专利名称：同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法
同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法
技术领域：
本发明涉及本发明属于食品安全领域，涉及一种同时检测食品中13种氟喹诺酮 类药物和3种氯霉素类药物的方法和建立13种氟喹诺酮类药物和3种氯霉素类药物的液 质谱库的方法。
背景技术：
氟喹诺酮(fluoroquinolones)是第三代喹诺酮类药物，该类药物对细菌的DNA螺 旋酶(DNA-gyrase)具有选择性抑制作用，从而抑制细菌的DNA合成，导致DNA降解及死亡。 该类药物抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，抗菌作用是磺胺类的近千倍，可与第三代 头孢类抗生素相媲美。对水产鱼类的消化道及鳃细菌性疾病也有良好的防治作用，自八十 年代起成为治疗鱼类疾病的主要抗菌药物，由于长期使用氟喹诺酮抗生素易导致动物群体 体内致病菌产生耐药性，某些氟喹诺酮类化合物还可能有潜在的致癌作用，该类药物在动 物性食品中的残留问题已经成为人们关注的焦点。我国以及世界卫生组织、欧盟、美国、日 本等国家和组织都将氟喹诺酮类药物列入限制使用的兽药药物名单中，并制订出相关的最 高残留限量MRL。随着国际间的技术壁垒的逐年增高，氟喹诺酮药物的残留限量迅速降低， 水产品行业的风险正日益增加。在我国，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟哌酸、氧氟沙星 等氟喹诺酮类药物在蜂产品中的残留量不得超过10 μ g/kg;美国联邦法规关于鲶鱼中氟 喹诺酮的残留限量标准为5ppb，但阿拉巴马州和密西西比州作为美国鲶鱼加工的主要地 区，则规定鲶鱼中不得检出氟喹诺酮残留，即“零限量”标准。日本肯定列表规定，在蜂产品 中，恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星四种氟喹诺酮类药物的限量均为 2. 5μ g/kg ；欧盟规定，恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星四种氟喹诺酮类药物的限 量均为5μ g/kg ；美国和加拿大规定，氟喹诺酮类药物为养蜂业禁用药物，在蜂王浆中各种 氟喹诺酮类药物MRL为5μ g/kg。日本2006年5月29日开始实施“肯定列表制度”后，除有 暂定标准的物质如双氟沙星、恩诺沙星、噁喹酸等外，其余沙星类药物均按10 μ g/kg的“一 律标准”。06年广东省出口日本烤鳗恩诺沙星超标事件，07年美国、韩国对中国水产品氟喹 诺酮药物预警事件等都对我国水产品行业造成重大损失，水产品中氟喹诺酮药物的残留问 题已成为制约我国水产品生产和出口的一个重要因素。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是广谱抗生素，常用于预防与治疗动物疾病，在 水产品养殖业曾广泛使用。氯霉素存在毒副作用，能抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性 贫血、细胞减少性贫血、血小板减少和粒状白细胞减少。作为蛋白质合成抑制剂，会防碍红 细胞的产生[1]。氯霉素使用对人类健康潜在的危害已引起国际组织和世界上许多国家 和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”(Zero tolerance)，即不得检出。甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)、氟甲砜霉素(Florfenicol，FF) 与氯霉素同属于一类化合物。人们已知甲砜霉素、氟甲砜霉素的毒性很低，甲砜霉素作为氯 霉素的可行替代品用于食用动物已获得公认。氟甲砜霉素是最新合成的此类化合物，在治疗那些已对其他抗菌素产生抗药性的传染病时，氟甲砜霉素可作为氯霉素和甲砜霉素的一 种替代品。甲砜霉素的最大残留限量MRL(maximumrequired limits)值为50 μ g/kg，氟甲 砜霉素的MRL值为100-3000 μ g/kg。氯霉素的最低要求执行限MRPL(minimum required performance limit)值为 0.3yg/kgo目前氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物残留的测定方法可以概括地划分为微生物 抑制法、免疫分析技术、色谱分析技术和液相色谱-质谱联用技术等。微生物抑制法是一种 价格低廉、操作简便的初筛方法。但这种方法在较低限量水平时不够灵敏，且由于具备抑菌 作用的抗生素种类繁多，干扰因素较多，假阳性较高。免疫分析技术灵敏度较高、快速简便， 但存在交叉反应及假阳性问题。色谱分析技术最常见的有采用荧光检测的高效液相色谱 法，近年来，随着液相色谱_质谱联用技术的发展，这种技术灵敏度高、定性准确，可实现多 种物质的同时定量与确证，越来越广泛地应用在了氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物残留的 分析中。但该两类化合物需要分别检测，且缺乏谱库检索，本发明选择13种常见的氟喹诺 酮类药物和3种氯霉素类药物为研究对象，建立该两类药物的LC-MS/MS (液相色谱-质谱 联用)谱库，并利用谱库检索建立水产品中同时检测13种常见的氟喹诺酮类药物和3种氯 霉素类药物的快速LC-MS/MS (液相色谱-串联质谱)筛选方法，这对保障我国水产品进出 口安全具有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方 法，同时提供了建立氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的液质谱库的方法，其中氟喹诺酮类 药物为环丙沙星、单诺沙星、二氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘啶酸、诺氟沙星、 氧氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹，氯霉素类药物为氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜 霉素。本发明检测方法检测13种氟喹诺酮类药物的检测限为0. 5ppb，3种氯霉素类药物的 检测限为0. Ippb，回收率大于80%。上述目的通过以下技术方案实现一种同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法，其特征在于，所述 方法按如下步骤进行1)提取称取样品至离心管中，加入内标物溶液，再加入N，N-二甲基甲酰胺-乙 腈，经均质、水浴超声、12000r/min离心后，吸取上清液，在45 50°C氮气保护下浓缩，再加 入水，于涡旋振荡器振荡，得提取液；2)净化将所述提取液过HLB固相萃取小柱，先后以水、20%甲醇淋洗，弃去淋洗 液，抽干，用5%氨甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于瓶，50°C旋转蒸发至干，上述残渣加10%乙 腈溶解，于涡旋振荡器振荡，过滤膜，得净化液；3)将所述净化液进行液相色谱-串联质谱测定，液相色谱条件31) C18色谱柱，xdb-c8保护柱，柱温35°C，进样量10 μ L，流动相流速0. 3mL/min, 流动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；32)质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min ；气帘气氮气，流速20mL/min ；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700°C ；碰撞气氮气， 流速5mL/min ；电离电压5. 5kV ；监测方式多级反应监测；通过多级反应监测进行定量分 析；33)检测模式多级反应监测一自动信息关联扫描一增强离子扫描一谱库检索。一种建立氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的谱库的方法，其特征在于，所述方法 按如下步骤进行1)将氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物标准品进行液相色谱_串联质谱测定，液相色谱条件C18色谱柱，xdb-c8保护柱，柱温35°C，进样量10 μ L，流动相流速0. 3mL/min，流 动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min ； 气帘气氮气，流速20mL/min ；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700°C ；碰撞气氮气， 流速5mL/min ；电离电压5. 5kV ；监测方式多级反应监测；2)分别用高(30ev)、中(20ev)、低(IOev)三种碰撞能量对氟喹诺酮类药物和氯霉 素类药物标准品分别进行EPI扫描，分别得出二级质谱扫描图，从而建立谱库。本发明建立了 13种氟喹诺酮类药物和3种氯霉素类药物的液质谱库和LC-MS/MS 检测方法，该前处理简单，重复性好，结合本发明建立的液质谱库，能同时实现对13种氟喹 诺酮类药物和3种氯霉素类药物的快速定量定性分析，分析时间缩短了一倍，非常适合进 出口快速确证工作。
图1为本发明的检测方法的示意图；图2为恩诺沙星阳性可疑样品重构离子色谱图；图3为恩诺沙星阳性可疑样品EPI扫描图；图4为恩诺沙星阳性可疑样品谱库检索结果图；图5-20分别为环丙沙星、单诺沙星、二氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘 啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯 霉素的二级质谱扫描图； 图21为13种沙星类药物标准品MRM色谱图；图22为3种氯霉素标准品MRM色谱图；图23A和图23B为沙拉沙星两组重构离子色谱图；图24A和图24B为二氟沙星两组重构离子色谱图；图25A和图25B为氧氟沙星两组重构离子色谱图；图26A和图26B为单诺沙星两组重构离子色谱图；图27A和图27B为环丙沙星两组重构离子色谱图；图28A和图28B为氟甲喹重两组构离子色谱图；图29A和图29B为萘啶酸两组重构离子色谱图30A和图30B为氟甲砜霉素两组重构离子色谱图；图31A和图31B为甲砜霉素两组重构离子色谱图；图32A和图32B为氯霉素两组重构离子色谱图；图33A和图33B为麻保沙星两组重构离子色谱图；图34A和图34B为恩诺沙星两组重构离子色谱图；图35A和图35B为培氟沙星两组重构离子色谱图；图36A和图36B为诺氟沙星重构离子色谱图；图37A和图37B为恶喹酸两组重构离子色谱图；图38A和图38B为洛美沙星两组重构离子色谱图。
具体实施方式本发明检测方法主要是用来检测食物中的13种氟喹诺酮类药物和3种氯霉素类 药物，其中，13种氟喹诺酮类药物为环丙沙星、单诺沙星、二氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、麻 保沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹，3种氯霉素类药 物为氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素。在本说明书中，二级质谱扫描图都是EPI扫描图。[检测过程]参见图1本发明检测方法包括以下步骤1、样品处理提取准确称取5. Og样品(准确至0. Olg)至50mL离心管中，加入100 μ g/L的同 位素标记的氯霉素内标(ChloramphenicoI-D5)溶液和1000 μ g/L的同位素标记的环丙沙 星内标(Ciprofloxacin-D8)和1000 μ g/L的同位素标记的诺氟沙星内标(Norfloxacin-D5) 混合溶液各20yL，再加入25mL N，N-二甲基甲酰胺-乙腈(2+8，V/V)，均质30s，水浴超声 IOmin, 12000r/min高速离心5min ；吸取IOmL上清液，45 50°C氮气浓缩至1ml，加入5mL 水，于涡旋振荡器振荡30s，待净化。净化将上述提取液以约1 2mL/min的流速全部过Oasis HLB(6ml,200mg)固相 萃取小柱，先后以6mL水、6mL 20%甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，用6mL 5%氨甲醇溶液洗 脱，收集洗脱液于25mL鸡心瓶，50°C旋转蒸发至干，上述残渣加lmL10%乙腈溶解，于涡旋 振荡器振荡lmin，过0. 22 μ m滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。2、液相色谱条件仪器设备=Agilent 1200液相色谱色谱柱YMCC18 2. 1 X 150mm, 3 μ m ；保护柱zorbax xdb_c8 2. 1 X 12. 5mm ；流动相溶剂A是5mmol/L乙酸铵缓冲溶液，溶剂B是纯乙腈；梯度洗脱在O至5min内，溶剂A体积分数从95 %线性减少到55 %，溶剂B体积分 数相应地从5%线性升到55% ；然后保持8min，在13. Imin时溶剂A的体积分数改至95% 和溶剂B体积分数相应地改至5%，并平衡7min ；流动相流速0·3mL/min ；柱温35°C ；柱温是指柱温箱的温度，色谱柱和保护柱在柱温箱里。进样量10μ L。
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3、质谱条件仪器设备API4000QTrap扫描方式正负扫描方式监测方式多级反应监测；离子源(Ion Source)电喷雾离子源(Electron spray Ionization ESI)；雾化气氮气，流速65mL/min ；气帘气氮气，流速20mL/min ；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700°C ；碰撞气氮气，流速5mL/min ；电离电压5.5kV;16种物质的MRM具体参数包括去簇电压(declustering potential,DP)、碰撞能 (collision energy, CE)见表一。表一氟喹诺酮类药物、氯霉素类药物的质谱参数
权利要求
一种同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行1)提取称取样品至离心管中，加入内标物溶液，再加入N，N 二甲基甲酰胺 乙腈，经均质、水浴超声、12000r/min离心后，吸取上清液，在45～50℃氮气保护下浓缩，再加入水，于涡旋振荡器振荡，得提取液；2)净化将所述提取液过HLB固相萃取小柱，先后以水、20％甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，用5％氨甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于瓶，50℃旋转蒸发至干，上述残渣加10％乙腈溶解，于涡旋振荡器振荡，过滤膜，得净化液；3)将所述净化液进行液相色谱 串联质谱测定，31)液相色谱条件C18色谱柱，xdb c8保护柱，柱温35℃，进样量10μL，流动相流速0.3mL/min，流动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；32)质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min；气帘气氮气，流速20mL/min；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700℃；碰撞气氮气，流速5mL/min；电离电压5.5kV；监测方式多级反应监测；33)检测模式多级反应监测→自动信息关联扫描→增强离子扫描→谱库检索。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中的内标物溶液具体为 100 μ g/L的同位素标记的氯霉素内标Chloramphen Icol-D5溶液和1000 μ g/L的同位 素标记的环丙沙星内标CiprofloxaCin-D8和1000 μ g/L的同位素标记的诺氟沙星内标 Norfloxacin-D5 混合溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中的线性梯度流动相洗脱具 体为在O至5min内，乙酸铵缓冲溶液体积分数从95%线性减少到55%，纯乙腈体积分数 相应地从5%线性升到55% ；然后保持8min，在13. Imin时乙酸铵缓冲溶液的体积分数改 至95%和纯乙腈体积分数相应地改至5%，并平衡7min。
4.一种建立氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的液质谱库的方法，其特征在于，所述方 法按如下步骤进行1)将氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物标准品进行液相色谱-串联质谱测定，液相色谱条件C18色谱柱，xdb-c8保护柱，柱温35°C，进样量10 μ L，流动相流速0. 3mL/min,流动相 乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min ；气帘 气氮气，流速20mL/min ；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700°C ；碰撞气氮气，流速 5mL/min ；电离电压5. 5kV ；监测方式多级反应监测；2)分别用30eV、20eV、IOev三种碰撞能量对氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物标准品分 别进行EPI扫描，分别得出二级质谱扫描图，从而建立液质谱库。
全文摘要
本发明建立了13种沙星类药物和3种氯霉素类药物的液质谱库和LC-MS/MS检测方法，该前处理简单，重复性好，结合本发明建立的液质的谱库，能同时实现对13种氟喹诺酮类药物类药物和3种氯霉素类药物的快速定量定性分析，分析时间缩短了一倍，非常适合进出口快速确证工作。
文档编号G01N30/06GK101957348SQ20101028518
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者冯家望, 周新朋, 彭玉芬, 梁玉英, 蔡勤仁, 蔡杰, 薛良辰, 钱振杰 申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局