专利名称：快速检测滴滴涕及其代谢物的酶联免疫试剂盒及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机氯农药滴滴涕(1,1, l-trichloro-2,2-bis-p-chlorophenyl-ethane, DDT)及代谢物的检测技术，特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗有机氯农药滴滴涕 DDT及其代谢物的单克隆抗体，并涉及利用单克隆抗体与DDT及其代谢物抗原结合，而分析检测环境样品中的DDT及代谢物含量的快速方便检测试剂盒的制法。
背景技术：
DDT(1,1,l-trichloro-2,2-bis-p-chlorophenyl-ethane ；1,1,1- H 氯 _2， 2_双-ρ-氯苯基_乙烷)作为广谱杀虫剂曾经在20世纪50年代被大量使用。这一类含氯原子的有机合成杀虫剂，具有极高的脂溶性和稳定性，可在生物体内富集很高的浓度，在环境中降解缓慢，属于持久性有机污染物。DDT在沉积物中的两种主要分解物是2，2-双 (4-氯苯基)-1，1_ 二氯乙烯(DDE)和2,2-M (4-氯苯基)_1，1-二氯乙烷(DDD) ；DDT在动物组织内可以缓慢降解为2，2_双(4-氯苯基)乙酸(DDA)。DDA本身并不积累，而是作为人或动物与DDT暴露接触的指标，已报道尿液中DDA的含量可以用作人或其他哺乳动物暴露接触DDT的灵敏指标。DDT及其代谢产物DDD、DDE等属于环境内分泌干扰物质，损害动物的神经和生殖系统，长期暴露对肝脏有损害，因此70年代已被发达国家禁止使用，但由于其价格低廉、杀灭蚊虫效果显著，至今在一些发展中国家，包括我国的个别地区仍在使用；DDT的羟基同系物三氯杀螨醇(Dicofol)作为农业杀虫剂尚未被禁用，它含有不低于 5%的DDT ；因此在食品、环境样品中甚至南北极仍能检出DDT和它的代谢物。目前有机氯农药滴滴涕(DDT)及其代谢物的常规分析方法主要有气相色谱结合质谱或电子捕获检测器方法(GC/MS、GC/FLD)，该方法不仅需要昂贵的仪器设备和专业的分析人员，而且样品的前处理过程繁琐复杂，不易满足大批量样品的检测分析需要，也不适用于现场分析。近年来得到快速发展的免疫分析技术，以其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速和分析成本低的优点被广泛应用于各种有机污染物的分析。免疫化学方法是通过免疫动物等手段制得特异性抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)，利用抗体和待检测抗原的结合反应，建立免疫分析方法，用于DDT及其代谢物的分析检测，该方法简便、快速，可同时分析大批量样品。建立有机氯农药滴滴涕代谢物的快速检测技术和产品，对了解有机氯农药滴滴涕的残留，特别是对于保障食品安全具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述DDT及其代谢物检测技术的不足，提供一种特异、敏感和简便的快速检测DDT及代谢物DDA、DDD、DDE (简称DDTs)的试剂盒；本技术发明提供一种抗DDTs的单克隆抗体的制备，并利用抗DDTs单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析DDT 及代谢物DDA、DDD、DDE的试剂盒，简单易操作，适于现场、快速、大批量样品的分析检测。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种快速检测有机氯农药DDT及代谢物的快速酶联免疫试剂盒，包括使用水溶性碳二亚胺联接法，按一定反应比例将2，2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)偶联 到牛血清蛋白BSA上，经透析提纯偶联物，用120μ 1加佐剂充分乳化，腹腔注射免疫BALB/C鼠，加强免疫数次后，取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，阳性检测、克隆筛选、扩大培养及诱生腹水制得DDTs的单克隆抗体；用合成的BSA-卵清蛋白(BSA-OVA)包被96孔酶标板，加入DDT及代谢物DDA、DDD、DDE标准品或样品，再加入稀释的单克隆抗体Mab-DDTs，包被抗原中的DDA与自由的DDTs竞争抗体Mab-DDTs，自由的DDTs和抗体复合物被洗去，与包被抗原DDA结合的抗体DDA-Mab-DDTs再与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，经底物显色，终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，样品中自由的DDTs含量越少，对照标准品回归的方程或曲线，计算样品中DDTs的含量。本技术发明的有益效果是利用制得的含特异性抗DDT、DDD、DDE、DDA的单克隆抗体，所研制的酶联免疫检测试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒对DDA的检出限小于 7. 5ng/ml。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点本发明的检测有机氯农药滴滴涕和代谢物的酶联免疫检测试剂盒，具有特异性强，检测灵敏度高(可达7. 5ng/ml)，检测快速， 前处理简单，检测成本低，操作简单易掌握等优点。DDTs的酶联免疫检测试剂盒，包括已包被有包被抗原的可拆96孔酶标板(8 孔X 12条)、洗液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、底物溶液、抗DDTs的单克隆抗体； 96孔可拆酶标板板条上预先包被有合成的包被抗原(DDA半抗原与蛋白偶联物)。所述抗DDTs的单克隆抗体为用2，2-双(4_氯苯基)乙酸-牛血清蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗DDTs的单克隆抗体的杂交瘤细胞系分泌的。所述试剂盒为检测DDT及其代谢物的试剂盒。所述快速检测DDT和代谢物的酶联免疫试剂盒的制法，其步骤包括1、将2，2_双(4-氯苯基)乙酸(DDA)与载体蛋白偶联，制备得到2，2_双(4_氯苯基)乙酸-载体蛋白偶联物；2、用DDA-牛血清蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到分泌抗DDT、 DDD, DDE, DDA的单克隆抗体的杂交瘤细胞系；3、制备抗DDTs的单克隆抗体；4、将步骤1制得的2，2-双(4-氯苯基)乙酸DDA与卵清蛋白偶联的抗原包被在 96孔酶标板上；5、将抗DDTs单克隆抗体、待测样品及标准品加入步骤4制得的孔中反应；6、再加入酶标二抗、底物及终止液，得到检测有机氯农药DDT及代谢物DDD、DDE、 DDA的酶联免疫试剂盒。所述快速检测有机氯农药DDT及代谢物DDD、DDE、DDA的酶联免疫试剂盒在检测有机氯农药DDT及代谢物DDD、DDE、DDA中的应用。本发明借助酶标记的二抗标记显色的抗体抗原免疫反应，用以制备快速检测有机氯农药DDT及代谢物DDD、DDE、DDA的竞争抑制酶联免疫试剂盒，结构更加合理，应用合成的半抗原与牛血清蛋白偶联物免疫小鼠，经细胞融合制备抗DDTs单克隆抗体，选用2，2-双 (4-氯苯基)乙酸DDA与卵清蛋白偶联的抗原作为包被抗原，利用抗体与包被抗原、以及样品或标准品中的自由半抗原的竞争反应，建立竞争抑制酶联免疫技术快速检测待测样品中是否含有DDT、DDD、DDE、DDA。通过待检样品中的DDT和代谢物半抗原与包被在96孔酶标板上的DDA半抗原共同竞争抗DDTs单克隆抗体，经酶标二抗及底物的显色反应后，出现深浅不同的蓝色，加入终止液后变为深浅不同的黄色。若待测样品颜色极浅或无色，则判断为强阳性样品，即待测样品中DDTs浓度很高；若待测样品颜色极深(深黄色)与空白对照接近，则判断为阴性样品，即待测样品中DDTs的浓度小于7. 5ng/mL ；各孔颜色经酶标仪测定吸光度值，与标准品浓度和吸光度值绘制的曲线对照，可定量计算样品中的DDTs含量。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点本发明的检测有机氯农药滴滴涕及代谢物的酶联免疫试剂盒，具有特异性强，检测灵敏度高(可达7. 5ng/mL)，检测快速(同时检测96个样本只需2h)，前处理简单，检测成本低，操作简单易掌握等优点。
具体实施例方式实施例1 (制备实施例)检测有机氯农药DDT和代谢物的竞争抑制酶联免疫试剂盒制备方法1、2，2_双(4-氯苯基)乙酸-载体蛋白偶联物的制备将2，2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)溶于少量二甲亚砜中，加入水溶性碳化二亚胺 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，25°C反应1. 5小时后，加入溶于磷酸盐缓冲液(pH7. 0)的牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)，25°C反应3小时。将反应混合物移入透析袋中透析 3d，40C，每12h换液1次。透析物分装后，-20°C保存。制备得到DDA-BSA和DDA-OVA偶联物备用。2、抗DDTs单克隆抗体的制备利用制备的2，2_双(4-氯苯基)乙酸-牛血清蛋白偶联物(DDA-BSA)作为免疫原，免疫6 8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用120 μ g DDA-BSA与等体积完全弗氏佐剂，充分乳化后，腹腔注射小鼠，第3、5周取同量DDA-BSA与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化，腹腔注射。取尾血测定小鼠血清效价，待效价大于要求值后，用同量DDA-BSA的PBS 溶液腹腔注射进行加强免疫，三天后取脾细胞融合。取生长状态良好的骨髓瘤SP2/0细胞与免疫的小鼠脾细胞按1 8的比例混合， 加入PEG进行细胞融合。融合后接种于96孔细胞培养板中，在20%血清的HAT培养基中选择培养，7天后换HT培养液，取细胞培养液上清ELISA检测。选取阳性细胞孔，用有限稀释法克隆，筛选可稳定分泌抗DDTs单克隆抗体的杂交瘤细胞株。取8周龄健康BALB/c雌性小鼠或杂交一代鼠，腹腔注射液体石蜡0. 5mL/每只，待用。1500r/min离心收集对数生长期的阳性杂交瘤细胞，悬浮于生理盐水中，浓度为106/mL。在石蜡油处理的小鼠腹腔内注射 0. 5mL杂交瘤细胞悬液诱生腹水，收集腹水，3000r/min离心lOmin，收集上清液即为含单克隆抗体腹水。腹水用辛酸硫酸氨方法得到粗制抗体蛋白，再用0.01M的PBS缓冲液(pH7. 4) 透析3天。3、检测DDT和代谢物的酶联免疫试剂盒组装及制备用步骤1中合成的DDA-OVA偶联物按一定比例用碳酸盐缓冲液(pH = 9. 6)稀释后包被96孔酶标板，过夜后，用的聚乙烯醇封闭后，4°C保存待用；同时将DDTs标准品 (已知浓度)、洗液、底物溶液和终止液分装于小瓶中，组装的试剂盒保存在4°C至少3个月。实施例2 (应用实施例)检测有机氯农药滴滴涕和代谢物的竞争抑制酶联免疫试剂盒的使用方法
1、贝类样品处理称取贝类勻浆5g，加5ml (丙酮/正己烷=1/1)，搅勻，超声萃取10min，3000r/ min离心IOmin ；勻浆固体再加5ml (丙酮/正己烷=1/1)超声萃取lOmin，3000r/min离心 IOmin ；2次上清合并，减压蒸干，用PBS (pH = 7. 4)定容至1ml。取上清液进行分析。2、检测将DDA-OVA偶联物作为包被抗原，用碳酸盐缓冲液(pH 9. 6)稀释后加入96孔酶标版(ΙΟΟμ ν孔)，湿盒中4°C过夜；弃去残液，经洗液(PBS-Tween20)清洗3次，拍干后， 每孔加入含有PVA的PBS溶液300μ L于37°C下孵育封闭3h，封闭完后置于4°C冰箱中备用(可保存至少3个月)。测定时，弃去封闭液，洗板3次，拍干，加入50 μ L系列稀释的DDTs标准物质溶液或贝类样品萃取液，再加入50 μ L适当稀释的特异性抗DDTs单克隆抗体，振摇混勻，37°C孵育Ih ；洗板、拍干，加入适当稀释的HRP标记的羊抗兔第二抗体，每孔100 μ L，37°C孵育40min ；洗板、拍干，每孔加底物溶液100 μ L，37°C显色13min,以2mol/ L H2SO4中止反应(50 μ L/每孔)，450nm波长测量吸光度值(OD)。以DDTs标准品的浓度对吸光度值绘制标准曲线，样品的吸光度值与标准孔和空白对照孔的吸光度值比较得出DDTs 的含量。实施例3 (应用实施例)检测有机氯农药DDT和代谢物的间接竞争酶联免疫技术的应用1、DDTs特异性抗体效价及最适工作浓度实验免疫开始后，于第3、5周分别取免疫鼠尾血，采用直接ELISA方法测定血清滴度 (效价)。免疫4次后，效价可达6. O万以上。细胞融合后制得的单克隆抗体腹水效价达 25. 8万以上。经方阵滴定试验，在直接ELISA法中，根据不同倍数稀释的单抗上清吸光度值，取吸光度值1.5 1.7范围，得出包被抗原的最适稀释比为1 400;羊抗兔酶标二抗的最适稀释比为1 20000，通过直接ELISA方法测定含单抗上清最适稀释比为1 100， 工作稀释比为1 80。2、回收率试验 向样品中分别添加DDT、DDD、DDA标准，使其最终提取后的浓度为1. Ong/μ 1, 5. Ong/ μ 1，每个浓度做3个平行测定，用建立的DDTs间接竞争酶联免疫方法进行3种加标物的含量测定，与添加的标准物量比较，计算得到回收率。在1000 5000ng/ml浓度范围内，DDT、DDD、DDA的回收率在70% 135%之间。可以满足定量分析检测方法的要求。
权利要求
1.一种分泌特异性单克隆抗体的融合细胞株。
2.一种专门识别有机氯农药滴滴涕及其代谢物的单克隆抗体，它是由权利要求1所述的细胞株产生的。
3.含权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是检测有机氯农药滴滴涕和代谢物的试剂盒。
4.一种快速检测有机氯农药滴滴涕和代谢物的酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆板条、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，其特征是在96孔酶标板可拆板条上已包被有合成的蛋白偶联物的包被抗原。
5.权利要求4所述的一种快速检测有机氯农药滴滴涕和代谢物的间接竞争酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其步骤包括(1)将2，2_双(4-氯苯基)乙酸(DDA)与载体蛋白偶联，制备得到DDA-载体蛋白偶联物；(2)用2，2_双(4-氯苯基)乙酸DDA-牛血清蛋白偶联物免疫BALB/C鼠，经细胞融合、 筛选得到抗有机氯农药滴滴涕DDT和代谢物DDD、DDE、DDA(DDTs)单克隆抗体；(3)将2，2_双(4-氯苯基)乙酸DDA-卵清蛋白偶联物，包被在96孔酶标板上，封闭液封闭；(4)将生物样品萃取液、空白缓冲液或DDTs标准液加入到(3)制得的孔中，再加入(2) 制得的含特异性单克隆抗体腹水；(5)经孵育反应、酶标二抗标记、底物显色反应及终止方应，得到所述的检测有机氯农药滴滴涕DDT和代谢物DDD、DDE、DDA (DDTs)的酶联免疫试剂盒。
6.权利要求3-4任一项所述的试剂盒在检测有机氯农药滴滴涕DDT和代谢物DDD、 DDE、DDA (DDTs)中的应用。
全文摘要
本发明涉及检测有机氯农药滴滴涕(1，1，1-trichloro-2，2-bis-p-chlorophenyl-ethane，DDT)及代谢物的检测技术，特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗有机氯农药滴滴涕及代谢物的单克隆抗体，并涉及利用单克隆抗体与滴滴涕及代谢物抗原结合，而分析其在生物样品中含量的快速检测试剂盒的制法。一种快速检测有机氯农药滴滴涕DDT及代谢物DDD、DDE、DDA(DDTs)的酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆板条、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，制得的特异性抗DDTs单克隆抗体，在96孔酶标板上包被有合成的蛋白偶联物的包被抗原。本发明试剂盒具有前处理简单、易操作，适于现场、快速、大批量样品的检测等优点，试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒对DDA检出限小于7.5ng/ml。
文档编号G01N33/577GK102409027SQ201010291388
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者刘仁沿, 刘磊, 梁玉波, 许道艳 申请人:国家海洋环境监测中心