专利名称：检测h1亚型猪流感病毒抗体的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测Hl亚型猪流感病毒抗体的蛋白及其应用。
背景技术：
猪流感(Swine Inf luenza, Si)是由A型流感病毒引起的一种急性、传染性猪的呼 吸道疾病，其特征为突发、咳嗽、呼吸困难、发热、衰竭，还可导致怀孕母猪繁殖障碍。如无并 发症，病猪一般很快康复。该病的发生呈流行性，有季节性。常发生于天气骤变的晚秋，早 春及寒冷的冬季。虽然SI的死亡率不高，但其影响猪的发育，延缓猪的生长及出栏时间；同 时SI也是一种免疫抑制性疾病，可以破坏猪的免疫系统而引起免疫抑制，导致其它疫病并 发或继发感染，加剧病情，给养猪业造成重大的经济损失。常见的继发性呼吸道细菌感染有 胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和II型猪链球菌等；继发性呼吸道病 毒感染有繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪呼吸道冠状病毒(PRCV)等。自1918年临床 上发现经典型Hmi亚型SI以来，不断有新亚型、基因型毒株的出现，对养猪业造成的经济 损失不可估量。同时历史证明，在人类流感的流行中SI发挥了重要的作用，严重危害人类 的健康。Hl与H3亚型猪流感，特别是H1N1、H3N2和H1N2亚型猪流感是引起猪呼吸系统疾 病的主要疾病，在世界范围内呈现地方流行性。经过长期的进化，这三种亚型的病毒已成 为猪体内的适应毒株，长期稳定存在于猪群中，严重危害着养猪业的健康发展。同时由于 猪的“混合器”作用，可以同时感染禽源、人源流感病毒，而产生具有新抗原性、遗传特性、致 病特性的基因重排病毒，进而使病毒可能突破种间屏障、扩大感染谱系，危害动物及人类健 康。因此了解猪流感的流行发展史及流行现状，不仅对猪流感的预防和控制具有重要应用 价值，而且具有重要的公共卫生学意义。HlNl亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)是在猪群中最早分离的亚 型，称为经典Hmi (Classical H1N1)亚型SIV。从1930年分离到该病毒到20世纪70年代 末，经典SIV在猪群中占主导地位，在世界范围内的显现地方流行性；自1979年欧洲发现类 禽(Avian-Iike)Hmi亚型SIV起，其逐渐取代了经典SIV在欧洲的主导地位，在猪群中广 泛流行；从此世界范围内便出现了经典和类禽Hmi亚型SIV在猪体内稳定存在、共同流行 的局面。同时，虽然人Hmi流感病毒被认为不能在猪体内繁殖长期存在、显现一过性感染， 但近年从临床上也分离到了类人Hmi (Human-IikeHlNl)亚型SIV。自1918年报道在猪群中出现流感症状疾病以来，在相当一段时间内SI只局限在 美国的北部和中西部，于每年的冬季暴发。1930年Shope首次分离到了 SIV，这些病毒及 与其亲缘关系十分接近的病毒被成为“经典SIV”。随后1957年报道在非洲的肯尼亚发现 了 SI ；到20世纪70年代末，经典SI的报道逐渐见多，北美的加拿大(1981)，南美的巴西 (1978)，亚洲的中国香港和台湾(1976，1979)、日本(1977)、印度(1981)、伊朗(1976)；而在 美国，20世纪70年代末Hmi亚型经典SI已经在全国的猪群中存在，育肥猪抗体阳性率近 25%,生活史长的育种猪抗体阳性率可达45%。到20世纪80年代末，美国北部中心地区猪的患病率已经达到了 51%。欧洲，首先在英国(1941)和捷克(1950)分离到了 SIV,同时期在联邦德国证实 猪群中存在经典Hmi病毒的抗体。1980年有报道在比利时、法国发生了经典Si，并迅速 地传播到了欧洲其他的国家，例如荷兰(1983)、德国(1981)、丹麦(1981)、瑞典(1983)、英 国(1986)。一时经典SI在欧洲猪群中显现地方流行性，整个欧洲猪群血清阳性率达到了 20-25%。在我国大陆，郭元吉等于1991年10月-1992年1月首次在表面健康猪群中分离到 了经典Hmi亚型SIV。但在2000年之前，未见我国大陆猪群中有经典SI流行的报道，而自 2000年后经典SIV的活动显著提高。2001年，王连想等从广东的25个猪场中分离到7株 HlNl亚型SIV ；2001年，李海燕等从我国华南、东北地区猪群分离鉴定了 15株经典Hmi亚 型SIV ；2002年，郭元吉等从北京的猪群中分离到2株经典Hmi亚型SIV ；2007年，魏宏等 从福建高烧期病猪分离到经典SIV ；2008年，温纳相等从广东某发病猪场分离到4株Hmi、 5株H3N2亚型SIV。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测Hl亚型猪流感病毒抗体的蛋白及其应用。本发明提供了序列表的序列1所示的蛋白质，可检测Hl亚型猪流感病毒抗体。所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。所述编码基因的编码区具体可如序列表的序列2所示。含有所述基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的 保护范围。所述重组表达载体具体可为在pET30a(+)的多克隆位点插入所述基因得到的重 组质粒。所述的蛋白质可用于制备辅助检测Hl亚型猪流感病毒抗体的试剂盒。本发明还保护一种辅助检测Hl亚型猪流感病毒抗体的试剂盒，包括所述蛋白。所述试剂盒可由包被所述蛋白的酶标板和HRP标记的羊抗猪IgG组成。包被所述蛋白的酶标板的制备方法包括如下步骤将所述蛋白以0. 5μ g/ml的浓 度包被于所述酶标板(每孔100微升)。所述Hl亚型猪流感病毒具体可为Hmi亚型猪流感病毒。本发明还保护Hmi亚型猪流感病毒A/Swine/Beijing/518/2009株，它的保藏编 号为 CGMCC No. 4052。Hmi 亚型猪流感病毒 A/Swine/Bei jing/518/2009 株，已于 2010 年 7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 4052。本发明提供的蛋白可以特异性结合Hl亚型猪流感病毒抗体，具有良好的特异性， 与其它病症相似的病毒抗体均为阴性反应，所以可应用于检测猪是否感染了 Hl亚型猪流 感病毒，对于猪的养殖业具有重大的经济价值。
图1为PCR鉴定的结果；M =DNA marker ；1 阴性对照(水)；2，3 阳性克隆。图2为酶切鉴定结果；M =DNA marker ；1 :pET30a(+) ；2 阳性质粒。
图3为HAl蛋白的SDS-PAGE结果；M 蛋白marker ；1 诱导前全菌；2 诱导后全菌； 3 诱导后上清；4 诱导后沉淀；5 纯化后蛋白。图4为HAl蛋白的western结果；M 蛋白marker ；1 一抗为Hmi亚型猪流感病毒 阴性血清；2 —抗为猪流感Hmi亚型标准阳性血清。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为 自常规生化试剂商店购买得到的。pET30a(+)表达载体，带有His标签；购自北京雷根生 物技术有限公司，货号为LG-S001262。PMD18-T购自北京雷根生物技术有限公司，货号为 LG-SJ0516。大肠杆菌DH5a 购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0808。大肠 杆菌BL21 购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0809。猪繁殖与呼吸综合症病 毒(PRRSV)阳性血清、猪瘟病毒(CFSV)阳性血清、猪圆环病毒二型(PCV2)阳性血清均购 自中国兽医药品监察所。Hmi亚型猪流感病毒阳性血清购自IDEXX公司，产品目录号为 07016-EE339。Hmi亚型猪流感病毒阴性血清购自IDEXX公司，产品目录号为07017-EE344。 H3N2亚型猪流感病毒阳性血清购自购自IDEXX公司，产品目录号为08347-KE232。HRP标记 的羊抗猪IgG购自Santa Cruz公司，货号为SC-2463。所有引物合成及测序工作均由上海 生工公司完成。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、Hmi亚型猪流感病毒A/Swine/Bei jing/518/2009株的发现2009年10月，刘文军在北京市大兴猪场的发病猪鼻腔拭子分离获得的一株Hmi 亚型猪流感病毒(SIV)，将其命名为Hmi亚型猪流感病毒A/Swine/Bei jing/518/2009株， 已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 4052。从Hmi亚型猪流感病毒A/Swine/Bei jing/518/2009株中发现了序列表的序列1 所示的HAl蛋白，其编码序列如序列表的序列2所示。实施例2、原核表达并纯化Hmi亚型猪流感病毒的HAl蛋白一、重组表达载体的构建1、引物的设计设计一对引物如下上游引物5，-CGCGGATCCGCAGACACACTATG-3’(含有 BamHI 酶切位点)；下游引物5，-CCGCTCGAGTCAAGATTGAATAGAC-3’(含有 XhoI 酶切位点)。靶序列的大小为981bp。2、重组表达载体的构建①以Hmi 亚型猪流感病毒 A/Swine/Bei j ing/518/2009 株 CGMCC No. 4052 的 cDNA 为模板，用步骤1设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。②将步骤①的PCR扩增产物与PMD18-T连接，得到重组质粒甲。③用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切重组质粒甲，回收Ikb左右的DNA片段。④用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切pET30a(+)，回收载体骨架。⑤将步骤③的DNA片段和步骤④的载体骨架连接，得到连接产物。
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⑥将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，依次进行PCR鉴定、酶切鉴定 和测序鉴定。PCR鉴定所用的引物为步骤1设计的引物对，鉴定结果见图1。酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶BamHI和XhoI，鉴定结果见图2。测序结果表明，得到了重组质粒乙(骨架质粒为pET30a(+)，在骨架质粒的BamHI 和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA)。二、HAl蛋白的表达、纯化和鉴定1、HAl蛋白的表达将重组质粒乙转化大肠杆菌BL21感受态；然后按1 100的体积比接种于LB培 养基(含100 μ g/ml卡那霉素)中，37°C，200转/分摇床培养至OD值为0. 6-0. 8 (600nm波 长)；加入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，继续培养4小时。加入诱导剂IPTG前的菌液为诱导前全菌。加入诱导剂后，继续培养4小时后的菌 液为诱导后全菌。将诱导后全菌4000转/分离心20分钟收菌，超声破碎，4°C、12000转/ 分离心20分钟，分别收集上清(诱导后上清)和沉淀(诱导后沉淀)。2、HAl蛋白的纯化诱导后沉淀用PBST 缓冲液(每升含 NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4L 15g、 KH2PO4O. 2g、Tween-2050ml，溶剂为水)重悬，然后4°C、12000转/分离心20分钟，收集沉淀； 沉淀用IM NaCl水溶液重悬，然后4°C、12000转/分离心20分钟，收集沉淀；沉淀用PBST 缓冲液重悬，然后4°C、12000转/分离心20分钟，收集沉淀；沉淀用IM NaCl水溶液重悬， 然后4°C、12000转/分离心20分钟，收集沉淀。将沉淀用变性剂(6M盐酸胍，2mM EDTA, 50mM Tris-HCl, IOmM DTT，溶剂为水)溶 解，然后采用稀释复性法(用5ml注射器将溶解后的沉淀加入注射器内，使之逐滴的向复性 剂(IOOmM Tris pH8. 0,400Mm L-Arg HCl,2mM EDTA,5mM GSH,0. 5mM GSSG,0. 5mM PMSF，溶 剂为水)内滴下，慢慢搅拌8-10小时进行复性；依次用浓缩杯和浓缩浓缩管进行复浓缩，得 到复性后蛋白。将复性后蛋白进行Ni柱亲和层析纯化。NTA-Ni柱子购自GE Healthcare公司(货 号为 10033267)，柱长为 10cm、内径为 0. 77cm。亲和纯化的参数Wash Buffer :50mMNaH2P04, 300mM NaCl，20mM 咪唑，ρΗ8· 0 ;Elute Buffer :50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，500mM 咪唑， pH8.0。将复性后蛋白上样，然后用30个柱体积Wash Buffer冲洗柱子(洗掉非特异性结 合的杂蛋白)，然后加入1个柱体积Elute Buffer孵育5分钟，收集该1个柱体积的洗脱 液，得到纯化后蛋白。纯化后蛋白使用BCA法检测蛋白浓度，蛋白浓度为0. 804mg/ml。3、HAl蛋白的鉴定分别将诱导前全菌、诱导后全菌、诱导后上清、诱导后沉淀和纯化后蛋白进行12% SDS-PAGE，结果见图3。SDS-PAGE后将纯化后蛋白进行western blot鉴定，一抗为Hmi亚型猪流感病毒 阳性血清(1 500倍稀释)，对照为Hmi亚型猪流感病毒阴性血清，二抗为HRP标记的羊 抗猪IgG(l 5000倍稀释)。结果见图4。三、对照溶液的制备
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用pET30a(+)代替重组质粒乙，其它同实施例二，得到的洗脱液作为对照溶液。实施例3、间接ELISA检测方法的建立及反应条件的优化将实施例2制备的纯化后蛋白作为包被抗原，用包被液(Na2CO3L 59g， NaHC032. 93g，加蒸馏水至 1000ml ；pH9. 6)分别稀释至 0. 125μ g/ml，0. 25 μ g/ml, 0. 5 μ g/ ml,lyg/ml,2yg/mL·血清样本为Hmi亚型猪流感病毒阳性血清或Hmi亚型猪流感病毒 阴性血清；将血清样本分别进行如下梯度稀释1 50,1 100,1 200,1 400。酶标 二抗为HRP标记的羊抗猪IgG，将酶标二抗分别进行如下梯度稀释1 5000,1 10000, 1 20000,1 40000。采用棋盘法确定最佳反应条件包被抗原稀释液(每孔100μ 1)4°C包被过夜 (37°C包被5h也可)，然后用封闭液37°C封闭3小时(4°C封闭过夜也可)，然后用PBST缓 冲液洗涤3次(每次2min)；然后加入血清样本稀释液(每孔100 μ 1)，37°C温育30min，用 PBST缓冲液洗涤5次；然后加入酶标二抗稀释液(每孔IOOy 1)，37°C温育30min，用PBST 缓冲液洗涤5次；然后加入TMB显色液(每孔100 μ 1)，37°C温育IOmin后加入终止液(每 孔100 μ 1)；最后酶标仪测定其A45(tam。标准阳性血清0D450值在1. 0左右，标准阴性血清0D450值较低，二者之比最大 时的反应条件为最佳。结果表明抗原最佳包被浓度为0.5 μ g/ml，血清最佳稀释倍数为 1 100，酶标二抗最佳稀释倍数为1 10000。实施例4、HAl蛋白对Hmi亚型猪流感病毒阳性血清的特异识别作用将猪繁殖与呼吸综合症病毒阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪圆环病毒二型阳性 血清、Hmi亚型猪流感病毒阳性血清、Hmi亚型猪流感病毒阴性血清和H3N2亚型猪流感病 毒阳性血清分别进行ELISA检测，步骤如下1、将实施例2制备的纯化后蛋白作为包被抗原，用包被液稀释至0. 5μ g/ml，然后 加入酶标板(每孔100 μ 1)，4°C包被过夜，然后用封闭液37°C封闭3小时，然后用PBST缓 冲液洗涤3次，得到包被抗原的酶标板；将实施例2制备的对照溶液用包被液稀释(稀释倍 数同纯化后蛋白的稀释倍数)，采用相同方法进行包被，得到对照酶标板。2、加入1 100倍稀释的血清(每孔100 μ 1)，37°C温育30min,用PBST缓冲液洗 涤5次；3、加入1 10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG(每孔100μ1)，37 温育 30min，用PBST缓冲液洗涤5次；4、加入TMB显色液(每孔100μ 1)，37°C温育lOmin，然后加入终止液(每孔
100 μ 1)；最后酶标仪测定其A45(lnm。S/P值=(待测样本0D450-阴性对照0D450) / (阳性对照0D450-阴性对照 0D450)；。阈值为S/P = 0.26。结果见表1。表1不同血清样本的S/P值统计
权利要求
序列表的序列1所示的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述编码基因的编码区如序列表的序列2 所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pET30a(+) 的多克隆位点插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。
6.权利要求1所述的蛋白质在制备辅助检测Hl亚型猪流感病毒抗体的试剂盒中的应 用。
7.一种辅助检测Hl亚型猪流感病毒抗体的试剂盒，包括权利要求1所述蛋白。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由包被权利要求1所述蛋白 的酶标板和HRP标记的羊抗猪IgG组成。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述包被权利要求1所述蛋白的酶标板 的制备方法包括如下步骤将权利要求1所述蛋白以0. 5μ g/ml的浓度包被于所述酶标板。
10.HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Bei jing/518/2009株，它的保藏编号为 CGMCCNo. 4052。
全文摘要
本发明公开了一种检测H1亚型猪流感病毒抗体的蛋白及其应用。本发明提供了序列表的序列1所示的蛋白质及其编码基因。本发明提供的蛋白可以特异性结合H1亚型猪流感病毒抗体，具有良好的特异性，与其它病症相似的病毒抗体均为阴性反应，所以可应用于检测猪是否感染了H1亚型猪流感病毒，对于猪的养殖业具有重大的经济价值。
文档编号G01N33/569GK101974078SQ20101050088
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者刘文军, 孙蕾, 李晶 申请人:中国科学院微生物研究所