专利名称：离体神经信息双模检测微电极阵列芯片及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器的微加工技术领域，是一种离体神经信息双模检测微电极阵列芯片及制备方法。
背景技术：
神经细胞是组成高等动物神经系统的基本结构功能单位，数以亿计的神经细胞通过突触连接形成错综复杂的网络。神经细胞脉冲放电以及神经递质释放是神经信息传递的两种模式，二者相互依存，相互调制。因此，对群体神经细胞实施神经电生理信号和神经递质电化学信号的同步检测，籍以研究神经细胞的相互作用机制、神经信息的编码解码过程、 神经精神性疾病的发病机理、以及药物反应等，具有重要的科学意义和实用价值。长期以来，人们利用传统的膜片钳、玻璃微电极、金属丝微电极等，对在体或离体条件下的神经细胞电生理信号进行检测，通常仅能获得少量几个通道的数据，且电极定位困难、操作繁琐；近年来，随着微机电系统(MEMQ加工技术的发展，国内外出现了一些采用各种材料和工艺制备而成的微电极阵列芯片，可实现群体神经细胞电生理活动的同步检测，如德国Multichannel公司开发的MEA芯片，美国NeuroNexus公司生产的Michigan植入式微电极阵列等，但这些电极尚未集成检测神经递质的功能，无法深入研究神经电生理信号与相应神经递质浓度变化之间的内在关系；而对于神经递质电化学信号的检测，目前多采用大电极、体外微透析的方法，检测实时性差，灵敏度不高，无法实现与电生理信号的同步检测。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种离体神经信息双模检测微电极阵列芯片及制备方法，该阵列芯片功能集成化，电路接口简单，使用方便。制备出的微电极阵列芯片含有多个通道，能够用于离体神经细胞电生理和神经递质电化学信息两种模式的同步检测，并兼有对细胞施加电刺激的功能。将离体的动物神经组织切片贴在芯片的微电极阵列表面，或在芯片上进行神经细胞培养，即可开展动物离体神经信息的双模检测及相关研究。为实现这一目的，本发明采用了如下的技术方案一种离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其包括绝缘基底、微电极阵列、对电极、参比电极、引线以及触点；绝缘基底是整个芯片的载体，在绝缘基底表面的中心位置为微电极阵列，微电极阵列中分布了多个以矩阵形式排布的、由导电薄膜材料制成的圆形微电极；微电极阵列一侧设有一Pt薄膜对电极，以及一Ag/AgCl复合薄膜参比电极，对电极和参比电极均呈多边形，对称分布，尾端呈条形分别延伸至基底边缘；所有圆形微电极均通过导电薄膜引线延伸至基底两端边缘，引线末端与方形触点电连接，以方便与外部电路连接， 所有引线表面覆盖有绝缘层。所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其所述绝缘基底的材料选用硬质透明绝缘材料，是石英玻璃、聚氯乙烯或聚碳酸酯其中之一，基底边长25mm 80mm，厚度 Imm 2mm。所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其所述微电极阵列选用的导电薄膜材料为生物相容性好的金属或金属化合物，表面修饰有纳米材料或敏感膜材料；微电极阵列包含9 64个微电极，其中用于神经电生理信号检测的微电极直径10 μ m 30 μ m， 用于神经递质电化学信号检测以及施加电刺激的微电极直径30 μ m 50 μ m，微电极间距 50 μ m ~ 200 μ m ；对电极及参比电极的尺寸比微电极至少大一个数量级，用于提供参考电位并保持电位稳定；弓丨线及触点的导电薄膜材料与微电极相同，厚度大于300nm，保证其机械强度能够承受标准电子元器件中弹性金属探针所造成的压力。所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其所述微电极阵列选用的导电薄膜材料，是金、钼、氮化钛或铟锡氧化物其中之一；引线表面覆盖的绝缘层材料为生物相容性好的有机或无机绝缘材料。所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其所述引线表面覆盖的绝缘层材料，是二氧化硅、氮化硅、氮氧硅、SU8、聚酰亚胺或聚对二甲苯其中之一。一种所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片的制备方法，其包括如下步骤a)在经过表面清洗的绝缘基底1上旋涂一层光刻胶，厚度大于拟溅射导电薄膜层的三倍，光刻显影后形成微电极阵列、对电极、参比电极、引线及触点的图案；b)在光刻胶图案表面溅射一层厚度250nm 500nm的微电极导电薄膜层；c)采用剥离工艺去除多余导电薄膜层，留下所需电极、引线及触点；d)通过等离子体增强化学气相沉积(PECVD) 二氧化硅、氮化硅、氮氧硅，或旋涂 SU8、聚酰亚胺、聚对二甲苯的方法，在制备好导电薄膜层的基底表面覆盖绝缘层，通过光刻和等离子刻蚀的方法，暴露出微电极阵列、对电极、参比电极及触点，保留所有引线表面覆盖的绝缘层；e)在所述对电极3的表面，采用光刻、溅射、剥离的工艺，制备厚度250nm 500nm 的Pt金属薄膜层；f)在所述参比电极的表面，采用光刻、溅射、剥离的工艺，制备厚度500nm SOOnm 的Ag金属薄膜层，并通过化学或电化学方法进行氯化，或在参比电极的表面丝印涂覆Ag/ AgCl浆料并烘干，最终形成Ag/AgCl复合薄膜参比电极；g)通过电化学沉积或物理滴涂、吸附等方法，在设定不同功能的微电极表面修饰纳米材料或敏感膜材料。所述的制备方法，其所述步骤b)之前，预先溅射IOnm 50nm的Cr或Ti种子层， 以增加导电薄膜层与基底的粘附性。所述的制备方法，其所述步骤b)中，溅射一层厚度250nm 500nm的微电极导电薄膜层时，若微电极导电薄膜选用Pt材料，则可省略步骤e)。本发明提供的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，将多通道神经电生理检测、神经电刺激、神经递质检测的功能集成一体，实现高通量同步检测，使用方便，电路接口简单可靠。突破了以往技术只能对两种神经信息模式分开检测、实时性差的局限，为研究二者相互调制的关系提供了更加便捷有效的工具，为深入研究神经信息编码、传递的内在机制，以及一些神经精神性疾病的发病机理提供了新的视角。
图1为本发明离体神经信息双模检测微电极阵列芯片结构图；图2为两种不同微电极阵列的局部放大示意图，其中图加中的微电极直径均为30 μ m ；图2b中的微电极直径包含10 μ m、20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m五种；图3为本发明离体神经信息双模检测微电极阵列芯片制备方法的工艺流程图；图3a为电极引线及触点的图案；图北为接着溅射250nm的Pt薄膜层；图3c为采用剥离工艺去除多余的Ti/Pt薄膜层，留下所需电极、引线及触点；图3d为在制备好Pt薄膜层的基底表面，PECVD氮化硅(Si3N4)绝缘层，厚度800nm。 通过光刻和SF6等离子刻蚀的方法，暴露出微电极、对电极、参比电极及触点，保留所有引线表面覆盖的氮化硅绝缘层；图!Be为在参比电极的表面，丝印涂覆厚度200 μ m的Ag/AgCl浆料，并在100°C的烘箱中烘干3小时，最终形成Ag/AgCl复合薄膜参比电极；图3f为采用电化学沉积的方法，在用于神经电生理检测的微电极表面修饰纳米钼黑(Pt Black)颗粒；图3g为在微电极阵列表面滴涂浓度为的Nafion (离子交换型聚合物)乙醇溶液，自然晾干后，形成离子选择性Nafion薄膜。附图标号说明1为绝缘基底，2为微电极阵列，3为对电极，4为参比电极，5为引线，6为触点，7为可功能复用的微电极，8为仅用于电生理检测的微电极，9为仅用于神经递质检测或施加电刺激的微电极。
具体实施例方式本发明离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，由绝缘基底、微电极阵列、对电极、参比电极、电极引线以及触点构成。所述绝缘基底是整个芯片的载体，在绝缘基底表面的中心位置，分布了若干个以矩阵形式排布的、由导电薄膜材料制成的圆形微电极，构成微电极阵列。其中，部分微电极用于检测神经电生理信号，部分微电极用于检测不同神经递质的浓度或对神经细胞施加电刺激。微电极阵列周边配有一个尺寸较大的Pt薄膜对电极， 以及一个Ag/AgCl复合薄膜参比电极。所有圆形微电极均通过导电薄膜引线延伸至基底边缘，末端形成方形触点，方便与外部电路连接，所有引线表面均覆盖有绝缘层。绝缘基底选用硬质透明绝缘材料，可以是石英玻璃、聚氯乙烯、聚碳酸酯，这些材料具有化学、机械性能稳定的特点，能够耐受微加工过程中温度、压力、化学试剂的影响。选用透明材料有利于在显微镜下对被测离体神经细胞进行观察。绝缘基底边长25mm 80mm， 厚度Imm 2mm。微电极阵列选用的导电薄膜材料为生物相容性好的金属或金属化合物，可以是金、钼、氮化钛、铟锡氧化物，为了提高信噪比以及提高对不同神经递质检测的选择性，微电极表面可根据需要修饰纳米材料或敏感膜材料。微电极阵列包含9 64个微电极，其中用于神经电生理信号检测的微电极直径10 μ m 30 μ m，用于神经递质电化学信号检测以及施加电刺激的微电极直径30 μ m 50 μ m，微电极间距50 μ m 200 μ m0对电极及参比电极的尺寸比微电极至少大一个数量级，在电生理信号检测或施加电刺激的过程中，参比电极用于提供参考电位；在神经递质电化学信号的检测过程中，对电极用于提供一个电流回路，并与参比电极一起，构成电化学检测的三电极体系。圆形微电极引线及触点的导电薄膜材料与微电极相同，厚度大于300nm，保证其机械强度能够承受标准电子元器件中弹性金属探针所造成的压力。当金属探针轻压在触点上时，即可实现芯片与外部电路的连接。该电路接口避免了常规MEMS器件封装时金丝压焊的工序，接口简单，连接可靠，可重复使用。圆形微电极引线表面覆盖的绝缘层材料为生物相容性好的有机或无机绝缘材料， 可以是二氧化硅、氮化硅、氮氧硅、SU8、聚酰亚胺、聚对二甲苯。本发明的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其制备方法包括如下步骤1.在经过表面清洗的绝缘基底上旋涂一层光刻胶，厚度大于拟溅射导电薄膜层的三倍，光刻显影后形成所有微电极阵列、对电极、参比电极、电极引线及触点的图案；2.在光刻胶图案表面溅射一层厚度250nm 500nm的微电极导电薄膜层，必要时预先溅射IOnm 50nm的Cr或Ti种子层，以增加导电薄膜层与基底的粘附性；3.采用剥离工艺去除多余导电薄膜层，留下所需电极、引线及触点；4.通过PECVD 二氧化硅、氮化硅、氮氧硅，或旋涂SU8、聚酰亚胺、聚对二甲苯的方法，在制备好导电薄膜层的基底表面覆盖绝缘层，通过光刻和等离子刻蚀的方法，暴露出微电极、对电极、参比电极及触点，保留所有引线表面覆盖的绝缘层；5.在所述对电极的表面，采用光刻、溅射、剥离的工艺，制备厚度250nm 500nm的 Pt金属薄膜层，若步骤2中的微电极导电薄膜已选用Pt，则可省略本步骤；6.在所述参比电极的表面，采用光刻、溅射、剥离的工艺，制备厚度500nm SOOnm 的Ag金属薄膜层，并通过化学或电化学方法进行氯化，或在参比电极的表面丝印涂覆Ag/ AgCl浆料并烘干，最终形成Ag/AgCl复合薄膜参比电极；7.通过电化学沉积或物理滴涂、吸附的方法，在设定不同功能的微电极表面修饰纳米材料或敏感膜材料。以下结合附图对本发明的一个具体实施方式
做详细说明。本发明提供的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片结构如图1所示。整个芯片由绝缘基底1、微电极阵列2、对电极3、参比电极4、电极引线5以及触点6构成。绝缘基底1选用生物实验室常用的载玻片，作为整个芯片的载体。载玻片长 76. 2mm，宽25. 4mm，厚1mm。在载玻片表面的中心位置，分布了 64个由Pt薄膜材料制成的圆形微电极，构成微电极阵列2。微电极基本以8X8的方阵形式排列，电极间距100 μ m，亦可做一定形式的调整。 图2即为两种不同微电极阵列2的局部放大示意图，图2 (a)中的微电极直径均为30 μ m，图 2(b)中的微电极直径包含1(^111、2(^111、3(^111、4(^111、5(^111五种。由于待测神经细胞的胞体直径在 ο μ m左右，电极直径越小越利于检测单个细胞的电活动，电极直径大于30 μ m 时，电极记录到的信号过多，将不利于单个细胞电信号的分离。但是，大的电极直径有利于增加神经递质检测的信号强度，且能够承受更大的刺激电流。因此，本实施例中，直径小于 30μπι的微电极仅用于检测神经细胞的电生理信号，如图中的电极7 ；直径大于30μπι的微电极仅用于检测神经递质电化学信号，或对神经细胞进行电刺激，如图中的电极9 ；直径为 30 μ m的微电极则可根据需要进行三种功能的切换，如图中的电极8。为了提高信噪比，可在微电极表面修饰纳米钼黑颗粒。为了提高检测神经递质多巴胺的选择性，可在微电极表面修饰离子选择性Nafion膜。在载玻片的一侧配有一个尺寸较大的Pt薄膜对电极3，以及一个Ag/AgCl复合薄膜参比电极4。两个电极均呈多边形，对称分布，尾端呈条形分别延伸至载玻片边缘，最小边长约3mm左右。在电生理信号检测或施加电刺激的过程中，参比电极用于提供参考电位；在神经递质电化学信号的检测过程中，对电极3用于提供一个电流回路，并与参比电极一起， 构成电化学检测的三电极体系。所有圆形微电极均通过Pt薄膜引线5延伸至载玻片两端边缘，末端形成方形触点 6，触点边长1. 27mm,同样以阵列形式排布，间距2. 54mm。该尺寸与标准电子元器件中弹性金属探针的尺寸相匹配。当焊接在电路板上的金属探针轻压在触点上时，即可实现芯片与外部电路的连接。所有弓I线表面均覆盖有氮化硅薄膜绝缘层，可使神经细胞及电解质培养液与弓I线之间达到电学上的隔离。将离体的动物神经组织切片贴在芯片的微电极阵列表面，或在芯片上进行神经细胞培养，结合配套的检测系统，即可开展动物离体神经信息的双模检测及相关研究。本发明的具体制备过程参考图3详述如下1.在经过表面清洗的载玻片(Glass)上旋涂一层正性光刻胶AZ1500，厚度1 μ m， 光刻显影后形成掩模板上所有微电极阵列2、对电极3、参比电极4、电极引线及触点6的图案(图3a)；2.在光刻胶图案表面溅射一层厚度30nm的Ti种子层，以增加Pt导电薄膜层与玻璃基底的粘附性，接着溅射250nm的Pt薄膜层(图北)。3.采用剥离工艺去除多余的Ti/Pt薄膜层，留下所需电极2 4、引线5及触点6， (图 3c)；4.在制备好Pt薄膜层的基底表面，PECVD氮化硅(Si3N4)绝缘层，厚度800nm。通过光刻和SF6等离子刻蚀的方法，暴露出微电极7、8、对电极3、参比电极4及触点6，保留所有引线表面覆盖的氮化硅绝缘层(图3d)；5.在参比电极4的表面，丝印涂覆厚度200 μ m的Ag/AgCl浆料，并在100°C的烘箱中烘干3小时，最终形成Ag/AgCl复合薄膜参比电极4 (图3e)；7.采用电化学沉积的方法，在用于神经电生理检测的微电极8表面修饰纳米钼黑 (Pt Black)颗粒(图3f)。具体过程是，用去离子水配制20mmol/L的氯钼酸(H2PtCl6)和 2mol/L的盐酸(HCl)混合液，作为电镀液加入灌流槽中。连接电化学工作站CHI660，以待修饰微电极为工作电极，钼丝为对电极，施加固定电位，采用计时电流法电镀5分钟。8.在微电极阵列2表面滴涂浓度为1 %的Nafion (离子交换型聚合物)乙醇溶液，自然晾干后，形成离子选择性Nafion薄膜(图3g)。 以上实施例只是为了起到说明的目的，并非对本发明的限制，在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变，所作改进和改变，及选用其它功能材料等方法均应在本发明权利要求保护范围之内。
权利要求
1.一种离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其特征在于包括绝缘基底(1)、微电极阵列O)、对电极(3)、参比电极、引线(5)以及触点(6)；绝缘基底⑴是整个芯片的载体，在绝缘基底(1)表面的中心位置为微电极阵列O)，微电极阵列O)中分布了多个以矩阵形式排布的、由导电薄膜材料制成的圆形微电极；微电极阵列( 一侧设有一 Pt薄膜对电极(3)，以及一 Ag/AgCl复合薄膜参比电极G)，对电极(3)和参比电极⑷均呈多边形，对称分布，尾端呈条形分别延伸至基底(1)边缘；所有圆形微电极均通过导电薄膜引线 (5)延伸至基底(1)两端边缘，引线(5)末端与方形触点(6)电连接，以方便与外部电路连接，所有引线( 表面覆盖有绝缘层。
2.根据权利要求1所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其特征在于所述绝缘基底(1)的材料选用硬质透明绝缘材料，是石英玻璃、聚氯乙烯或聚碳酸酯其中之一， 基底(1)边长25mm 80mm，厚度Imm 2mm。
3.根据权利要求1所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其特征在于所述微电极阵列( 选用的导电薄膜材料为生物相容性好的金属或金属化合物，表面修饰有纳米材料或敏感膜材料；微电极阵列( 包含9 64个微电极，其中用于神经电生理信号检测的微电极直径10 μ m 30 μ m，用于神经递质电化学信号检测以及施加电刺激的微电极直径30 μ m 50 μ m，微电极间距50 μ m 200 μ m ；对电极(3)及参比电极的尺寸比微电极至少大一个数量级，用于提供参考电位并保持电位稳定；引线(5)及触点(6)的导电薄膜材料与微电极相同，厚度大于300nm，保证其机械强度能够承受标准电子元器件中弹性金属探针所造成的压力。
4.根据权利要求1或3所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其特征在于 所述微电极阵列( 选用的导电薄膜材料，是金、钼、氮化钛或铟锡氧化物其中之一；引线 (5)表面覆盖的绝缘层材料为生物相容性好的有机或无机绝缘材料。
5.根据权利要求4所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片，其特征在于所述引线( 表面覆盖的绝缘层材料，是二氧化硅、氮化硅、氮氧硅、SU8、聚酰亚胺或聚对二甲苯其中之一。
6.一种如权利要求1所述的离体神经信息双模检测微电极阵列芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)在经过表面清洗的绝缘基底(1)上旋涂一层光刻胶，厚度大于拟溅射导电薄膜层的三倍，光刻显影后形成微电极阵列O)、对电极(3)、参比电极、引线(5)及触点(6)的图案；2)在光刻胶图案表面溅射 层厚度250nm 500nm的微电极导电薄膜层；3)采用剥离工艺去除多余导电薄膜层，留下所需电极、引线(5)及触点(6)；4)通过等离子体增强化学气相沉积(PECVD)二氧化硅、氮化硅、氮氧硅，或旋涂SU8、聚酰亚胺、聚对二甲苯的方法，在制备好导电薄膜层的基底(1)表面覆盖绝缘层，通过光刻和等离子刻蚀的方法，暴露出微电极阵列⑵、对电极⑶、参比电极⑷及触点(6)，保留所有引线表面覆盖的绝缘层；5)在所述对电极C3)的表面，采用光刻、溅射、剥离的工艺，制备厚度250nm 500nm的 Pt金属薄膜层；6)在所述参比电极⑷的表面，采用光亥lj、溅射、剥离的工艺，制备厚度500nm SOOnm 的Ag金属薄膜层，并通过化学或电化学方法进行氯化，或在参比电极的表面丝印涂覆 Ag/AgCl浆料并烘干，最终形成Ag/AgCl复合薄膜参比电极；7)通过电化学沉积或物理滴涂、吸附等方法，在设定不同功能的微电极表面修饰纳米材料或敏感膜材料。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)之前，预先溅射IOnm 50nm的Cr或Ti种子层，以增加导电薄膜层与基底的粘附性。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述步骤幻中，溅射一层厚度250nm 500nm的微电极导电薄膜层时，若微电极导电薄膜选用Pt材料，则可省略步骤5)。
全文摘要
本发明公开了一种离体神经信息双模检测微电极阵列芯片及制备方法，涉及传感器技术，该芯片由绝缘基底、微电极阵列、对电极、参比电极、电极引线及触点、表面绝缘层六个部分构成，采用微机电系统(MEMS)工艺加工制备。其中，微电极是直接与动物离体神经细胞接触的敏感单元，结合对电极与参比电极，可用于实施对神经电生理信号和神经递质电化学信号这两种神经信息传递模式的同步检测，并兼有对细胞施加电刺激的功能。本发明芯片功能集成化，电路接口简单，使用方便，适合实验室开展动物离体神经信息的双模检测及相关研究。
文档编号G01N27/30GK102445477SQ201010513818
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者刘春秀, 宋轶琳, 林楠森, 王利, 蔡新霞 申请人:中国科学院电子学研究所