所述的传感器芯片，其中所述神经氨酸酶多肽片段包含免疫显性 神经氨酸酶表位。
12.—种检测系统，包含根据权利要求1所述的传感器芯片；被定位以照射所述芯片的光源；以及检测器，所述检测器被定位以检测从所述芯片表面反射的光线，从而测定抗体是否结 合所述血细胞凝集素多肽。
13.一种检测系统，包含根据权利要求8所述的传感器芯片；被定位以照射所述芯片的光源；以及检测器，所述检测器被定位以检测从所述芯片表面反射的光线，从而测定抗体是否结 合所述血细胞凝集素多肽或神经氨酸酶多肽。
14.一种流通池，包括具有入口和出口的基底；透光盖，所述透光盖以基本上流体密封的方式设置在所述基底上，并且和所述基底形 成隔室，通过所述隔室流体可以从所述入口流到所述出口 ；和根据权利要求1所述的传感器芯片；所述传感器芯片位于所述隔室中，并且通过所述透光盖暴露于入射光，从而用于以合适的入射角照射所述芯片表面的入射光在不存在结合 血细胞凝集素多肽的抗体的情况下实现几乎完全相消干扰的条件。
15.一种检测系统，包含 根据权利要求14所述的流通池；和所述流通池的所述入口流体连通的流体样品源； 被定位以照射所述芯片的光源；以及检测器，所述检测器被定位以检测从所述芯片表面反射的光线，其中所述照射光的所 述入射角适于产生下列条件在不存在结合血细胞凝集素多肽的抗体的情况下几乎完全相 消干扰和在存在结合血细胞凝集素多肽的抗体的情况下光反射率的实质性改变。
16.根据权利要求15所述的检测系统，其中(i)所述光源发射偏振光或(ii)所述系统 还包含至少一个偏振器，所述偏振器位于所述光源和所述芯片之间并位于从所述光源发射 的光程中。
17.根据权利要求16所述的检测系统，其中所述光源使所述光线以非法线入射角导向覆层。
18.根据权利要求15所述的检测系统，其中(i)所述光源发射偏振光或(ii)所述系统 还包含至少一个偏振器，所述偏振器位于所述光源和所述芯片之间并位于从所述光源发射 的光程中。
19.根据权利要求18所述的检测系统，其中所述光源使所述光线以非法线入射角导向覆层。
20.根据权利要求15所述的检测系统，其中所述检测器是捕获所述芯片表面的至少实 质性部分的图像的成像阵列。
21.根据权利要求15所述的检测系统，其中所述检测器是捕获所述芯片表面的至少实 质性部分的图像的成像阵列。
22.—种传感抗-流感抗体的方法，该方法包括 提供根据权利要求12或权利要求13所述的检测系统； 在所述传感器芯片表面处导向光线；在有效地允许样品中的抗_流感抗体特异性结合被所述抗体识别的血细胞凝集素多 肽的条件下使所述传感器芯片和样品接触；以及在有效地鉴定结合所述样品的抗体的血细胞凝集素多肽的条件下检测从所述芯片反 射的光线。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述检测通过AIR检测系统、Sra检测系统、 BASI检测系统或椭圆对称法来进行。
24.一种传感抗-流感抗体的方法，该方法包括 提供根据权利要求15所述的检测系统；以有效地导致几乎完全相消干扰的条件的方式在所述传感器芯片处导向光线； 将流体样品加入所述流通池； 测量从所述芯片反射的光线；以及基于所述测量的反射光，提供鉴定结合所述流体样品的抗体的血细胞凝集素多肽的输出ο
25.根据权利要求M所述的方法，其中所述测量反射光还包括捕获所述芯片表面的至 少实质性部分的图像。
26.根据权利要求M所述的方法，其中所述流体是水溶液。
27.—种筛选流感疫苗的效力的方法，包括 将流感疫苗施用至一个或更多个个体；从所述一个或更多个个体获得血清样品；以及进行权利要求22所述的方法，以测量由所述流感疫苗产生的抗-流感免疫应答。
28.—种筛选流感疫苗的效力的方法，包括 将流感疫苗施用至一个或更多个个体；从所述一个或更多个个体获得血清样品；以及进行权利要求M所述的方法，以测量由所述流感疫苗产生的抗-流感免疫应答。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品得自选自人和非人灵长动物、家畜、驯 化动物以及野生动物的个体。
30.根据权利要求M所述的方法，其中所述样品得自选自人和非人灵长动物、家畜、驯 化动物以及野生动物的个体。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述样品得自选自人和非人灵长动物、家畜、驯 化动物以及野生动物的个体。
32.根据权利要求观所述的方法，其中所述样品得自选自人和非人灵长动物、家畜、驯 化动物以及野生动物的个体。
全文摘要
一种用于检测针对流感病毒的免疫应答的传感器芯片，所述传感器芯片包括具有表面的基板和与所述基板的表面上的离散位置结合的多个血细胞凝集素多肽，各血细胞凝集素多肽具有血细胞凝集素表位。本文还描述含有所述传感器芯片的检测装置和检测流感免疫应答的方法。
文档编号G01N35/02GK102084252SQ200980125645
公开日2011年6月1日 申请日期2009年5月1日 优先权日2008年5月2日
发明者B·L·米勒, C·R·梅斯, D·托普汉, T·R·莫斯曼 申请人:罗切斯特大学