专利名称：一种合成线粒体靶向自旋捕捉剂MitoPBN(自旋探针)系列化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种MitoPBN系列化合物的简便实用的制备方法，本发明具有合成步 骤较短，原料廉价易得，产物纯度相对较高的特点。其功能可把捕捉自由基信号的探针进入 细胞线粒体，通过对探针结合物的捡测，可早期观察分析细胞氧化还原微环境的变化信息， 并可早期干预。从而可实现对病变部位的预警和对疾病的早期防治。
背景技术：
机体中不停地产生含氧和含氮的自由基物质(R0S和RNS)，它们在生命活动中扮 演着极为重要的角色。在生理情况下体内自由基不断产生，也不断被清除，使自由基浓度保 持在动态平衡之中。当某些因素导致这一平衡失调时，机体将出现相关病变，如癌症、炎症、 衰老等。自由基的危害主要是损伤生物大分子。⑴自由基对DNA的损伤研究证明，自由 基引起的细胞内DNA氢链断裂，碱基降解和主链解旋。这些损伤可能是永久性的，也可以被 修复，但修复后的DNA突变率远大于正常的DNA的突变率。(2)自由基对生物大分子的损 伤主要通过修饰氨基酸残基，引起结构和空间的构象变化，导致肽链断裂、聚合、变联。(3) 自由基对其他大分子的毒性作用已有研究证明自由基可损伤生物多糖，透明质酸.不饱 和脂肪酸等。氧自由基可使单糖发生自氧化，引起一系列疾病发作。自旋捕捉剂因其与高反应活性的自由基结合生成稳定自由基的特性，自%问世 以来便在检测自由基，探索自由基及其生物机理的科学研究中大显身手。近几十年来，自 旋捕捉剂取得了迅速的发展，迄今文献报道用于自旋捕捉的化合物已达数百种之多。另一 方面，由于自旋捕捉剂具有一定清除自由基的作用，所以其用于治疗自由基损伤引起的疾 病具有非常好的前景。硝酮类化合物在降低和预防生物体系中自由基引起损伤方面的治 疗作用已在 1990 年由 OliverC.，Starke-Read P.，StadmanE.，Liu G.，Carney J.，Floyd R. Natl. Acad. USA (1990) 87，5144-5147 证明。传统理论认为，机体内自由基最主要的产生场所位于线粒体内，因为线粒体是细 胞能量的提供者。线粒体膜内带负电荷，膜外带正电荷，所以带正电荷的有机小分子可以 在电场力的驱动下进入线粒体膜内。基于这种理论，Martin D. Brand等将季膦盐与自旋 捕捉剂PBN连接在一起，用以靶向定位于线粒体膜内，干预其中的自由基情况。详见文献 Speroxide Activates Uncoupling Proteins by Generating Carbon—centeredRadicals and initiating Lipid Peroxidation-studies using amitochondria-targeted spin trap derived from α -phenyl-N-tert-butylnitron. 2003 ；278 (49) 48534-48545.其合成
路线如式(I)所示。
式(I)此路线需要用到碘代化合物，金属氢化物，存在原料昂贵，反应条件苛刻，制备程 序繁琐，产率不高，产品纯度不高的缺点，这些都严重限制了该领域的研究。且尚未有脂质 体处理可具对胞内氧化还原微环境的探测和干预。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便，成本低廉的高纯度的制备MitoPBN的方法。本发明提供制备线粒体靶向定位的自旋捕捉剂MitoPBN的方法可作为自旋探针 的制备，其步骤为1)将对羟基苯甲醛和二溴代直链烷烃在碱性条件下反应，得到式结构的化合物2)将式结构的化合物与三苯基磷在溶剂中反应得到式结构的季膦盐。3)在溶剂中，冰浴条件下，将式结构的季膦盐、2硝基-2烷基丙烷和锌粉按1/3/10 的当量比混合，再加入4A分子筛，然后滴加冰乙酸，冰乙酸与季膦盐的当量比为5/1，1小时 内滴加完成，加完后继续在冰浴下搅拌6小时，然后置于4摄氏度冰箱存放，再过柱分离。步骤1)所述碱为有机碱或无机碱，有机碱为二乙胺、三乙胺、吡啶、二异丙基胺、 2，4，6_三甲基吡啶、四丁基氟化铵；所述无机碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾或 氢化钠。步骤1)所述的反应时间为10分钟一两周。
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步骤2)反应的溶剂为乙醇、甲醇、苯、甲苯或者丙酮，反应时间为10分钟一两周。步骤3)所述的冰箱存放时间为1小时一两周。步骤4)所述目标物用脂质体处理制备成20-500纳米的自旋探针用于对细胞内氧 化还原微环境的检测和干预。本发明原料价格低廉，反应条件温和，反应步骤较短，中间体纯化简便，产物纯度 高，可应用于对病变部位预警和早期干预。本方法易于实现大量合成，可实现商品化生产。
图1是4-(4-溴代正丁烷氧基)苯甲醛的核磁共振氢谱；图2是(4- (4- 丁氧基)苯甲醛)三苯基膦溴盐的核磁共振氢谱；图3是MitoPBN的核磁共振氢谱。
具体实施例方式实施例MitoPBN的合成1)4-(4-溴丁氧基)苯甲醛的合成在250mL反应瓶中加入对羟基苯甲醛2.0克 (16. 4mmol)，4. 5 克(32. 8mmol,2eq)无水碳酸钾，2. 5mL 的 1，4-二溴丁烷及 50 毫升 DMF， 反应12小时后，反应液倒入150mL冰水中，用乙酸乙酯萃取(50mLX4)，合并有机相，用 IOOmL水洗一次。有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，减压蒸馏得浓缩粗产物。粗产物用 硅胶柱色谱进行分离提纯(洗脱剂乙酸乙酯/石油醚=1/3)。得产物3. lg，产率73%。 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 9. 84 (s, 1H)，7. 78 (d, J = 5. 6Ηζ，2Η)，6· 95 (d, J = 3. 2Hz，2H)， 4. 04 (t, 2H)，3. 46 (t, 2H)，2. 01-2. 05 (m, 2H)，1. 93-1. 97 (m, 2H)。2)季膦盐A的合成 在IOOmL反应瓶中，加入4_(4_溴丁氧基)2. 6克(IOmmol)，三苯基磷 7. 3g (30mmol, 3eq)，50mL乙腈，回流12小时。然后将反应液蒸干，加入5mL 二氯甲烷 溶解，随即倾入50mL乙酸乙酯，有白色沉淀析出，过滤得粗产品。用硅胶柱色谱纯 化粗产品(洗脱剂二氯甲烷/丙酮/甲醇=10/2/1)，得纯的季膦盐A 4.3克，产率 82. 6 %。 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 9. 82(s, 1H), 7. 81-7. 85(m,6H) ,7. 74-7. 77 (m, 5H), 7. 63-7. 67(m，6H)，6. 91(d，J = 2. 6Hz，2H)，4. 19 (t, J = 4. 2Hz，2H)，3. 95 (t，J = 8. 4Hz, 2H)，2. 22-2. 27 (m, 2H)，1. 82-1. 89 (m, 2H)。3)MitoPBN的合成50mL反应瓶中加入季膦盐A 0. 5克(Immol)，活化锌粉0. 65克 (IOmmol，IOeq)，2-硝基-2-甲基丙烷0. 3克(3mmol，3eq)，4A分子筛1克，无水乙醇IOmL0 滴液漏斗中加入5mL乙醇，0. 3克冰乙酸，在冰浴下，1小时内将滴液漏斗中的溶液滴加至反 应瓶中。冰浴下反应12小时，然后转移至4°C冰箱冷藏7天。过滤，滤渣用5mL无水乙醇 洗涤，减压浓缩滤液得粗产物。粗产物用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂二氯甲烷/丙酮/甲醇=10/2/1)，得纯的 MitoPBNO. 27 克，产率 48%。1H NMR(400MHz，CDCl3) δ 8. 24(d, J = 3. 8Hz, 1H)，7. 80-7. 84 (m, 6H)，7. 75-7. 76 (m, 3H)，7. 64-7. 68 (m, 6H)，7. 49 (s, 1H)，6. 84 (d, J = 3. 8Hz,2H) ,4. 15 (t, J = 4. 4Hz,2H),3. 91 (t, J = 11. 2Hz，2H)，2· 22—2. 27 (m，2H)， 1. 8-1. 88(m，2H)，1. 60(s，9H)。
权利要求
一种制备结构的MitoPBN(自旋探针)系列化合物的合成方法，其特征在于包括以下步骤1)将对羟基苯甲醛和二溴代直链烷烃在碱性条件下反应，得到式(I)结构的化合物，其中n为2到18之间的整数。2)将式(I)结构的化合物与三苯基磷在溶剂中反应得到式(III)结构的季膦盐，其中n为2到18之间的整数。3)在溶剂中，冰浴条件下，将式(II)结构的季膦盐、2硝基 2烷基丙烷和锌粉按1/3/10的当量比混合，加入4A分子筛，然后滴加冰乙酸，冰乙酸与季膦盐的当量比为5∶1，1小时内滴加完成，加完后继续在冰浴下搅拌6小时，然后置于4摄氏度冰箱存放，再用色谱柱分离，得目标产物。FSA00000111741300011.tif,FSA00000111741300012.tif
2.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)所述碱为有机碱或无机碱，有机碱 为二乙胺、三乙胺、吡啶、二异丙基胺、2，4，6_三甲基吡啶、四丁基氟化铵；所述无机碱为碳 酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾或氢化钠。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)所述的反应时间为10分钟一两周。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)反应的溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、苯、 甲苯或者丙酮。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)所述的反应时间为10分钟一两周。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)所述的冰箱存放时间为1小时一两周。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4)把自旋探针目标物经脂质体处理， 使粒径做到20至500纳米，用于进入细胞捕捉自旋信号，改变细胞氧化还原微环境。全文摘要
本发明公开了一种制备线粒体靶向定位的自旋捕捉剂MitoPBN(自旋探针)系列化合物的方法，其结构式如式(I)所示。合成流程如式(II)将4-羟基苯甲醛、二溴代直链烷烃在碱性条件下进行消去反应，得产物3；化合物3与三苯基磷反应得到产物4；然后在乙醇中，将化合物4、2-硝基-2-甲基丙烷、4A分子筛和锌粉在溶剂中混合，滴加冰乙酸，室温搅拌反应，然后置于冰箱冷藏，再分离提纯，得自旋探针MitoPBN；再做脂质体包裹处理。本发明具有合成步骤较短，原料廉价易得，产物纯度相对较高的特点。其功能可把捕捉自由基信号的探针进入细胞线粒体。
文档编号G01N33/50GK101906118SQ20101016469
公开日2010年12月8日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者刘珊林, 施冬云, 王东林 申请人:刘珊林