专利名称：一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种猪源蛋白的检测方法，特别涉及一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法。
背景技术：
在动物生产和加工过程中会产生大量废弃物，这些废弃物中含有大量的蛋白质， 可以开发成为蛋白类饲料。已经开发出来的动物蛋白饲料包括鱼粉、血浆蛋白粉、肉骨粉、 血球粉、肠绒毛蛋白粉及其深加工产品。这些动物蛋白饲料富含营养，能促进动物的生长、 发育，并能提高产量，极大地促进了养殖业的发展。1986年疯牛病在英国爆发，之后有许多国家都出现了疯牛病，疯牛病是牛的一种 进行性、致死性和神经性疾病，是一种新的人畜共患病，其病原是朊病毒，近年来发现，肉类 被脑组织中的朊病毒污染，是英国许多新型克雅氏症发病的原因。疯牛病的产生和爆发与动物蛋白饲料，尤其是同源动物蛋白饲料的不正当使用有 关。动物蛋白饲料，特别是同源动物蛋白饲料的生物安全问日益引起人们的关注。为了防止疯牛病从牛传染到其他动物和人，欧盟(EU)和美国分别在1994年和 1997年禁止在反刍动物饲料中添加反刍动物蛋白质。世界卫生组织(WHO)从1996年就推荐 在反刍动物饲料中禁止使用反刍动物组织。我国国家质检总局与农业部联合发布了公告， 禁止从疯牛病发生国家或地区进口反刍动物源性饲料等动物产品，对允许进口的其他非反 刍动物源性饲料，必须做牛、羊源性成分检测。猪肉是我国主要的食用肉来源，占我国肉类生产总量的60%以上。为了防止类似 的疾病出现在猪中，保障人类健康，有必要对猪饲料进行猪源蛋白检测，以确定该猪饲料中 是否添加有猪源蛋白。目前，已经有许多种检测动物源性蛋白的方法。有显微组织、电泳、光谱、色谱、免 疫分析等方法。显微组织检测法是欧盟认可的饲料检测方法，主要根据饲料中各种组织的结构特 征进行判断。目前，显微检查方法能检测肉粉、骨粉、肉骨粉、血粉、鱼粉、水解和未水解的羽 毛粉，但不能区分其中的动物种类。电泳法中，蛋白质条带受多种因素影响，灵敏度和重现性差，在动物源性成分检测 方面的运用有限。光谱法需要用统计模式进行数据处理，每种肉类样品的混合可能使用不同的统计 模式，难以对未知组成的样品进行分析。这种技术难以作为一种常规的检测方法，检测高度 处理过样品，确定动物种类。近红外光谱检测技术是一种间接检测技术，需要大量具有权威性的标准样品以形 成标准或判别模式，同样难以应用于未知组成的动物蛋白饲料的检测。色谱法图谱的复杂，检测多种动物成分的混合物和掺假情况有一定的困难。昂贵 的检测仪器和繁杂的样品制备也限制了色谱作为常规的检测手段。
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自从20世纪初，基于特异性的抗原 抗体反应的免疫分析法就已经用于动物种 类的鉴定。免疫化学的发展导致了新的免疫技术的出现，包括放射免疫分析、酶联免疫分析 和非酶联色谱免疫分析法等，这些方法极大地提高了检测的灵敏度和准确性。琼脂凝胶免疫分析法(AGID)和近年发展起来的酶联免疫吸附试验(ELISA)已经 广泛地应用于动物源性成分的检测。现在已经利用琼脂凝胶免疫分析法制备了动物源性成分检测试剂盒，这些分析 测试的检测限主要依赖于抗血清的量，传统的琼脂凝胶免疫分析法检测限一般是在3% 10%。琼脂凝胶免疫分析法的操作相对简单，但需要充足的抗血清，非动物源性物质的干扰 和过夜孵育限制了琼脂凝胶免疫分析法用于动物源性成分的定量检测。两种最常用于动物源性成分鉴定的ELISA方法是间接ELISA法和夹心ELISA法。 该两种ELISA方法采用的均是动物的肌动蛋白作为抗原制备抗体，以此为基础建立ELISA 方法。但检测的肌动蛋白存在热不稳定性等特点，大大地限制了检测范围，因为饲料在生产 过程中通常需要高温制粒等工艺。同时这类ELISA在对样品进行稀释和检测之前，需要测 定每种提取物的蛋白浓度，提取物的稀释比和组成会影响抗体的结合，从而影响实验结果。 这些特点造成了改方法既不方便也不可靠。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明提供一种可靠、快速、操作简便的猪 源检测方法。本发明所采取的技术方案是一种猪源蛋白的检测方法，包括将一种猪源抗待检测动物IgG的抗体包被在基材 上，然后加入受检样品，之后加入用标记物标记的另一种不同动物源的抗猪源IgG的抗体， 接着加入底物显色。基材包括ELISA板、硝酸纤维素膜。标记物包括辣根过氧化物酶，底物为能与标记物反应生色的化学品。本发明方法检测效果可靠，能快速得到检测结果，操作简便。
具体实施例方式一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法，包括将一种抗猪源IgG的抗体包被在基材 上，然后加入受检样品，之后加入用标记物标记的另一种不同动物源的抗猪源IgG的抗体， 接着加入底物显色。基材包括ELISA板、硝酸纤维素膜。标记物包括辣根过氧化物酶，底物为能与标记物反应生色的化学品。下面结合实例，进一步说明本发明。实施例11)将兔抗猪源IgG抗体包被在ELISA板上；2)将待检样品用PBS稀释，4°C孵育30分钟后离心，取上清50微升；3)将上清滴加至ELISA板上，37°C孵育1小时后，用PBST溶液洗涤3 5次；4)加入HRP标记的羊抗猪源IgG抗体，37°C孵育1小时，用PBST溶液洗涤3 5次，接着加入TMB底物显色。5)显色后可以用酶标仪读数，确定待检样品中是否含有猪源蛋白。实施例21)将羊抗猪源IgG抗体包被在ELISA板上；2)将待检样品用PBS稀释，4°C孵育30分钟后离心，取上清50微升；3)将上清滴加至ELISA板上，37°C孵育1小时后，用PBST溶液洗涤3 5次；4)加入HRP标记的兔或鼠抗猪源IgG抗体，37°C孵育1小时，用PBST溶液洗涤3 5次，接着加入TMB底物显色。5)显色后可以用酶标仪读数，确定待检样品中是否含有猪源蛋白。实施例31)将鼠抗猪源IgG抗体包被在ELISA板上；2)将待检样品用PBS稀释，4°C孵育30分钟后离心，取上清50微升；3)将上清滴加至ELISA板上，37°C孵育1小时后，用PBST溶液洗涤3 5次；4)加入HRP标记的羊或兔抗猪源IgG抗体，37°C孵育1小时，用PBST溶液洗涤3 5次，接着加入TMB底物显色。
5)显色后可以用酶标仪读数，确定待检样品中是否含有猪源蛋白。 按实施例1方法，分别检测不同种类的样品，检测结果如下表所示。 表1、检测对比表
样品
重复次数
检测结果
阳性
阴性
猪血清31.21 ±0.20猪血清*31.16±0.22猪血浆蛋白饲料31.18±0.25猪血浆蛋白饲料*31.20±0.18鸡血清30.23 ±0.05小鼠血清30.11 ±0.02普通饲料30.10±0.05按实施例1方法，分别检测不同浓度的样品，检测结果如下表所示t表2、浓度检测表
以上两个表中，*表示样品进行过热处理，热处理的方法为喷雾干燥，瞬间温度为 180 200°C ；样品OD值> 0. 3时，判定为阳性；样品OD值彡0. 3时，判定为阴性。由表中数据可知，不同猪源蛋白，未进行热处理和热处理过的检测结果无明显差 异，未发生错检，可见本发明检测方法具有很好的敏感性，不易漏检、错检；多次检测结果之 间的偏差小，说明方法的重复性好；样品高度稀释后，依然能够准确地检测出来，检测限低； 只需对样品作简单处理即可，操作方便。虽然以上实施例仅描述了猪源蛋白的检测方法，但是本领域的技术人员，在不用 付出创造性劳动的情况下，也可以将本发明方法应用于禽源、牛源、水产源蛋白的检测。
权利要求
一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法，包括将一种抗猪源IgG的抗体包被在基材上，然后加入受检样品，之后加入用标记物标记的另一种不同动物源的抗猪源IgG的抗体，接着加入底物显色。
2.根据权利要求1所述的一种猪源的检测方法，其特征在于基材包括ELISA板、硝酸 纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的一种猪源的检测方法，其特征在于标记物包括辣根过氧化 物酶。
全文摘要
本发明公开了一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法。方法包括将猪源IgG的抗体包被在基材上，然后加入受检样品，之后加入用标记物标记的另一种不同动物源的抗猪源IgG的抗体，接着加入底物显色。本发明方法敏感性好、重复性好、检测限低、操作方便。
文档编号G01N33/544GK101907626SQ20101023196
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者宋长绪, 朱丹, 蒋智勇, 蔡汝健 申请人:广东省农业科学院兽医研究所