专利名称：一种用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法
技术领域：
本发明涉及一种用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法。
背景技术：
产品的可溯源性是实施问题产品召回的前提，因此，农产品的可溯源性得到生产企业和消费者的关注。随着新的《农产品质量安全法》颁布实施，我国将逐步实行农产品质量安全追溯制度，对市场上销售的不符合质量安全标准的农产品追根溯源，查明责任，依法处理。全程记录制度与溯源检测技术是实现农产品可溯源性的两大基础。我国农业生产主要以家庭为单元，规模小数量众多，农产品的销售经营也以自由市场为主，从农田到餐桌的中间环节多。因此，实施全程记录制度非常困难，也不现实。通过检测进行产品产地或某种安全成分的溯源技术显得尤为重要。进行溯源性检测的作用有以下四个方面1、验证已标明产地产品的真实性，与条形码溯源系统形成互为验证的平行技术；2、识别错标记或假冒产品；3、辨别第三国(地)产品；4、甄别有特别标注例如“有机”、“绿色”、“生态”产品。
溯源检测技术就是通过一些物理、化学、生物学的方法来追溯产品的品种、饲养制度和地理起源以及产品在加工和储存中所经历的过程。其特点是在不知背景的前提下，获得各环节的信息。目前，稳定同位素碳、氮、氢、氧分析中最主要的溯源检测技术。不同的稳定同位素相对丰度反映出农产品的不同特征，例如，稳定氢和氧同位素丰度反映了物质蒸发、浓缩和沉淀等地质信息，稳定碳同位素反映了植物的光合作用类别，稳定氮同位素丰度揭示了作物生长距回归线的位置等。很多的研究报道表明，通过稳定同位素的分析，可以农产品的产地、饲料、构成等信息，进行产品的溯源或真实性鉴别。我国在2002年制定了“蜂蜜中碳-4植物糖的测定方法-稳定碳同位素比例法”等国家标准，在分析技术上为我国对蜂蜜掺假的管理提供了技术保证。但是，这些检测方法的前处理程序长，分析程序需要12个小时左右；而且，对于固体共植物样品的剪切、干燥、匀浆等处理时，存在金属器具的污染，造成检测结果失真等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法。
本发明提供的用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法，包括如下步骤 将动物样品盛放于无稳定同位素干扰的器具中冷冻干燥后，再用无稳定同位素干扰的器具研磨成粉末，完成所述用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法。
上述方法中，所述无稳定同位素干扰的器具为由陶瓷材料构成的器具，所述由陶瓷材料构成的器具为研钵、剪或刀，选用陶瓷材料构成的器具，能够避免稳定同位素检测中器具(如金属器具)中同位素对检测结果造成的干扰，各种由陶瓷材料构成的器具均适用于本方法。所述冷冻干燥步骤中，温度为-25℃至-65℃，优选-40℃，时间以样品完全干燥为止；所述粉末的目数为过20-40目的孔径筛，优选过40目的孔径筛。该方法中，所述稳定同位素为碳稳定同位素和氮稳定同位素。另外，对于体积较大的动物样品，可先用所述由陶瓷材料构成的器具(如剪或刀)对所述动物样品进行切片和切碎，再进行后续的冷冻和干燥处理。如图2所示冷冻干燥设备等各种常用的冷冻干燥装置均适用于本方法。
该方法尤其适用于动物肌肉样品、动物肝脏样品或动物体液样品中稳定同位素检测时的前处理。当所述动物样品为动物体液样品时，在所述用无稳定同位素干扰的器具研磨成粉末的步骤之后，还进行如下处理将所述粉末浸于二氯乙烷中进行脱脂，过滤，干燥。所述脱脂步骤中，时间为1-2小时，优选1小时，温度为55-65℃，优选60℃，过滤除去杂质，取滤液，所述干燥步骤中，温度为不高于50℃，优选40℃，时间以样品完全干燥为止。
本发明选用无稳定同位素干扰的陶瓷研钵、剪或刀，对动物样品进行切割和磨碎，并以冷冻干燥代替现有方法中的热干燥步骤，以减少热干燥空气中稳定同位素与样品中相同稳定同位素的交换。利用该方法对动物样品进行前处理后进行稳定同位素的检测时，稳定同位素检测结果准确，多次检测结果变异系数小，因而，本发明提供的方法是一种简单准确有效的动物样品稳定同位素检测时的前处理方法，有助于提高农产品中稳定同位素检测的效率和准确性。
图1为本发明实施例中样品切割或磨碎时所用的陶瓷研钵、陶瓷剪和陶瓷刀，由左至右依次为陶瓷研钵、陶瓷剪和陶瓷刀。
图2为本发明前处理方法中所用冷冻干燥设备。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1、固体动物组织样品的前处理 1)将由欧盟-食品溯源研究项目提供、合同号为006942的两份参考样品牛肉(分别为参考样品1和参考样品2)稍稍解冻后，用陶瓷刀将每个至少50g所述参考样品1和参考样品2切成厚度为2mm的薄片，盛放于陶瓷器皿中后置于低温冰箱中，于-80±5℃冷冻60分钟后取出，再用图2所示冷冻干燥机在-40℃下干燥，使所述参考样品1和参考样品2完全干燥(如样品未完全干燥，用手触摸盛放样品的陶瓷器皿，感觉比周围其余物品凉)。干燥完成后，将所述参考样品1和参考样品2用陶瓷剪刀剪碎，再用陶瓷研钵磨碎，使粉末过40目孔径筛，完成所述参考样品1和参考样品2的稳定同位素检测时的前处理操作。
将与上完全相同的牛肉样品参考样品1和参考样品2，分别用文献报道(该方法为将牛肉样品经绞肉机绞碎，在70℃恒温干燥48h，用粉碎机粉碎。)的方法和现有国家标准(GB/T18932.1-2002)所提供的前处理方法进行前处理，每个样品测定10次，每次2个平行样。所述参考样品1和参考样品2牛肉的碳同位素和氮同位素均由欧盟6个同位素分析实验室共同测定赋值。
将上述用三种不同前处理方法处理完毕的牛肉样品，按照下述方法测定其中碳、氮稳定同位素的相对丰度。
1)测定程序 取1mg样品，锡箔杯包好后通过自动采样器送到元素分析仪(Flash EA1112型)中，在此样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2气体和N2气体后，再经过型号为ConfloIII型的稀释仪，最后进入DELTAPlus Thermo Finnigan质谱仪进行检测。
具体工作参数如下 元素分析仪氧化炉温度为900℃，还原炉温度650℃，进样器氦气吹扫流量为300ml/min，氧气流量为240ml/min，参考气流量200ml/min。
ConfloIII型稀释仪氦气压力为0.6bar，CO2参考气压力为bar，N2参考气压力为1.0bar。
DELTAPlus Thermo Finnigan质谱仪分析柱温度为40℃；用USGS24(δ13CPDB＝-16.00‰)标定CO2钢瓶，用IAEAN1(δ15Nair＝0.4‰)标定N2钢瓶。用标定的钢瓶气作为标准。
2)结果计算 国际上公认使用相对量表示同位素的富集程度，计算公式为 δ‰＝(R样品/R标准-1)×1000 其中，稳定性碳、氮同位素比率分别用δ13C‰和δ15N‰表示，R为样品中重同位素与轻同位素的丰度比，即13C/12C和15N/14N。国际通用的标准物质对碳同位素是美国南卡罗来纳州PeeDee建造中白垩系的拟箭石(PDB)，对氮同位素是大气氮。
3)测定结果 按照步骤2)的计算公式，由电脑对质谱仪的谱图结果按照既定程序进行计算，所得碳同位素和氮同位素的测定结果分别如表1和表2所示。
表1、碳同位素测定的结果
α*表示显著性检测水平，不同的小写字母表示具有显著差异，相同的小写字母表示无显著性差异；α表示极显著性检测水平，不同的大写字母表示具有极显著差异，相同的大写字母表示无显著性差异。
表2、氮同位素测定的结果
α*表示显著性检测水平，不同的小写字母表示具有显著差异，相同的小写字母表示无显著性差异；α表示极显著性检测水平，不同的大写字母表示具有极显著差异，相同的大写字母表示无显著性差异。
由表1和表2可知，用本发明提供的前处理方法，对两个参考样品牛肉进行处理后，用同位素质谱法测定结果的准确性与变异系数都与欧盟6个同位素分析实验室共同测定所赋值接近，无显著性差异。而用文献报道的方法和现有国家标准(GB/T18932.1-2002)所提供方法进行前处理后，用同样的方法和设备进行检测，碳同位素结果显著低于欧盟实验室所赋值(α＜0.01)，氮同位素结果明显高于欧盟实验室所赋值(α＜0.01)，且10次测定的变异系数过大，表明本发明提供的前处理方法准确有效。
实施例2、液体动物组织样品前处理 分别取由欧盟-食品溯源研究项目提供、合同号为006942的两份参考样品牛血液(分别为参考样品1和参考样品2)各30ml稍稍解冻后，盛放于陶瓷器皿中(如小烧杯)中，置于冰箱中-80℃经4-6小时后冻实，封口膜封住烧杯口，针刺小孔，放入图2所示冷冻干燥机中于-50℃干燥24小时，此时所述参考样品1和参考样品2已完全干燥，取出所述两样品后，用由陶瓷材料制成的研钵研至过40目的孔径筛，再浸泡于二氯甲烷中于60℃脱脂1小时，将脱脂后的溶液过滤，去除杂质，取滤液，将所述滤液于40℃下风干，完成所述牛血液样品的前处理。
将与上完全相同的牛血液样品参考样品1和参考样品2，分别用文献报道(该方法为将样品放入40ml玻璃离心管离心(离心力为15000g)，后过滤去除固体物质。取10克样品放入50ml离心管，加入4ml去离子水，蜗旋震荡。在分取2-3ml于80℃水浴震荡3-4个小时，样品再次离心(15000g)，取上清后，沉淀用5ml去离子水洗5次，沉淀完全溶解后，转入1.5ml离心管，离心后去上清液，沉淀热干燥后待测。)的方法和现有国家标准(GB/T18932.1-2002)所提供的前处理方法进行前处理。并对两份参考样品牛血液(由欧盟-食品溯源研究项目提供，合同号为006942)进行前处理，每个样品测定10次，每次2个平行样。该两份参考样品牛血液的碳同位素和氮同位素均由欧盟6个同位素分析实验室共同测定赋值。
将上述用三种不同前处理方法处理完毕的牛血液样品，按照下述方法测定其中碳、氮稳定同位素的相对丰度。
1)测定程序 取1mg样品，用锡箔杯包好后通过自动采样器送到元素分析仪(Flash EA1112型)，待样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2气体和N2气体后，再经过型号为ConfloIII型的稀释仪，最后进入DELTAPlus Thermo Finnigan质谱仪进行检测。
具体工作参数如下 元素分析仪氧化炉温度为900℃，还原炉温度650℃，进样器氦气吹扫流量为300ml/min，氧气流量为240ml/min，参考气流量200ml/min。
ConfloIII型稀释仪氦气压力为0.6bar，CO2参考气压力为bar，N2参考气压力为1.0bar。
DELTAPlus Thermo Finnigan质谱仪分析柱温度为40℃；用USGS24(δ13CPDB＝-16.00‰)标定CO2钢瓶，用IAEAN1(δ15Nair＝0.4‰)标定N2钢瓶。用标定的钢瓶气作为标准。
2)结果计算 国际上公认使用相对量来表示同位素的富集程度，计算公式为 δ‰＝(R样品/R标准-1)×1000 其中，稳定性碳、氮同位素比率分别用δ13C‰和δ15N‰表示，R为样品中重同位素与轻同位素的丰度比，即13C/12C和15N/14N。国际通用的标准物质对碳同位素是美国南卡罗来纳州PeeDee建造中白垩系的拟箭石(PDB)，对氮同位素是大气氮。
3)测定结果 按照步骤2)的计算公式，由电脑对质谱仪的谱图结果按照既定程序进行计算，所得碳同位素和氮同位素的测定结果分别如表3和表4所示。
表3、碳同位素测定的结果
α*表示显著性检测水平，不同的小写字母表示具有显著差异，相同的小写字母表示无显著性差异；α表示极显著性检测水平，不同的大写字母表示具有极显著差异，相同的大写字母表示无显著性差异。
表4、氮同位素测定的结果
α*表示显著性检测水平，不同的小写字母表示具有显著差异，相同的小写字母表示无显著性差异；α表示极显著性检测水平，不同的大写字母表示具有极显著差异，相同的大写字母表示无显著性差异。
由表3和表4可知，用本发明提供的前处理方法对参考样品牛血液进行处理后，用同位素质谱法测定结果的准确性与变异系数都与欧盟6个同位素分析实验室共同测定所赋值接近，无显著性差异。而用文献报道的方法和现有国家标准(GB/T18932.1-2002)所提供方法进行前处理后，用同样的方法和设备进行检测，碳同位素结果显著低于欧盟实验室所赋值(α＜0.01)，氮同位素结果明显高于欧盟实验室所赋值(α＜0.01)，且10次测定的变异系数过大，表明本发明提供的前处理方法准确有效。
权利要求
1.一种用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法，包括如下步骤
将动物样品盛放于无稳定同位素干扰的器具中冷冻干燥后，再用无稳定同位素干扰的器具研磨成粉末，完成所述用于稳定同位素检测的动物样品的前处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述无稳定同位素干扰的器具为由陶瓷材料构成的器具。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述冷冻干燥步骤中，温度为-25℃至-65℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述冷冻干燥步骤中，温度为-40℃。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述粉末的目数为过20-40目的孔径筛。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述粉末的目数为过40目的孔径筛。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述动物样品为动物肌肉样品或动物体液样品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述动物样品为动物体液样品时，在所述用无稳定同位素干扰的器具研磨成粉末的步骤之后，还进行如下处理将所述粉末浸于二氯乙烷中进行脱脂，过滤，干燥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述脱脂步骤中，时间为1-2小时，优选1小时，温度为55-65℃，优选60℃；所述干燥步骤中，温度为25-50℃，优选40℃。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述动物样品为牛肉或牛血液；所述稳定同位素为碳稳定同位素和氮稳定同位素。
全文摘要
本发明公开了一种用于稳定同位素检测的动物样品的前处理方法。该方法，包括如下步骤将动物样品盛放于无稳定同位素干扰的器具中冷冻干燥后，再用无稳定同位素干扰的器具研磨成粉末，完成所述检测动物样品中稳定同位素的前处理。本发明选用无稳定同位素干扰的陶瓷研钵、剪或刀，对动物样品进行切割和磨碎，并以冷冻干燥代替现有方法中的热干燥步骤，以减少热干燥空气中稳定同位素与样品中相同稳定同位素的交换。利用该方法对动物样品进行前处理后进行稳定同位素的检测时，稳定同位素检测结果准确，多次检测结果变异系数小，因而，本发明提供的方法是一种简单准确有效的动物样品稳定同位素检测时的前处理方法，有助于提高农产品中稳定同位素检测的效率和准确性。
文档编号G01N1/28GK101813583SQ201010155399
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月26日 优先权日2010年4月26日
发明者杨曙明, 孙丰梅, 王慧文, 吴伟, 西门·凯利 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所