专利名称：检测膜蛋白内化的方法
技术领域：
本发明涉及检测膜蛋白被活细胞内化的方法，尤其可用于证明能够引发该内化作用的化合物。具体而言，本发明记载了以测定荧光金属复合物发生内化时的发光变化为基础，对与所述荧光金属复合物偶联的跨膜蛋白的内化进行检测的方法。
背景技术：
内化 在膜受体的配体将细胞活化期间，所述膜受体受到级联机制，该级联机制通常引起被细胞内化。首先，该过程可以抑制或减少由于摄取配体(通常是激动剂)而对细胞造成的刺激；其次，该过程引起受体的脱敏作用，因此引起常规的信号转导级联的中断。所述转导单元的脱敏作用是一个复杂的机制，该机制已有相对详尽的记载(参见例如 Gainetdinov φ, Annu Review Neurosci 2004 v27 pl07_44)。
所述内化机制是调节G-蛋白偶联受体(GPCR)及受体酪氨酸激酶的主要过程之
ο 粗略地讲，激动剂引起的GPCR活化造成该受体的胞内部分被磷酸化，从而诱导一定数量的胞内蛋白、特别是视紫红质抑制蛋白(arrestin)的募集(recruitment)，所述视紫红质抑制蛋白引起网格蛋白包被的胞吞囊泡的形成。随后，通过胞内运输机制处理这些囊泡，引起所述囊泡与溶酶体融合而发生降解，或引起所述囊泡与细胞质膜(plasma membrane)融合而恢复原状(reconversion)。
对开发具有治疗活性的新分子而言，GPCR是首选的靶分子，存在若干种技术用于测定GPCR被候选化合物(激动剂、拮抗剂或反向激动剂)活化的水平变化。事实上，其中一些技术的目的在于通过研究与GPCR内化相关的事件，来检测GPCR的活化。
视紫红质抑制蛋白是在GPCR内化过程中发挥主要作用的胞内蛋白，如下文所示， 视紫红质抑制蛋白被用于若干种检测内化的方法中。
申请WO 01/67106记载了旨在通过对视紫红质抑制蛋白的组成性活性突变体与 GPCR间的结合的调节作用进行测定，来鉴定GPCR配体的方法，所述组成性活性突变体的活性取决于GPCR的磷酸化水平，所述配体用放射性原子、酶、报告蛋白或荧光化合物进行标记。
申请WO 01/59451记载了采用“ ICAST”技术(顺反子间互补分析筛选技术)检测 GPCR活化的方法，所述“ICAST”技术基于突变酶两个亚基间的互补作用；例如，所述酶的各个片段一方面与GPCR以融合蛋白的形式表达，另一方面与视紫红质抑制蛋白以融合蛋白的形式表达。如果发生了 GPCR-视紫红质抑制蛋白相互作用，所述酶会通过互补作用重建， 并能产生可检测的信号。因此，这又成了通过检测GPCR与视紫红质抑制蛋白的结合来分析 GPCR活化的问题。如申请WO 01/58923中所记载的，可通过采用GPCR突变体或视紫红质抑制蛋白突变体来改进该技术。
申请WO 2005/007822记载了确定化合物是否对两个目标蛋白间的相互作用进行调节的方法。所述方法同样基于对GPCR-视紫红质抑制蛋白结合的检测。该方法的基础是使用下述GPCR 通过对特定蛋白酶敏感的肽序列，与转录因子在GPCR的C端部分融合的 GPCR。所述视紫红质抑制蛋白以其一部分与该蛋白酶融合。在GPCR被激动剂配体活化期间，视紫红质抑制蛋白会与GPCR相互作用，所述相互作用将会具有使所述蛋白酶靠近切割序列并引起转录因子释放的作用，而转录因子的释放随后将能够激活报告基因的转录，从而可检测到GPCR的活性。
对于采用视紫红质抑制蛋白-GPCR的结合作为GPCR活化的标记而言，其所关系到的问题之一在于该结合的性质不稳定，所述结合仅是引起胞吞囊泡形成的级联事件中的中间步骤。申请WO 04/065963通过采用视紫红质抑制蛋白突变体解决了这个问题，所述视紫红质抑制蛋白突变体与野生型视紫红质抑制蛋白不同，无法与该级联中的蛋白伴侣 (protein partners)结合，因而可相对稳定地保持与受体结合。
Charest 等(EMBO Rep. 2005Apr ；6 (4) =334-40)开发了用于检测视紫红质抑制蛋白三维结构变化的技术，该三维结构变化发生在视紫红质抑制蛋白与活化的GPCR相互作用期间；作者构建了荧光素酶-视紫红质抑制蛋白-YFP(黄色荧光蛋白)的融合蛋白，并证明了在GPCR活化期间，分子内BRET (生物发光共振能量转移)信号的增大(被称为“双亮度视紫红质抑制蛋白”(double-brilliance arrestin)的技术)。
Molecular Devices公司出售"iTransf Iuor. ”技术，该技术具体记载于专利EP 1 015 608中，所述技术以使用视紫红质抑制蛋白-GFP融合蛋白为基础利用适当的图像采集设备，使用表达该融合蛋白的细胞可以将视紫红质抑制蛋白-GFP的转位 (translocation)及其在细胞内的重新分布(对目标GPCR活化的响应)可视化。
下文具体记载了证明膜受体内化的其它方法，这些方法并不基于对GPCR-视紫红质抑制蛋白的结合或视紫红质抑制蛋白的胞内转位进行的检测。
申请WO 00/03246记载了对能够诱导GPCR内化的化合物进行鉴定的方法，所述方法的基础在于采用GPCR-发光蛋白融合蛋白或通过向介质中加入能与这些受体结合的已标记分子，将所述受体进行发光标记。所述方法包括对必须分析的细胞采集图像的步骤，以鉴定受体已发生内化的细胞。
Amersham Biosciences公司出售商品名为CypHer5: 的花青苷(cyanin)衍生物； 这些具体记载于申请WO 00/75237中的有机荧光团具有下述性质中性pH下荧光极弱，而酸性PH下荧光极强。例如，这些花青苷衍生物可与能结合至GPCR的抗体缀合在结合至 GPCR的抗体-Cypher5发生内化期间，Cypher5会从中性pH的介质(胞外介质)进入酸性 PH的介质(核内体)，其发光将会增强。
镧系元素复合物以及动态FRET引起的荧光猝灭 镧系元素复合物(下文中也称作“稀土金属复合物”)作为荧光化合物来研究生物学现象的用途开发于20世纪90年代(例如参见Mathis等的文章，Clin. Chem. 1995Sep ； 41(9) :1391-7)。
FRET现象在生物学中已有广泛应用，特别是用于研究生物学相互作用。它的基础在于荧光供体化合物(例如镧系元素复合物)及任选的荧光受体化合物的使用，其中每个化合物都与生物分子偶联。当所研究的生物学相互作用引起所述生物分子彼此更为靠近， 并且供体化合物被激发时，供体和受体间发生能量转移，导致反应介质发出的光发生变化。有若干个公司出售用于实施该方法以研究生物学过程的试剂；例如，本申请人提供用于研究特定生物学现象(检测酶活性、分析第二信使等)的供体化合物和受体化合物以及试剂品.ο 对于在介质中自由扩散的处于溶液中的供体化合物及受体化合物，二者间动态能量转移的现象具体记载于D.Thomas等，(1978)，PNAS，75 12，5746-5750中。该现象通常表示为其首字母缩略词DEFET，意思为“扩散增强的荧光能量转移”。传统上用于研究生物学现象的能量转移以生物学相互作用(所述相互作用会使供体化合物及受体化合物彼此更为靠近)的发生为基础，与之不同的是，通过动态转移的FRET(或DEFET)基于一个或两个 FRET伴侣在反应介质中的自由扩散。
D.Thomas等(1978)，PNAS，75 12，5746-5750记载了均处于溶液中的铽复合物 (Tb (DPA) 3)及罗丹明之间的DEFET，并利用DEFET测定了存在于膜泡的水介质中的Tb (DPA) 3 与膜内含有的曙红-磷脂酰胆碱的曙红生色团之间最近路径的距离。这些研究是在“快速扩散限制”的条件下，特别是使用具有长寿命(2. 2毫秒)的供体荧光团进行的。在这些条件中，能量转移的效率本质上只取决于供体和受体之间最近路径的距离，这使得尤其可以在低的受体浓度下观察到信号。
专利申请GB 2 223 096记载了用于检测分子(例如抗体或抗原)的方法，所述方法正是基于动态FRET的概念，已知该动态FRET取决于FRET伴侣的扩散常数。事实上，所记载的方法在于测定供体化合物和受体化合物间动态FRET的变化，该变化是在供体或受体与待检测分子发生相互作用后，供体或受体在介质中的扩散作用改变而产生的。所述方法需要供体化合物或受体化合物之一同能够与待检测分子相互作用的实体发生缀合(例如， 供体或受体同蛋白或抗体发生缀合)。
Zheng 等(J. Am. Chem. Soc. 2005，127，16178-16188)开发了一类能与镧系元素复合并能非特异性地插入脂质膜的亲脂性大环分子(DTPA-PDA-Cn, η = 10，12)，所述大环分子用于细胞标记的应用以及用于核磁共振(在钆复合物的情况下)的应用。该作者采用 DEFET技术，通过测定由铽复合物及钙黄绿素之间的能量转移产生的信号，确定了这些复合物的细胞定位。当钙黄绿素被加入到胞外介质中时(钙黄绿素无法穿过细胞膜)，作者能够检测到他们所研究的复合物与钙黄绿素之间的DEFET，而无法检测到与胞内的钙黄绿素 (以中性的钙黄绿素酯的形式引入细胞)之间的DEFET，由此可以推出，他们所研究的脂质的镧系元素复合物插入了细胞质膜的外表面上。该小组并未研究他们所研究的镧系元素复合物的内化事件中可能的信号变化。
一些小组还利用DEFET来研究与并入有能量-受体基序的蛋白结构及该蛋白结构与能量-供体化合物的相互作用，以确定蛋白表面的静电位。
镧系元素复合物以及氧化还原作用弓I起的荧光猝灭 文献中已经记载了某些还原剂对镧系元素复合物发光的影响 例如，Kielar等人研究了由多种还原剂引起的、铕复合物及铽复合物的激发态的动态猝灭(Org. Biomol. Chem.，2007，5，29751982)，该研究表明，对于所研究的稀土金属复合物，氧化电位略低于IV的化合物可通过还原作用具有荧光猝灭作用；例如，碘离子 (+0. 54V)、尿酸根(+0. 59V)、抗坏血酸根(+0. 30V)及某些儿茶酚离子(pH 7时为+0. 54V) 就是这种情况。此外，这些作者还证明了这些化合物对铽复合物的荧光猝灭作用比对铕复合物(具有相同的螯合结构)所观察到的荧光猝灭作用要强。
申请WO 2008/007089涉及通过铽复合物或铕复合物，对具有还原能力的分析物进行分析的方法。
确实需要一种灵敏、易于实施并且适于高通量应用的方法，用于检测目标膜蛋白的内化。对于容易地证明能引发膜蛋白内化的化合物而言，特别是旨在检测新型药物的途径方面，上述方法尤其有利。此外，鉴于仅有10-40%可内化的受体事实上发生内化，因而所讨论的方法应当足够灵敏，以使得可以观察到内化发生时的信号变化。
定义 “与荧光金属复合物相配(compatible)的FRET受体化合物”该表述表示与所述荧光金属复合物形成FRET伴侣对的FRET受体化合物。
"FRET伴侣对”该表述表示由供体荧光化合物及受体化合物组成的对；当它们彼此接近并且在供体荧光化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发出FRET信号。已知的是，为了让两个荧光化合物成为FRET伴侣，供体荧光化合物的发射光谱必须与受体化合物的激发光谱部分重叠。优选的FRET-伴侣对是RO值(F6rster距离，即能量转移效率为50% 时的距离)大于或等于30 A的伴侣对。
"FRET信号”表示任何可测量的、代表供体荧光化合物及受体化合物之间FRET的信号。因此，FRET信号可以是供体荧光化合物或受体化合物(当受体化合物发荧光时)的发光强度或发光寿命的变化。
“反应介质”表示活细胞可在其中与试剂接触的任何容器，例如培养板的孔、试管寸。
“EDTA” 乙二胺四乙酸； “DTPA，，二乙三胺五乙酸； “17拟”三乙四胺-队队&，N"，N" ‘，N"‘-六乙酸； “D0TA，，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N〃，N〃 ‘-四乙酸; “NTA，，氮川三乙酸； “HDTA，，六亚甲基二胺四乙酸； “DTPP，，二乙三胺五膦酸； “EDTP，，乙二氮川四(甲基膦酸)； “NTP，，氮川三(亚甲基膦酸)； “D0TP，，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N'，N"，N"，N〃‘-四(亚甲基膦酸)； “D03A，，1，4，7，10-四氮杂环十二烷三乙酸； “DOTAGA，，:1-(1-羧基 _3_ 羧基丙基)_4，7，10_(羧基甲基)_1，4，7，10-四氮杂环十二烷； “DY647”由Dyomics公司出售的具有五甲川结构的荧光团； “D2” =Cisbio Bioassay公司出售的有机荧光受体化合物； “PBS” 磷酸盐缓冲溶液； “Lumi4-Tb” =Lumiphore 公司及 Cisbio Bioassay 公司出售的铖复合物； “DMEM” 〃 Dulbecco改良式fegle培养基〃，可商购并用于多种应用的细胞培养基； “NHS”:N-羟基琥珀酰亚胺。
发明内容
本发明的主题是对蛋白内化进行检测的方法，所述方法包括以下步骤 a)用含有镧系元素或钌的荧光金属复合物标记目标蛋白，所述荧光金属复合物的寿命大于0. 1ms，优选为0. 5-6ms ； b)向反应介质中加入能够引起所述目标蛋白内化的化合物； c)向反应介质中加入调节剂，所述调节剂选自 1.与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物；所述FRET受体化合物在反应介质中的终浓度大于1(ΤΜ，优选为KTfiM至10_3Μ;所述 FRET受体化合物的分子量小于50kD，优选为0. I-IOkD ； 2.还原剂，其氧化还原电位小于+0. IV，优选为0. 25-0. 75V ； 3.与荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂； 4.金属离子，所述金属离子与所述镧系元素或所述钌竞争以形成非荧光金属复合物； d)在荧光金属复合物的发射波长和/或所述调节剂的发射波长下，测定所述反应介质所发出的光； e)将步骤d)中测定的信号与在仅经历步骤a)和C)的细胞上测定的参比信号进行比较，步骤d)中测定的信号与所述参比信号的差别表示所述目标蛋白的内化。
这些必要的步骤可按照(a、b、C、d、e)的顺序实施。在该情况下，所述调节化合物在目标蛋白内化期间并不存在于胞外介质中，所以优选采用该实施方式，从而降低所述调节化合物存在于核内体(endosomes)中的风险。
当所述调节剂是FRET受体化合物(即本发明的优选实施方式的情况)或还原剂时，也可以按照a)、c)、b)、d)、e)的顺序完成这些步骤。
此外，可在步骤a)以及下一个步骤之间加入清洗步骤。术语“清洗步骤”意在表示更换一次或多次(优选为2次或3次)培养基的步骤。所述清洗步骤用于将未与目标蛋白偶联的荧光金属复合物从胞外介质中清除；然而，由于本发明的基础是观察由于内化作用引起的信号差别，该步骤是任选的。但是，为了改进本方法的灵敏度，优选进行该清洗步骤。
本发明所述方法的基础是检测含有活细胞和适当试剂的反应介质所发出的信号， 信号强度由于目标膜蛋白被细胞内化而发生变化。
具体而言，在本发明所述的方法中，目标膜蛋白以暴露于胞外介质的域的水平，直接或间接地与能发出发光信号的荧光金属复合物结合。所述胞外介质所含有的化合物(称为“调节化合物”)在反应介质中的存在具有改变由荧光金属复合物所发出信号的作用。
目标膜蛋白的内化改变了所述荧光金属复合物对于调节化合物的可及性 (accessibility)经过一段时间后，所述荧光金属复合物不再暴露于胞外介质，而是暴露于胞吞囊泡内的介质，或是暴露于胞液。本发明人等已经发现，尽管仅有10-40%能够内化的跨膜受体事实上发生了内化，所述荧光金属复合物对于调节化合物的可及性变化造成反应介质所发出的发光信号的变化，这一变化可进行检测或甚至任选可进行定量。
反应介质发出的发光信号对应于荧光金属复合物发出的光；或者，当所述调节剂是FRET受体化合物时，反应介质发出的发光信号对应于该调节剂发出的光。
在这两种情况下，均为荧光金属复合物对于调节化合物的可及性的变化造成反应介质中测定的发光的差异。
现在，将会更详细地对本发明所述的方法及其实施变型中使用的试剂进行说明。
A.荧光金属复合物 —般而言，“荧光金属复合物”这一表述意在表示由镧系元素或钌以及多齿络合剂 (polydentate complexing agent)组成的化合物，所述多齿络合剂即包含至少2个、优选 2-9个电子供体杂原子(如N、0或S)的试剂，这些原子与所述镧系元素或钌形成配位键。 优选地，所述荧光金属复合物包含一个或多个由芳香结构组成的生色团；优选地，这些芳香结构包含1、2或3个选自N和0的杂原子，所述杂原子起到镧系元素配位原子或钌配位原子的作用。
适于本发明目的的荧光金属复合物在络合剂与稀土金属缔合/解离的情况下应当保持稳定，其形成常数(Kf)应优选大于κΓΜ—1。
许多络合剂都已有记载且为本领域技术人员所知对于络合剂的实例，可以提及以下化合物EDTA、DTPA、TTHA、DOTA、NTA、HDTA、DTPP、EDTP、HDTP、NTP、DOTP、D03A 及 DOTAGA。
适于本发明目的的荧光金属复合物的实例为 镧系元素穴状化合物，所述穴状化合物包含一个或多个吡啶单元。这类稀土金属穴状化合物记载于例如专利EP 0 180 492、EP 0 321 353和EP 0 601 113中以及国际申请WO 01/96877中。铽(Tb3+)及铕(Eu3+)的穴状化合物尤其适于本发明的目的。Cisbio Bioassay公司出售所述镧系元素穴状化合物。以非限制性实例的方式提及具有下式的铕穴状化合物，所述穴状化合物能够与标记有反应基团(如NHS基团或反应基团R)的化合物偶联。
权利要求
1. 一种对目标跨膜蛋白的内化进行检测的方法，所述跨膜蛋白在细胞表面表达，所述方法包括以下步骤a)用含有镧系元素或钌的荧光金属复合物标记所述目标蛋白，所述荧光金属复合物的寿命大于0. Ims ；b)向反应介质中加入能够引起所述目标蛋白内化的化合物；c)向反应介质中加入调节剂，所述调节剂选自1.与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物，所述FRET受体化合物在所述反应介质中的终浓度大于ΙΟ—、，所述FRET受体化合物的分子量小于50kD ；2.还原剂，其氧化还原电位小于+0.IV ；3.与所述荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂；4.金属离子，所述金属离子与所述镧系元素或所述钌竞争以形成非荧光金属复合物；d)当所述化合物是荧光受体化合物时，在所述荧光金属复合物的发射波长和/或所述调节化合物的发射波长下，测定所述反应介质所发出的光；e)将步骤d)中测定的信号与仅经历步骤a)和c)的细胞上测定的参比信号进行比较， 步骤d)中测定的信号与所述参比信号的差别表示所述目标蛋白的内化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤按照a)、b)、c)、d)、e)的顺序实施。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节剂为FRET受体化合物或还原剂； 其特征还在于，所述步骤按照a)、c)、b)、d)、e)的顺序实施。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤a)及下一个步骤之间包括清洗步骤。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物的寿命为 0. 5_6ms0
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是a)镧系元素复合物，其中，所述镧系元素选自铕、铽、钕、钐及镝；或b)钌复合物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是镧系元素螯合物或镧系元素穴状化合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物包含(i)2-9个选自 N、0及S的电子供体杂原子，这些原子与所述镧系元素或钌形成配位键；以及(ii) 一个或多个含有芳香结构的生色团，所述芳香结构包含1、2或3个选自N和0的杂原子，所述杂原子起到镧系元素配位原子或钌配位原子的作用。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物，所述FRET受体化合物在所述反应介质中的终浓度大于10_7M，所述FRET受体化合物的分子量小于50kD。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述FRET受体化合物在所述反应介质中的终浓度为ΙΟ—Μ至1(Γ3Μ，以及所述FRET受体化合物的分子量为0. I-IOkD。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是选自以下化合物的荧光受体化合物花青苷衍生物、DY647、D2、Cy5, Cy5_C00H、荧光素、香豆素、罗丹明、carbopyronine、噁嗪及噁嗪类似物、Alexa Fluor荧光团、结晶紫、茈酰亚胺荧光团、方酸菁荧光团、硼-二吡咯甲烯基衍生物、NBD(硝基苯并噁二唑)及NBD衍生物、 DABCYL(4-((4-( 二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是选自以下化合物的荧光受体化合物荧光素及其衍生物；以及花青苷衍生物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是选自以下化合物的非荧光受体化合物:QXL 570、QXL 610、QXL 670 及 QXL 680 ；DYQ660 及 DYQ661 ；QSY7、 QSY9 及 QSY21。
14.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节化合物是选自以下化合物的还原剂碘离子；抗坏血酸根；尿酸根；儿茶酚离子；无机化合物，如i^(CN)62+。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述调节剂是还原剂；其特征还在于，步骤a)包括加入第一荧光金属复合物以及加入第二荧光金属复合物，所述荧光金属复合物具有相同的螯合结构，但与不同的金属进行络合。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一金属复合物是铕复合物，所述第二金属复合物是铽复合物，所述的铽复合物及铕复合物具有相同的螯合结构。
17.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述调节化合物是与所述荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂，所述调节化合物选自以下化合物抗体、抗体片段、肽或适体；上述每种化合物都具有与荧光金属复合物结合的域。
18.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述调节化合物是金属离子，所述金属离子与镧系元素或钌竞争以形成非荧光金属复合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述离子是锰离子。
20.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，用所述荧光金属复合物对所述目标蛋白进行的标记是通过结合伴侣对进行的间接标记，所述结合伴侣对的成员之一与所述荧光金属复合物共价缀合，另一个成员与所述目标蛋白共价缀合或天然存在于所述目标蛋白之上。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣对选自以下的对序列 CCXXCC/双砷化合物，所述序列CCXXCC为SEQ ID No. 1，其中C =半胱氨酸，X =任意氨基酸；BTX肽/环蛇毒素；链霉亲和素/生物素，或亲和素/生物素；eDHFR片段/三甲氧苄二氨嘧啶；标签/标签抗体；目标蛋白的已知配体/目标蛋白。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物与标签抗体共价键合，所述标签抗体选自所述目标蛋白的特异性抗体；标签的特异性抗体，所述标签选自 GST、6HIS、Myc, FLAG及HA ；其特征还在于，所述目标蛋白含有相应的标签。
23.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，用所述荧光金属复合物对所述目标蛋白进行的标记是通过共价键进行的直接标记。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物与自杀酶的底物缀合；其特征还在于，所述目标蛋白以融合蛋白的形式表达，所述融合蛋白的胞外部分含有所述自杀酶。
25.如权利要求M所述的方法，其特征在于，所述自杀酶/自杀酶底物对选自以下的对烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体/苄基鸟嘌呤；烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体 /苄基胞嘧啶；脱卤素酶突变体/氯烷烃；在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶存在的情况下，酰基载体蛋白/辅酶A。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物包含第一反应基团， 所述第一反应基团能够与所述目标蛋白上存在的第二反应基团形成共价键，尤其是与以下第二反应基团形成共价键末端氨基、末端羧基、天冬氨酸的羧基及谷氨酸的羧基、赖氨酸的胺基、精氨酸的胍基、半胱氨酸的巯基、酪氨酸的酚基、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。
27.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物包含马来酰亚胺基， 所述马来酰亚胺基用于与所述目标蛋白的巯基进行反应。
28.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是铕穴状化合物或铽穴状化合物，所述铕穴状化合物或铽穴状化合物共价键合至苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶或它们的衍生物之一；其特征还在于，所述目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达。
29.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是铕穴状化合物或铽穴状化合物，所述铕穴状化合物或铽穴状化合物共价键合至苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶；其特征还在于，所述目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达；其特征还在于，所述调节化合物是花青苷衍生物，尤其是Cy5或Cy5-C00H。
30.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是铕穴状化合物或铽穴状化合物，所述铕穴状化合物或铽穴状化合物共价键合至苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶；其特征还在于，所述目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达；其特征还在于，所述调节化合物是荧光素或荧光素衍生物之一。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白选自G-蛋白偶联受体及受体酪氨酸激酶。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述预备步骤 用包含编码所述目标蛋白的DNA序列的表达载体转染细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述表达载体包含编码融合蛋白的序列， 所述融合蛋白的N端部分包含自杀酶，所述融合蛋白的C端部分包含所述目标蛋白；其特征还在于，所述目标蛋白是GPCR或RTK。
34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述转染步骤还包括将包含编码 β -视紫红质抑制蛋白1的DNA序列的载体进行共转染。
全文摘要
一种对目标跨膜蛋白的内化进行检测的方法，所述跨膜蛋白在细胞表面表达，所述方法包括以下步骤a)用荧光金属复合物标记所述目标蛋白，所述荧光金属复合物的寿命大于0.1ms；b)向反应介质中加入能够引起所述目标蛋白内化的组合物；c)向反应介质中加入调节剂，所述调节剂选自a.与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物，所述FRET受体化合物在反应介质中的终浓度大于10-7M；b.还原剂，其氧化还原电位小于+0.1V，优选为0.25-0.75V；c.与所述荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂；d.金属离子，所述金属离子与稀土金属竞争以形成非荧光金属复合物；d)当所述化合物是荧光受体化合物时，在所述荧光金属复合物的发射波长和/或所述调节化合物的发射波长下，测定反应介质所发出的光；e)将步骤d)中测定的信号与仅经历步骤a)和c)的细胞上测定的参比信号进行比较。用途对膜蛋白内化进行检测的方法。
文档编号G01N33/58GK102187223SQ200980138526
公开日2011年9月14日 申请日期2009年7月30日 优先权日2008年7月31日
发明者于里安·兹维尔, 罗伯特·波尔, 埃尔韦·安萨奈, 米歇尔·芬克, 埃里克·特兰凯特 申请人:Cis-生物国际公司