专利名称：一种分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法
技术领域：
本发明涉及到分析化学领域，特别涉及到分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法。
背景技术：
柱前衍生化是提高检测灵敏度的方法，大多数无紫外吸收或紫外吸收较弱的化合 物，采用合适的衍生化方法，可以进行包括含量和对映异构体的准确测定。乙酰半胱氨酸是一种氨基酸类药物，是一种去痰药。其化学名为N-乙酰基-L-半 胱氨酸，分子式为C5H9NO3S,其对映异构体的化学名为N-乙酰基-D-半胱氨酸。现有的技术 中无乙酰半胱氨酸异构体测定的相关报道，只有文献HPLC Separation of DL-Amino Acide Derivatized with N2-(5-Fluoro-2,4-Dinitrophenyl)-LAmino Acid AmidesCJournal of Chromatography B 674 (1995) 143-148)及中国专利 200510057381. 8 的方法有报道其他 产品的异构体测定方法。乙酰半胱氨酸为末端吸收，且吸收不强，乙酰半胱氨酸的对映异构体为乙酰半胱 氨酸的杂质，是乙酰半胱氨酸质量控制的重要指标。如果用手性色谱柱分离异构体杂质， 一方面流动相的种类受到很大限制，正相条件几乎不可用；另外，检测灵敏度也不易达到要 求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用在乙酰半胱氨酸用衍生化试剂进行柱前衍生化， 乙酰半胱氨酸在被衍生化的同时，其对映异构体也被衍生化，从而实现采用一般色谱柱进 行乙酰半胱氨酸及其对映异构体(杂质)分离测定的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为
一种分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法，采用乙酰半胱氨酸在进柱前用衍生化 试剂进行衍生化，其衍生化试剂为Na- (5-氟-2，4- 二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物，述所 的衍生化试剂Na - (5-氟-2，4- 二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物包括Na - (5-氟-2，4- 二 硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Na-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Na-(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Na-(5-氟-2，4- 二硝基苯基)-L-缬胺酰胺，乙酰半胱氨 酸与衍生化试剂的摩尔比为1:1. 5 -1:50 ；分离测定所用方法为高效液相色谱法或高效 液相色谱法与质谱法联合使用，其使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱 柱，且色谱柱的检测波长为200-380nm，最佳检测波长为333士3nm ；所述的分离测定乙酰半 胱氨酸对映异构体的方法中，在分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的条件中，流动相是乙 酸铵溶液_乙腈体系，乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B，其中乙酸铵溶液的浓度为 0. 01-0. 05mol/L,并用氨水或磷酸调节pH值至5. 0-8. 0，乙酸铵溶液与乙腈按下列异构体 测定流动相梯度洗脱表进行洗脱 异构体测定流动相梯度洗脱表
权利要求
一种分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法，其特征在于乙酰半胱氨酸在进柱前用衍生化试剂进行衍生化，其衍生化试剂为Nα (5 氟 2，4 二硝基苯基) L 氨基酸类化合物，述所的衍生化试剂Nα (5 氟 2，4 二硝基苯基) L 氨基酸类化合物为Nα (5 氟 2，4 二硝基苯基) L 丙胺酰胺、Nα (5 氟 2，4 二硝基苯基) L 苯丙胺酰胺、Nα (5 氟 2，4 二硝基苯基) L 脯胺酰胺或Nα (5 氟 2，4 二硝基苯基) L 缬胺酰胺，乙酰半胱氨酸与衍生化试剂的摩尔比为1:1.5～1:50；分离测定所用方法为高效液相色谱法或高效液相色谱法与质谱法联合使用，其使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱，且色谱柱的检测波长为200 380nm，最佳检测波长为333±3nm；在分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的条件中，流动相是乙酸铵溶液 乙腈体系，乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B，其中乙酸铵溶液的浓度为0.01 0.05mol/L，并用氨水或磷酸调节pH值至5.0 8.0，乙酸铵溶液与乙腈按下列异构体测定流动相梯度洗脱表进行洗脱 异构体测定流动相梯度洗脱表时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)08020188020195050255050268020368020其中18分钟后为冲洗色谱柱及平衡色谱柱，流动相A、B的百分比为体积百分比。
2.根据权利要求1所述的分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法，其特征在于所 述的分离测定方法按下列步骤进行(1)、取乙酰半胱氨酸或含乙酰半胱氨酸的制剂，用稀酸溶液溶解，用碱溶液将PH值 调至6. 0-8. 0，加水摇勻，配制成含乙酰半胱氨酸4. 1-16. 4mg/L的溶液，作为供试品样品 溶液，其中稀酸溶液为无机酸如稀盐酸、稀硫酸、稀磷酸溶液，也可为有机酸如甲酸、乙酸溶 液，所述的碱溶液为无机碱溶液如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液；(2)、取乙酰半胱氨酸溶液与111101/1碳酸盐溶液混合，加入『-(5-氟-2，4-二硝基苯 基)-L-氨基酸类化合物混勻，其中碳酸盐溶液为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾或碳酸钠溶 液，或者是它们按任意比例混合后所得到的组合物；(3)、将步骤(2)所得的溶液于40-60C。避光反应30-50分钟，反应完毕后，加入 l-5mol/L的盐酸溶液10-30 μ 1，其最佳条件为加入2mol/L的盐酸溶液10 μ 1 ；(4)、取步骤(3)所得的溶液，在预置五氧化二磷与氢氧化钾的干燥系统中，干燥至溶液 中溶剂充分挥发尽后，加PH为7. 0的磷酸盐缓冲溶液-乙腈1ml，其中磷酸盐缓冲溶液与乙 腈的比例为1:1，超声处理使残渣溶解，过滤，滤液作为供试品溶液；(5)、用高效液相色谱法或高效液相色谱法-质谱法分离测定步骤(4)所制得的供试品 溶液。
全文摘要
本发明提供了一种分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法。该方法在乙酰半胱氨酸在进柱前用衍生化试剂进行衍生化，其衍生化试剂为Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物。分离测定所用方法为高效液相色谱法或高效液相色谱法与质谱法联合使用，使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱。分离测定方法按下列步骤进行(1)取乙酰半胱氨酸或含乙酰半胱氨酸的制剂，用稀酸溶液溶解，用碱溶液将pH值调至6.0-8.0，作为供试品样品溶液；(2)取乙酰半胱氨酸溶液与1mol/L碳酸盐溶液混合，加入Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物混匀；(3)将步骤(2)所得的溶液于40-60C°避光反应，反应完毕后，加入盐酸溶液；(4)取步骤(3)所得的溶液，在预置五氧化二磷与氢氧化钾的干燥系统中，加磷酸盐缓冲溶液-乙腈，超声处理使残渣溶解，过滤，滤液作为供试品溶液；(5)用高效液相色谱法或高效液相色谱法-质谱法分离测定步骤(4)所制得的供试品溶液。
文档编号G01N30/14GK101968470SQ20101029784
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者吕启超, 杨娟, 王先兵, 程文莹, 郭刚 申请人:湖北新生源生物工程股份有限公司