专利名称：基于抗重组ul51蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物医学领域中鸭瘟病毒抗原的检测检测，特别涉及基于抗重组 UL51蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法和应用。
背景技术：
鸭瘟(Duckplague，DP),又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是
鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出 血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也 有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV), DPV是一种泛嗜性全身
性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已 报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间 接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和 试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微 量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和 光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4 5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设 备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生 的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成 分，而导致许多假阳性结果出现。胶体金(ICS)法是20世纪80年代发展起来的一种将胶体金免疫技术和色谱层析 技术相结合的固相膜免疫分析方法，它是在免疫胶体金渗滤法基础上发展而来的。近年 来已在生物医学各领域得到了日益广泛的应用，如寄生虫病、病毒病、细菌病和药物残 留等的检测。该方法操作简单、特异性强，并可在15min内很直观地判断出待测物的有 无，大大提高了检测的速度。ICS法现已成为当今最快速、敏感的免疫学检测技术之一， 特别适合于广大基层兽医人员以及大批量检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的 发展潜力和应用前景。随着分子生物学的飞速发展，对蛋白功能的研究日趋增强，特别 是对有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病毒抗血 清的ELISA方法和胶体金免疫层析法已被大量报道，同时也有以表达的重组蛋白制备的 抗体检测病毒抗原的报道。但是，基于重组UL51蛋白的抗体检测鸭瘟病毒抗原的ICS法 尚未见报到，重组UL51蛋白的抗体是否与DPV发生强烈的免疫反应尚需证实。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种胶体金试纸，该试纸是基于抗重组 UL51蛋白抗体标记并严格控制金标垫上免疫胶体金与硝基纤维膜上抗体的标记浓度的基 础上制备而成，其特异性和灵敏性高。
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为实现上述目的，本发明的技术方案为基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标 垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度 大于或等于lmg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，对照线由浓度大于或等 于lmg/mL C抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记浓度大于或等于2mg/mL的B 抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成；所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG为免疫学研究 中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B抗重组UL51 蛋白抗体IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗 体IgG，所述C抗B IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A和B外的任一种动物抗B IgG。进一步，所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG中的A为鼠抗重组UL51蛋白抗体 IgG,所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG 为羊抗兔IgG;进一步，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于lmg/mL的A抗重组UL51蛋白 抗体IgG包被而成，对照线由浓度等于lmg/mL C抗B IgG包被而成；所述金标垫包由胶 体金标记浓度等于2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成；本发明的目的之二在于提供所述胶体金试纸的制备方法，该方法简单实用。为实现上述目的，本发明的技术方案为上述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸的制作方法，具体步骤为a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制将浓度大于或等于lmg/mL的A抗重组 UL51蛋白抗体IgG喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度大于或等于lmg/mLC抗B IgG喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；b金标垫的制备将玻璃纤维素膜浸于胶体金标记浓度大于或等于2mg/mL的B 抗重组UL51蛋白抗体IgG中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位 点，干燥后得金标垫；C胶体金免疫层析试纸条的组装分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫 依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫 端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存。进一步，所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线 距硝基纤维膜的边距分别为0.9厘米。本发明的目的之三在于提供所述胶体金试纸的运用，所述运用能够保证在灵敏 性和特异性较高的情况下快速检测鸭瘟病毒抗原。为实现上述目的，本发明的技术方案为胶体金试纸在制备鸭瘟病毒抗原检测试纸中的应用。本发明的有益效果在于本胶体金试纸敏感性高，可检测到最低含量为 0.125 μ g的DPV病毒蛋白；运用该试纸对含DPV的DEF培养液、含DHV的鸭胚尿囊 液、含RA的菌体培养液和含E.coli菌体培养液，结果显示仅含DPV的DEF培养液可见 两条清晰的红色条带，其它样品液均仅在C线处出现一条清晰的红色条带，表明此方法 具有良好的特异性；另外，运用本试纸检测鸭瘟病毒具有良好的批内及批间重复性；本方法制备的试纸至少可在4°C或25°C保存半年，本运用首次将抗重组UL51蛋白抗体IgG 制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作 进一步的详细描述，其中图I-A为DPV UL51基因的PCR扩增M指DL2000相对分子质量标准，1指 以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物，2指以DPV CHv毒株基因组DNA为 模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp);图I-B为重组质粒 PMD18-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18_UL51用 EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图 I-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III，1指重组 表达载体pET28a_UL51，2指重组表达载体pET28a_UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到 的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准，
1为阴性对照(未加IPTG诱导)，2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为 34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果1_7的IPTG浓度分别为O、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2mmol/L ；图 2-C 为不同温度诱导pET28a_UL51 表达结果 1-3的温度分别为20、30和37°C;图2_D为不同时间诱导pET28a_UL51表达结果1_7 的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。图3-A为重组UL51蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析M为蛋白质分子量，1为 IPTG诱导的Iml菌液，2为粗提的UL51蛋白包涵体，3为50mM咪唑洗脱峰(不含纯化 的重组UL51蛋白)；4为300mM咪唑洗脱峰(含有纯化的重组UL51蛋白)；图3_B为 纯化的抗重组UL51蛋白抗体IgG的SDS-PAGE分析M指标准蛋白质分子量，1指过柱 纯化的兔抗UL51蛋白抗体IgG，2为过柱纯化鼠抗UL51蛋白抗体IgG。图4为琼脂糖凝胶扩散试验检测兔抗重组UL51蛋白高免血清效价测定。图5为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图；图6为基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的敏感性检测结果。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。本实施例中，试纸是基于抗重组UL51蛋白抗体标记并严格 控制金标垫上免疫胶体金与硝基纤维膜上抗体的标记浓度的基础上制备而成，所述重组 UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化表达菌并发酵培养，收集 到了大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀，再通过超声波破碎菌体、重组UL51蛋白包 涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；用所述重组UL51蛋白对兔和鼠进行常规免疫程序 和纯化，获得兔抗重组UL51蛋白抗体IgG和鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG ；进一步确定 了兔抗重组UL51蛋白抗体IgG和鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG的最佳浓度范围及酶标抗 体最适浓度，最终得到特异性和灵敏性高的检测试纸。
实施例基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法和应用一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及UL51蛋白的纯化1材料准备1.1菌株、质粒和毒株质粒pMD18_T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)， Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli BL21 (DE3)禾Π DPV CHv 强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。1.2试验动物10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；健康雄性白兔4只，体重2_3kg/ 只，购自雅安某兔场；健康Vista大鼠20只，购自四川大学。2实验方法2.1DPVUL51 基因的克隆2.1.1引物设计禾Ij用Primer Premier5.0软件，参考UL51基因序列(GenBank登录号 DQ072725),由宝生物生物技术有限公司合成。弓I物DPV-UL51F 5，-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3，(划线 部分为 EcoRI 位点)；引物 DPV-UL51R: 5，-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’(划线部分为XhoI位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmOl/ L，-20°C保存备用。2.1.2DPV基因组DNA的提取a正常鸭胚成纤维细胞(DEF)的制作方法取IOd日龄健康鸭胚，分别用5%碘 酒和75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去 头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成Imm大小的小块，力Π PBS适量，之后置于三 角瓶内，加细胞分散剂(2.5%胰蛋白酶)150μ1/胚，于37°C水浴中消化3min。立即将细 胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布 过滤，向滤液中加入10%小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于IOOmL细胞培养瓶中， 7mL/瓶，水平静置于37°C细胞培养箱中进行培养。b DPV增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细 胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附120min后弃 病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37°C培养。 同时做未接毒的DEF对照。c DNA提取方法直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下 (1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60% 70%的DEF (IOOmL细胞瓶)；同 时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500 μ L的细胞裂解液， 同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为ZOOyg/mL，轻轻混勻后，37°C孵育IOmin ； (3) 将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500 μ L的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物， 倒入离心管中；(4)用饱和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加 1/10倍体积3mol/LNaAC，混勻后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min离心20min，沉淀用预冷的70 %乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入IyLRNA酶，37°C作用30min，_20°C保存备用2.1.3PCR 扩增 DPV UL51 基因PCR反应体系为
2 χ 傻瓜 PCR Mixtrue DPV基因组DNA Pl(20pmol/pL) P2 ( 20pmol / μι) 超纯水 Total volume
\2.5μΙ
Ι.Ομ
Ι.Ομ
Ι.Ομ
9.5μL
25μL /Sample轻轻混勻，2000r/min瞬时离心后进行PCR。反应参数95 °C预变性5min，95 "C变性lmin，56 °C退火lmin，72 "C延伸 Imin,循环40次，最后72°C延伸lOmin，于4°C保存备用。取4 μ L PCR产物在1 %琼 脂糖凝胶上电泳，设DL2000和空白对照，观察扩增片段的长度。2.1.4UL51基因PCR产物的回收按北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA 贮存于-20°C保存备用。2.1.5纯化的UL51基因与pMD18_T的连接连接反应体系如下
PCR 产物4.5μ
pMD18-T0.5μ 2xDNA 连接酶 Mixtrue5.0|iL
超纯水补足至IOpL将上述试剂加入0.2mL的EP管中，小心混勻，瞬时离心后，于16°C连接过夜。2.1.6DH5a感受态细胞的制备采用氯化钙法制备新鲜的DH5a株大肠杆菌感受态细胞，简述如下(1)无菌挑 取平板上新鲜培养的DH5a单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37°C振荡培养过夜； (2)取ImL上述培养液接种于IOOmL LB培养液中，37°C 200r/min振荡培养2.5 3h， 使OD_ = 0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴IOmin ； (4)于4°C 4000r/min离心8min，弃上清；(5)加IOmL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2,温和 悬起细菌沉淀，冰浴30min; (6)于4°C 4000r/min离心8min，弃上清，力MmL冰预冷的 0.1mol/L的CaCl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15%的灭菌甘油，混勻后分装为200 μ L/ 管，直接用于转化或置于-70°C冰箱中保存备用。2.1.7转化感受态细胞将10 μ L连接体系全部取出加到200 yL DH5a感受态细胞中，冰浴30min ；再置 于42°C温浴90s，之后再冰浴2min;然后立即加入0.8mL LB培养基，37°C水浴振荡培养45min,取200 μ L涂于含(X-gal/IPTG/Kan)的培养基上，置37°C培养箱中培养过夜。 次日挑取单个白色菌落接种于5mLLB(含50yg/mLKan)中，37°C水浴振荡培养18h后 进行质粒抽提。2.1.8质粒的抽提按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存 于-20°C保存备用。2.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定将上一步抽提的重组质粒命名为pMD18_UL51，分别以EcoRl/XhoI双酶切消化
与Xho I单酶切消化，1.0%凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。
权利要求
1.基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫 和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于所述硝基纤维膜上的测 试线由浓度大于或等于lmg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，对照线由浓 度大于或等于lmg/mL C抗B IgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记浓度大于或等于 2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成；所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG 为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B 抗重组UL51蛋白抗体IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A外的任一种动物抗重组 UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A和B外的任一 种动物抗B IgG。
2.根据权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，其特征在于所 述A抗重组UL51蛋白抗体IgG中的A为鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B抗重组 UL51蛋白抗体IgG为兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG为羊抗兔IgG。
3.根据权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，其特征在于所 述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于lmg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成， 对照线由浓度等于lmg/mL C抗B IgG包被而成；所述金标垫包由胶体金标记浓度等于 2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成。
4.权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸的制作方法，其特征在 于具体步骤为a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制将浓度大于或等于lmg/mL的A抗重组 UL51蛋白抗体IgG喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度大于或等于lmg/mLC抗B IgG喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；b金标垫的制备将玻璃纤维素膜浸于胶体金标记浓度大于或等于2mg/mL的B抗重 组UL51蛋白抗体IgG中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点， 干燥后得金标垫；c胶体金免疫层析试纸条的组装分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫依次 粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫端， 再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存。
5.根据权利要求4所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸的制作方法，其特 征在于所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线距硝基纤 维膜的边距分别为0.9厘米。
6.权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸在制备鸭瘟病毒抗原检 测试纸中的应用。
全文摘要
本发明涉及基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，其由吸收垫、底板、硝基纤维膜、金标垫和样品垫组成，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度≥1mg/mLA动物抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，所述金标垫由浓度≥2mg/mL胶体金标记B动物抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，所述硝基纤维膜上的对照线由浓度≥1mg/mL C动物抗B动物IgG包被而成；所述胶体金试纸的制备方法包括硝基纤维膜上测试线和对照线喷制、金标垫制备及胶体金免疫层析试纸条的组装；本试纸用于检测鸭瘟病毒抗原的检测灵敏度和特异性高，本制备方法操作简单实用，本运用首次将抗重组UL51蛋白抗体制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗原。
文档编号G01N33/558GK102012428SQ20101029952
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者汪铭书, 沈婵娟, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心