专利名称：一种盐酸克伦特罗磁微粒分离酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及食品安全相关的免疫检测分析技术，特 别提供了一种快速检测盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)的磁微粒分离酶联免疫检测方 法，适用于尿液、肝脏、肉类和其他组织中的盐酸克伦特罗的定量检测。
背景技术：
盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)是一种平喘药。该药物既不是兽药，也不是饲 料添加剂，而是肾上腺类神经兴奋剂。瘦肉精是一种β 2-受体激动剂，20世纪80年代初， 美国一家公司开始将其添加到饲料中，增加瘦肉率，但如果作为饲料添加剂，使用剂量是人 用药剂量的10倍以上，才能达到提高瘦肉率的效果。它用量大、使用时间长、代谢慢，所以 在屠宰前到上市，在猪体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体，就使人体渐渐 地积蓄中毒。如果一次摄入量过大，就会产生异常生理反应的中毒现象，因此而被禁用。国 内养猪户不顾农业部的规定，为了使猪肉不长肥膘，在饲料中掺入盐酸克伦特罗。猪食用后 在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦 肉精。盐酸克伦特罗在胃肠道吸收快，15-20分钟即起作用，2-3小时血浆浓度达峰值， 一般健康人食用20 μ g药效会有所表现，5-10倍的摄入量则会导致中毒，症状为心率加 速、脸色潮红、胸闷、心悸、头痛、发热、寒战。盐酸克伦特罗刺激人体骨骼肌β 2-受体后，引 起人体四肢、面、颈部骨骼肌振颤。长时间亚治疗剂量摄入，激素残留逐渐蓄积引起慢性毒 性作用可使人体产生低敏感现象，即支气管扩张作用明显减弱，作用持续时间缩短，使得哮 喘发生率和发病程度增高，同时还可引起内分泌紊乱，导致血液中乳酸、丙酮酸浓度升高， 糖尿病人可能因此酸中毒。食品和饲料中瘦肉精残留量的检测具有重要意义。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒 分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法， 抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检 测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。“竞争免疫检测法”是一种多用于检测小分子半抗原的方法，其检测原理是待测 抗原与酶标记的抗原竞争结合少量的固相抗体，通过洗涤去除未结合的抗原，最后加入生 物酶催化的显色或发光底物显色。在一定浓度范围内，显色或发光强度与待测抗原含量呈 反比。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有灵敏度高、特异性好、适用性广、操作简便和节省 检测时间的检测CLB的磁微粒分离酶联免疫检测方法。
所述的CLB磁微粒分离酶联免疫检测方法的试剂组成包括①磁分离试剂[结合 有抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的磁微粒混悬液]；②抗试剂(FITC标记的CLB抗体溶 液)；③酶标抗原试剂(偶联有生物酶的CLB溶液)；④清洗液；⑤CLB校准品(含有一定 量CLB抗原的溶液)；⑥质控品(含有一定量CLB抗原的溶液)；⑦底物溶液(显色或发光 底物溶液)；⑧终止液。所述的CLB磁微粒分离酶联免疫检测方法的检测方法如下(1)样本(食品、饲料等)处理尿液样本可以直接用于检测。(如果样本很浑浊， 需要经过离心或者过滤再进行检测)；内脏组织，肌肉等需粉碎均勻，加入一定比例的10% Na2C03,加入乙酸乙酯，混合，离心。取上层液留用，下层沉淀再洗一次，将两次离心的上层 液合并，60°C氮气吹干，加入纯化水复溶，即可用于检测。(2)加样和免疫反应在试管中加入20-200μ 1样本，然后依次加入20-200μ 1酶 标抗原试剂和20-200 μ 1抗试剂。混勻后，37°C温育5-30分钟；(3)加磁分离试剂在试管中加入20-100 μ 1,0. 1-lOmg/ml的磁分离试剂，混勻 后，37 °C温育5-30分钟；(4)洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入100-500 μ 1清洗液，去除磁场，震 荡30秒使磁微粒充分混悬，再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液。如此重复洗涤2-4 次；(5)加底物溶液每管加入50-300 μ 1生物酶催化的显色或发光底物。混勻后， 37°C温育5-30分钟；(6)终止显色每管加入100-300 μ 1终止液，并放在磁分离器上分离10分钟(适 用于显色法)；(7)读值在分光光度计或发光强度检测仪上读取吸光度或发光强度值；所述的 CLB磁微粒分离酶联免疫检测方法的工作原理是首先，通过样本处理过程，使样本中的 CLB溶解在水溶液中用于后续分析。样本提取液与酶标CLB抗原试剂、FITC标抗试剂混合 温育后，样品中的CLB与酶标CLB竞争结合少量的FITC标抗体，形成抗原抗体复合物。加 入偶联有羊抗FITC抗体的磁分离试剂后，磁分离试剂可将免疫复合物捕获到磁微粒表面。 经过洗涤，去除未结合的CLB、酶标CLB和其他杂质。最后加入酶催化的显色或发光底物。 在一定浓度范围内，待测样本中的CLB含量与显色或发光程度呈反比，据此可以定量测定 样本中CLB的含量。本发明的技术解决方案如下(1)磁分离试剂的制备将抗FITC抗体连接在磁微粒表面。所述的磁微粒直径在 0. 1_5.0μπι之间，具有超顺磁性，表面可含有氨基(ΝΗ2-)或羧基(C00H-)活性基团。所述 的羊抗FITC抗体与磁微粒的连接可以通过化学交联剂，如戊二醛、l-ethyl-3-[3-dimethy laminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共价键的形式，也可以通过物理吸 附(静电作用、离子键或疏水作用等)的形式。(2)酶标抗原试剂的制备将CLB衍生物与牛血清白蛋白(BSA)共价连接， 之后再与生物酶共价连接。所述的生物酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)，也可以是碱 性磷酸酶(ALP)。共价连接方法可以通过过碘酸钠氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate(SMCC)、2_Iminothiolane *HC1 (2IT)
4交联等多种方法。(3)抗试剂的制备将CLB抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)的共价连接物溶液。所 述CLB抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。(4)底物溶液所述的底物溶液可以是HRP催化的显色底物甲基联苯胺 (Tetrabenzidine，TMB)或发光底物鲁米诺(Luminol)等，也可以是ALP催化的显色底物单 磷酸酚酞(PMP)或发光底物AMPPD，CSPD和CSPD-Star等。(5) CLB校准品和质控品将高纯度CLB抗原称重后用水溶液溶解分装制成。本发明具有以下优点(1)样本处理方法简单。样本经粉碎、提取、吹干和复溶等简单处理后即可用于检 测，不需过夜处理和过纯化柱等复杂的过程。(2)该方法检测灵敏度高、重复性好、操作简便和节省检测时间的优点。
图1磁微粒分离酶联免疫法检测CLB示意图
具体实施例方式实施例1 抗FITC抗原与表面氨基(C00H-)磁微粒偶联，制备磁分离试剂取IOOmg表面含羧基(C00H-)活性基团的磁微粒用0. IM MES(2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid)，pH 4. 5-5溶液IOml洗涤3次。磁微粒用该溶液Iml重悬，加入2mg 抗FITC抗体，混合均勻。加入100 μ 1 10mg/ml EDC溶液，混合均勻后室温反应2小时。用 IOml含牛血清白蛋白(BSA)的0. OlM磷酸盐缓冲液(PBS)pH7. 4洗涤磁珠3次后，用该 溶液配制成2. 5mg/ml的磁分离试剂工作液。实施例2 =CLB-BSA连接碱性磷酸酶(ALP)，制备酶标抗原试剂取5mg CLB-BSA抗原，浓缩至5mg/ml，加入13. 76mg/ml的活化剂 2-Iminothiolane -HCl (2IT)溶液10 μ 1，室温放置30分钟后加甘氨酸终止活化反应，室温 下放置5分钟。使用Si^phadex G25柱子除盐，收集蛋白洗脱峰。取 5mg ALP 溶液，力口 入 6. 69mg/ml 的 Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)溶液50 μ 1，室温放置15分钟，加入甘氨酸终止活化反 应，室温放置5分钟。使用Si^phadex G25柱子除盐，收集蛋白洗脱峰。将活化的CLB-BSA与活化的ALP混合，室温放置10个小时，然后使用 Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的游离CLB-BSA和ALP，将连接物保存于 4°C。酶标抗原试剂稀释液配制方法为Tris 12. llg，氯化钠8. 77g，叠氮钠lg，加纯化 水至600ml，校正pH值至7. 5。加Tween_20 2mL, BSA 10g，加纯化水定容至1000ml。用 0.22 um过滤器过滤，于4°C保存。将上述CLB-BSA-ALP连接物用上述稀释液稀释到1_5 μ g/ml配制成酶标抗原试剂 工作液。实施例3 抗CLB抗体连接FITC，制备抗试剂取5mg抗CLB抗体溶液对20mM pH9. 0碳酸缓冲液透析超过12h，透析后浓度要求
5大于lmg/ml。加入500 μ 1 0. 5mg/ml的FITC溶液(以20mM pH9. 0碳酸缓冲液配制)，混 勻后室温反应超过12h。使用S印hadex G25柱子除去未结合FITC，收集蛋白洗脱峰。
抗试剂稀释液配制方法与酶标抗原试剂稀释液配制方法相同，将上述CLB抗体 FITC连接物用稀释液稀释到1-5 μ g/ml，配制成抗试剂工作液。实施例4 =CLB磁微粒分离酶免疫检测法检测猪肉样本中CLB
材料与仪器
(1)磁分离试剂见上述磁分离试剂的制备；
⑵酶标抗原试剂见上述酶标抗原试剂的制备；
⑶抗试剂见上述抗试剂的制备；
⑷洗涤液500mL(北京倍爱康生物技术有限公司生产)；
(5)底物溶物(PMP溶液)300mL(北京倍爱康生物技术有限公司生产)；
(6)终止溶液600mL(北京倍爱康生物技术有限公司生产)；
(7)磁分离酶联免疫测定仪北京倍爱康生物技术有限公司生产；
⑶磁分离器北京倍爱康生物技术有限公司生产；
(9)水浴箱(用于37°C温浴)。
(1)检测步骤如下
⑵样本处理从大量均勻样本中取5g，加入3ml 10% Na2C03，震荡3分钟；加入
15ml乙酸乙酯，混合5分钟，4000转/分钟离心5分钟；将上层液全部转到一干净器皿中， 下层沉淀再加入15ml乙酸乙酯，混合5分钟，4000转/分钟离心5分钟；将两次离心的上 层液各取3ml合并(相当于Ig样本)；60°C氮气吹干，加入Iml纯化水复溶；取60 μ 1用于 检测。(3)加样与免疫反应在平底试管中加入60 μ L样本溶液，然后分别依次加入 60 μ 1酶标抗原试剂和60 μ 1抗试剂，混勻后37°C温育15分钟；(4)加磁分离试剂在试管中加入60 μ 1混勻后的磁分离试剂，混勻后37°C温育5 分钟；(5)洗涤将平底试管放在磁分离器上分离2分钟，倒去上清液，每管加入清洗液 300 μ L，充分混勻后，再将平底试管放在磁分离器上分离2分钟，弃去上清液。重复洗涤过 程2次；(6)加入底物溶液每管加入100 μ 1单磷酸酚酞(PMP)底物溶液，混勻后，37°C温 育15分钟；(7)终止显色每管加入300 μ L终止液，并放在磁分离器上分离10分钟；(8)读取吸光度值用分光光度计或磁酶免测定仪读取吸光度值，波长为 492nm/550nmo检测结果(1)测量范围0 IOppb(2)准确度回收率为85 士 15%。(3)重复性批内变异系数CV彡10% ；批间变异系数CV彡15%(4)灵敏度灵敏度不高于0. lppb。(5)特异性与其他类似毒素的交叉反应率见下表。
权利要求
一种盐酸克伦特罗(CLB)磁微粒分离酶联免疫方法，其特征在于检测步骤为(1)加样与免疫反应在试管中加入20 200μl样本溶液、CLB校准品或CLB质控品，然后加入20 200μl酶标抗原试剂和20 200μl抗试剂。混匀后，37℃温育5 30分钟；(2)加磁分离试剂在试管中加入20 100μl磁分离试剂，混匀后，37℃温育5 30分钟；(3)洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入100 500μl清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬30秒，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液。如此重复2 4次；(4)加底物溶液每管加入50 300μl生物酶催化的显色或发光底物，混匀后，37℃温育5 30分钟；(5)终止显色(仅适用于显色法)每管加入100 300μl终止液，并放在磁分离器上分离10分钟；(6)读值在分光光度计或发光强度检测仪上读取吸光度或发光强度值；
2.根据权利要求1所述的抗试剂其特征在于是抗CLB抗体与异硫氰酸荧光素(FITC) 的共价连接物溶液。所述抗CLB抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。其工作浓 度为 0. 2-10μ g/mL·
3.根据权利要求1所述的酶标抗原试剂，其特征在于是盐酸克伦特罗与牛血清白 蛋白(BSA)的共价连接物(CLB-BSA)进一步共价连接生物酶形成的连接物溶液。所述的 生物酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)，也可以是碱性磷酸酶(ALP)。生物酶与CLB-BSA的 连接方法可以通过过碘酸钠氧化法，戊二醛法或Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交联法等多种方法。其 工作浓度为0. 5-5yg/mL·
全文摘要
本发明提供了一种盐酸克伦特罗(CLB)磁微粒分离酶联免疫定量检测方法，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明采用竞争法的免疫检测原理，将CLB与生物酶连接制成酶标抗原试剂，将抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体吸附在磁微粒表面制成磁分离试剂，将FITC与抗CLB抗体连接制成抗试剂。样本中CLB与酶标CLB竞争结合少量的FITC标抗CLB抗体，形成抗原抗体复合物。加入磁分离试剂后，磁微粒表面连接的抗FITC抗体将复合物捕获到磁微粒表面。洗涤，最后加入底物并检测。本发明的优点在于①以磁微粒代替传统酶标板作为固相载体，使免疫反应接近液相条件下进行，反应更充分和迅速，与传统ELISA方法比较，具有特异性高、重复性好的特点；②采用一步竞争法原理，检测用时短。
文档编号G01N21/31GK101907627SQ20101024589
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者仝文斌, 郭健夫, 韩子华, 韩学栋 申请人:北京倍爱康生物技术有限公司