专利名称：一种人胱抑素c的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法
技术领域：
本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及到临床上评价肾功能的一项诊断指标胱 抑素C，提供了一种人胱抑素C的磁分离化学发光免疫检测方法，适用于人血清、血浆或尿 液中胱抑素C的定量检测。
背景技术：
胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员，是一种非糖基化 的碱性蛋白质，相对分子质量为13.3950 等电点为8.0 9.5，由122个氨基酸组成。胱 抑素C编码基因位于人类第20号染色体，具有与“看家基因”的启动子区相同的特征，因此 胱抑素基因被视为“看家基因”。胱抑素C广泛存在于植物、动物及原虫中，由有核细胞以恒 定的速率产生，在人体大部分组织中稳定表达，存在于各种体液中，在脑脊液和精液中浓度 最高，尿液中最低，其生理功能是调节半胱氨酸蛋白酶的活性，在细胞内肽类和蛋白质的代 谢中起重要作用，特别是在胶原代谢中，能使一些前激素的蛋白水解，释放于靶组织中发挥 各自的生物学作用。胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的简称，以前也被称作Y-痕迹 蛋白(Y -traceprotein)或 Y-后球蛋白(post-γ-globulin)。胱抑素C在临床上被视为监测肾功能的一项高灵敏度，高特异性的指标。胱抑素 C因其低相对分子质量，且在生理PH环境中带正电荷，故可自由通过肾小球滤过膜，在近曲 小管几乎完全被重吸收并降解，不再回到血循环中。血清胱抑素C被认为是比肌酐、尿素氮 等更理想、更灵敏的测定肾小球滤过率的内源性指标；尿胱抑素C水平可反映肾小管功能； 另外胱抑素C在肾衰竭、肾移植、糖尿病肾病、高血压肾病等继发性肾病的早期检测及预后 监测中也有应用。目前临床检验用胱抑素C试剂盒主要是采用免疫比浊法，与酶联免疫法、免疫荧 光技术、化学发光免疫等分析技术相比其灵敏度、精密度和特异性明显较差。本发明所采用 的磁微粒分离化学发光免疫检测方法是酶标记技术、磁分离技术和化学发光检测技术的结 合，酶促底物发光的专一性高、反应高效、反应条件温和、发光值稳定且受外界条件影响较 小；磁分离技术中采用的0. 01-5 μ m磁性微粒子作为载体，免疫反应在准液相条件下进行 并通过外加磁场对免疫复合物与未反应物进行分离，使得免疫反应和分离快速而彻底，相 对于固相载体其灵敏度、特异性好和精度都得到了很大提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有灵敏度高、特异性好、适用性广的检测人胱抑素C 的磁微粒分离化学发光免疫检测方法。本发明生成的胱抑素C磁微粒分离化学发光免疫的试剂盒组成包括①胱抑素C 校准品(含一系列浓度的胱抑素C，用于建立标准曲线)；②胱抑素C质控品(由人血清配 制而成，含一定浓度胱抑素C)；③胱抑素C稀释液(用于稀释高浓度样本)；④胱抑素C抗 试剂(偶联有生物酶的胱抑素C抗体和偶联有FITC的胱抑素C抗体的混合溶液)；⑤磁分离试剂(结合抗FITC的磁微粒混悬液)⑥清洗液浓缩液(用于配制清洗液)；⑦底物溶 液(生物酶催化的发光底物)。所述的胱抑素C磁微粒分离化学发光免疫检测方法的检测步骤如下(1)加样与免疫反应在试管中加入5-100 μ L处理好的样本和质控品，然后加入 10-500 μ L胱抑素C抗试剂，混勻，37°C温育5-60分钟；(2)免疫复合物与磁微粒结合向试管中加入20-100 μ L磁分离试剂，混勻，37°C 温育0-30分钟(也可不温育)；(3)磁分离与洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去除上清；加入100-600 μ L清洗液， 去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清；可再次加 入洗液清洗一次(也可省去)；(4)加底物溶液并读出样本浓度每管加入50-300 μ L生物酶催化的发光底物，酶 促底物发光，根据样本的发光值从标准曲线上读出样本中胱抑素C含量。所述的胱抑素C磁微粒分离化学发光免疫检测方法的工作原理是首先，待检样 本与酶标记抗体、FITC标记抗体特异性结合形成“三明治”结构的夹心复合物，夹心复合物 再与磁微粒特异性结合(通过抗体上偶联的FITC与磁微粒上的抗FITC结合)；经过洗涤， 结合物通过外加磁场被留下，未结合的抗原、抗体和其他物质被去除；加入底物，用化学发 光分析仪检测其发光值。在一定浓度范围内，待测样本中的胱抑素C浓度与发光值成正比， 最后通过用四参数拟合出的标准曲线计算出样本的浓度。本发明的技术解决方案如下(1)磁分离试剂的制备将FITC抗体连接在磁微粒表面。所述的磁微粒直径在 0.01-5.0μπι之间，具有超顺磁性，表面含有氨基(ΝΗ2-)或羧基(C00H-)活性基团。所述的 FITC抗体与磁微粒可以通过化学交联剂，如戊二醛、l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共价键的形式，也可以通过物理吸附(静电作用、 离子键或疏水作用等)的形式进行偶联。(2)胱抑素C抗试剂中酶标抗体的制备将生物酶与胱抑素C抗体偶联， 所述的生物酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)，也可以是碱性磷酸酶(ALP)。偶联 方法可以是过碘酸钠氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交联等多种方法。(3)底物溶液所述的底物溶液可以是HRP催化的发光底物鲁米诺(Luminol)，也 可以是ALP催化的发光底物AMPPD，CSPD和CSPD-Star等。(4)质控品选取经灭活的人血清，将其混合后用稀释液按一定比例稀释而成。
图1为血清样本的线性图，图2为尿液样本的线性图。
具体实施例方式实施例1 抗FITC抗原与表面氨基(C00H-)磁微粒偶联，制备磁分离试剂取IOOmg表面含羧基(C00H-)活性基团的磁微粒用0. IM MES(2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid)，pH 4. 5-5溶液10ml洗涤3次。磁微粒用该溶液Iml重悬，加入
42mg抗FITC抗体，混合均勻。加入100 μ 1 10mg/ml EDC溶液，混合均勻后室温反应2小时。 用IOml含牛血清白蛋白(BSA)的0.0IM磷酸盐缓冲液(PBS)pH7. 4洗涤磁珠3次后，用 该溶液配制成2. 5mg/ml的磁分离试剂工作液。实施例2 碱性磷酸酶(ALP)与胱抑素C抗体的偶联取5mg胱抑素C抗体，浓缩至5mg/ml，加入13. 76mg/mL的活化剂 2-Iminothiolane -HCl (2IT)溶液10 μ 1，室温放置20分钟后加甘氨酸终止活化反应，室温 下放置5分钟。使用PGlO柱子除盐，收集洗脱蛋白。取 5mg ALP 溶液，力口 入 6. 69mg/mL 的 Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)溶液50 μ 1，室温放置30分钟，加入甘氨酸终止活化反 应，室温放置5分钟。使用PGlO柱子除盐，收集洗脱蛋白。将收集的胱抑素C抗体与收集的ALP混合，4 °C反应20个小时，然后使用 Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第二峰和第三峰即偶联物，并将其保存于4°C。实施例3 检测血清中胱抑素C含量用本试剂盒对500例体检者血清进行检测，其中男女各半，分析体检人群中胱抑 素C的血清水平。材料与仪器(1)胱抑素C试剂盒；(2)化学发光免疫分析仪MAGLIA60 北京倍爱康生物技术有限公司生产；(3)磁分离器北京倍爱康生物技术有限公司生产；(4)水浴箱(用于37°C温浴)。检测步骤如下(1)加样与免疫反应在试管中加入15 μ L处理好的样本、和质控品，然后加入 90 μ L胱抑素C抗试剂，混勻，37 °C温育30分钟；(2)免疫复合物与磁微粒结合向试管中加入40 μ L磁分离试剂，混勻，37°C温育5 分钟；(3)磁分离与洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去除上清；加入300 μ L清洗液，去 除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清。再次加入 300 μ L清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除 上清；(4)加底物溶液并读出浓度每管加入200 μ L底物溶液，酶促底物发光，根据样本 的发光值从标准曲线上读出样本中胱抑素C含量。检测结果90%的人群(500例)血清水平为465. 352 1072. 231ng/ml，符合文献报道。实施例4 本试剂盒的性能评价根据体外诊断试剂的特点，按惯例检测本试剂盒的灵敏度、线性、准确性、精密度 和特异性。材料与仪器、检测步骤同实施例3。检测结果(1)灵敏度0. 001mg/L以下；免疫比浊法A(申请号=200810084390. X)灵敏度为 0. lmg/L，免疫比浊法B(申请号=200910090689. 0)灵敏度为0. 06mg/L (均按同一方法进行
5计算)；(2)线性；r2 = 0.9991 (将1例血清样本用稀释液分别按1/4、1/8、1/32、1/64、 1/256稀释；将1例尿液样本用稀释液按1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 ；用试剂盒检 测稀释后样本，以稀释比例和检测浓度做回归曲线，求出相关系数r的平方值，回归曲线见 图1、图2)；(3)准确性通过加样回收评价其准确性，即向样本中添加已知量的胱抑素C的纯 品，血清、尿液中加样回收率在89% 110%，数据见表1 ；
添加前样本值添加量添加后样本值加样回收率(％ )血清1632. 23970.291762. 33109.97血清1632. 231940.572439. 9694. 84血清2675. 33970.291686. 47102. 48血清2675. 331940.572649. 46101. 28尿液161. 03970.29918. 5089. 06尿液161. 031940.571860.9392. 97尿液253. 97970.291067. 64104. 24尿液253. 971940.571912. 9595. 91表1加样回收实验(加样回收率=添加后样本值/(添加前样本值+添加量)*100， 浓度单位μ g/L) (4)精密度用两批试剂盒测试同一例血清样本，第一批批内变异系数为 1. 75%，第一批批内变异系数为2. 31% ；两批批间变异系数为2. 08%。
权利要求
一种人胱抑素C磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于结合了酶标记技术、磁微粒分离技术和化学发光检测技术，并生成了检测试剂盒。
2.根据权利要求1所述的酶标记技术，其特征在于生物酶标记胱抑素C抗体的方法如下所述的生物酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)，也可以是碱性磷酸酶(ALP)。偶 联方法可以是过碘酸钠氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交联等多种方法。
3.根据权利要求1所述的磁分离技术，其特征在于磁分离试剂的制备方法如下将FITC抗体连接在磁微粒表面。所述的磁微粒直径在0. 01-5. 0 μ m之间，具有超 顺磁性，表面含有氨基(NH2-)或羧基(C00H-)活性基团。所述的FITC抗体与磁微粒 可以通过化学交联剂，如戊 二醛、l-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共价键的形式，也可以通过物理吸附(静电作用、离子键或疏水 作用等)的形式进行偶联。
4.根据权利要求1所述的化学发光发光检测技术，其特征在于化学发光所用的底物 溶液可以是HRP催化的发光底物鲁米诺(Luminol)，也可以是ALP催化的发光底物AMPPD， CSPD 和 CSPD-Star 等。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中的质控品是选取经灭活的人血 清，将其混合后用稀释液按一定比例稀释而成。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中胱抑素C抗试剂包含偶联有生 物酶的胱抑素C抗体和偶联有FITC的胱抑素C抗体。
7.根据权利要求6所述的用于偶联FITC的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于检测步骤如下(1)加样与免疫反应在试管中加入5-100μ L处理好的样本、和质控品，然后加入 10-500 μ L胱抑素C抗试剂，混勻，37°C温育5-60分钟；(2)免疫复合物与磁微粒结合向试管中加入20-100μ L，0. l-10mg/mL磁分离试剂，混 勻，37°C温育0-30分钟(也可不温育)；(3)磁分离与洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去除上清；加入100-600μ L清洗液，去除 磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清；可再次加入洗 液清洗一次(也可省去)；(4)加底物溶液并读出样本浓度每管加入50-300μ L生物酶催化的发光底物，酶促底 物发光，根据样本的发光值从标准曲线上读出样本中胱抑素C含量。
全文摘要
本发明提供了人胱抑素C的体外检测方法，该方法采用了磁微粒分离化学发光免疫分析技术，它是酶标记技术、磁微粒分离技术和化学发光检测技术相结合的产物，兼具灵敏度高、特异性好、重复性好等特点。可用于人血清、血浆和尿液中胱抑素C含量的测定，临床上该指标多用于评价肾功能，主要用于监测肾小球滤过率、肾小管功能障碍和各类继发性肾病。
文档编号G01N33/535GK101937000SQ20101024589
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者仝文斌, 张雪莲, 郭健夫, 鲁衡 申请人:北京倍爱康生物技术有限公司