专利名称：全血离心分离芯片及其制备方法
技术领域：
本发明属于微机电系统领域，具体涉及一种用于生物样品分离、检测、分析的全血离心分离芯片及芯片的制备方法。
背景技术：
二十一世纪是交叉学科发展的时代，特别是生物芯片的研制和生化检测技术。传感技术是信息获取的一个重要手段，利用传感技术获取生物样品的信息是生物检测技术发展的一个重要内容。结合生物技术和微机电系统(MEMS)技术的BioMEMS (生物微机电系统)技术可以将生命科学研究中的不连续分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)实现连续化、集成化、微型化，从而获得所谓的微全分析系统。该系统包括进样、分离、反应和检测，广义的系统还涉及到输运，其最终目标是在微芯片上实现化学全分析，以之取代常规分析实验室的所有功能。与传统仪器相比，微全分析系统具有体积小、重量轻、成本低、便携带、防污染、 分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点，对生物学、分析化学、医学等相关领域产生了革命性的影响，成为MEMS技术研究中的重要领域。在微全分析系统的早期研究中，检测技术一直被研究得较多，获得了较快的发展。 然而，样品分离等前处理技术作为该系统中不可或缺的组成部分，却发展相对缓慢，已经成为整个分析过程中的瓶颈，它制约着生化分析的发展。现有的样品前处理技术往往在片外实现，大多存在费时、劳动强度大、难以实现自动化、精密度差、样品以及其他生化试剂消耗量大等缺点，而且经常是测定误差的主要原因。传统的样品分离技术已不能满足 μ TAS(Micro total analysis system)发展的需要，有必要开发一种新的微分离技术。利用微加工技术制造的微型化生物样品预处理器，具有分析效率高、样品与试剂消耗少(微升级)、能耗低、集成度高等许多优点。微加工技术为微量生化样品的前处理和分析检测提供了强有力的技术支持。这种样品处理芯片在生物检测、毒物鉴定、DNA分析、细胞分离与富集、药物准备和药物输送等方面都会得到很广泛的应用，成为微全分析系统研究的热点。综上所述，微分离心系统作为发展微型生化分析系统的重要部分，在生物医学与化学分析领域有着广阔的应用前景，设计一种结构简单、体积小、便于集成的微分离器，不仅具有较高的精度，还具有很高的可靠性，开发分离芯片与微流体驱动系统各个组件的加工工艺，以及系统集成技术将是一项具有挑战性的、有意义的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全血离心分离芯片，可利用MEMS体硅和表面微机械加工技术制备。本发明提供的全血离心分离芯片如图1所示。芯片上设有涡旋式微流体通道，该微流体通道绕行的中心处为进样口，在微流体通道内设有至少一排的微立柱栅栏，所述微立柱栅栏将微流体通道分成两个或多个流道，上述流道连接不同的出样口。
利用微型泵或注射泵将混有不同大小的全血细胞从离心分离芯片的进样口注入1.对于两排微立柱栅栏情况如图1 (a)所示两排微立柱栅栏将微流体通道由内至外依次分成内流道、中间流道和外流道。所述内流道与白细胞出样口相连，所述中间流道与红细胞出样口相连，所述外流道与血浆出样口相连。本发明利用离心力和微立柱栅栏的立柱间距大小(第二排微立柱间隙小于第一排微立柱间隙)进行分离。具体是小于第一排微立柱间隙的红细胞和血浆在微流道中运动过程中被分离到中间流道，而大于第一排微立柱间隙的白细胞在微流道中运动过程仍在内道。小于第二排微立柱间隙的血浆在微流道中运动过程中被分离到外流道，而大于第二排微立柱间隙的红细胞在微流道中运动过程仍在中间流道。2.对于一排微立柱栅栏情况如图1(b)所示微立柱栅栏将微流体通道由内至外依次分成内流道和外流道。所述内流道与白细胞和红细胞出样口相连，所述外流道与血浆出样口相连。利用离心力和微立柱阵列间距大小进行全血分离，小于微立柱间隙的血浆在微流道中运动过程中被分离到外流道，而大于微立柱间隙的红细胞和白细胞在微流道中运动过程仍在内流道。本发明离心分离芯片的微流体通道、微立柱栅栏为多个微立柱排列而成，它可以加工在硅片上，也可以利用模具复制的方式加工在聚合物材料上。与本发明芯片键合在一起的是聚合物材料或玻璃材料。所述微流体通道为半圆对扣形式或阿基米德螺线形式，绕行中心处的圈数至少为 3圈，每圈的宽度为50-500 μ m。进样口的直径为500-800 μ m。所述微立柱栅栏的立柱横截面为圆形，其直径为至少为6μπι。所述微立柱栅栏的立柱横截面为正方形，其边长为至少为6 μ m。本发明还提供了一种全血离心分离芯片的制备方法，包括步骤(a)处理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀(ICP)硅30 200 μ m左右，形成微流体通道、微型立柱栅栏、进样口和出样口 ；(d)将PDMS与其固化剂按10 1的比例混合，并充分搅拌，用真空泵去除PDMS中的气泡；(e)处理、清洗硅片，并在其表面涂上脱膜剂；(f)将无气泡的PDMS均浇在培养皿内，并静置平坦化，然后在80°C烘箱中烘烤1 小时左右；(g)将固化的PDMS切成与有微流道的硅片一样大，并在相应的进样口和出样口位置打孔；(h)将PDMS和硅片键合的表面用氧离子处理；(i)将PDMS和硅片按相应的位置进行键合，在微流体通道进样口和出样口安装金属菅。本发明还提供了一种全血离心分离芯片的制备方法，包括步骤(a)处理、清洗硅片；
(b)在硅片正面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀(ICP)硅30 200 μ m左右，形成微流体通道、微型立柱栅栏、进样口和出样口的模具；(d)将PDMS与其固化剂按10 1的比例混合，并充分搅拌，用真空泵去除PDMS中的气泡；(e)处理、清洗所述模具，并在其表面涂上脱模剂；(f)将无气泡的PDMS均浇在模具上，静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤1小时；(g)将固化了 PDMS从模具上剥离，并切分每个单元；(h)处理、清洗培养皿，并在其表面涂上脱模剂；(i)将无气泡的PDMS均浇在培养皿内，静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤1小时；(j)将固化的PDMS切成与具有微流体通道的硅片同样大小，并在相应的微流体通道进样口和出样口位置打孔；(k)将PDMS的上下两个键合表面用氧离子处理；(i)将两片PDMS按相应的位置进行键合，在进样口和出样口安装金属管。本发明还提供了一种全血离心分离芯片的制备方法，包括步骤(a)处理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀硅30 200 μ m,形成微流体通道、微立柱栅栏；(d)将硅片正面与玻璃阳极键合，形成硅玻璃片；(e)采用干法、湿法或CMP的方法将键合后的硅玻璃片背面的硅结构层减薄；(f)硅片背面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(g)深刻蚀进、出样口的通孔；(h)将PDMS与其固化剂按10 1的比例混合，并充分搅拌，用真空泵去除PDMS中的气泡；处理、清洗培养皿，并在其表面涂上脱模剂；将无气泡的PDMS均浇在培养皿内，并静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤1小时；(i)将固化的PDMS切成与具有微流道的硅片同样大小，并在相应的微流体通道进样口和出样口位置打孔；(j)将PDMS和硅玻璃片键合的表面用氧离子处理，键合并安装上进出口的金属管。本发明充分利用全血中的红细胞和白细胞尺寸不同、红细胞易变形的特点，结合离心分离技术的优点以及MEMS工艺技术特点，提出了一种新型全血离心分离芯片，采用涡旋状微沟道、双排(或单排)错流过滤相结合，利用微泵将全血样品注入离心分离芯片，通过第一排微立柱间的3 μ m左右缝隙将白细胞分离出来，再利用第二排立柱间小于1 μ m的缝隙将红细胞与血浆分离。若将具有双排立柱的微流道变成一排立柱微流道，可以用来分离细胞和血浆。该分离芯片可以用于红细胞、白细胞和血浆的同时分离，还可以用于其他功能微粒的分离。通过微流体系统与微流控驱动系统的单芯片集成，为形成包括采样、进样、 分离、反应、检测功能的真正芯片提供加工技术、微封装技术和微生化芯片检测生化反应的微机理，可带来新的科学突破。
本发明优点在于(1)分离芯片采用离心分离与梳齿相结合的方法，提高了分离效率，避免了分离过程的阻塞；(2)实现了硅-聚合物、聚合物-聚合物、玻璃-硅-聚合物的三种结构，实现了多种材料的加工方法，可以降低成本；(3)采透明聚合物或玻璃加工，可以在分离过程中实时观察分离效果，减小分离过程中的失误，提高了工作效率；(4)通过微流体通道的设计，本发明全血离心分离芯片的结构紧凑，芯片的总面积减小，分离效率提高。该芯片的分离过程耗时短。
图1的(a)-(b)是依照本发明实施例的全血离心分离芯片的结构示意图；图2的(a)-(g)是依照本发明一个实施例的全血离心分离芯片制备工艺流程图；图3的(a)-(i)是依照本发明另一实施例的全血离心分离芯片制备工艺流程图；图4的(a)-(h)是依照本发明又一实施例的全血离心分离芯片制备工艺流程图；其中，1 芯片；2 进样口 ；3 出样口 ；4 微流体通道；5 内侧微立柱栅栏；6 外侧微立柱栅栏；7 盖片的通孔；8 硅片；9 光刻胶；10 脱模剂；11,14 =PDMS ；12 金属管；13 模具；15 玻璃；41 内流道；42中间流道；43 外流道。
具体实施例方式下面结合附图，通过具体实施例，对本发明作进一步阐述。本发明提供了一种全血离心分离芯片，包括芯片1、进样口 2，出样口 3。所述出样口 3共有三个，分别为白细胞出样口 31、红细胞出样口 32和血浆出样口 33。如图1(a)所示，芯片1包括半圆对扣形式或阿基米德螺线形式的微流体通道4，以及沿所述微流体通道 4内的流动方向(即微流体通道的周向)布置于所述微流体通道4内的两个个微立柱栅栏， 所述微立柱栅栏是多个微立柱排列而成，分别为内侧微立柱栅栏5和外侧微立柱栅栏6。本发明全血离心分离芯片微流体通道4内还可只设有一排微立柱栅栏5，如图1中的(b)所示。微流体通道4绕行中心处的圈数为4圈，各圈之间的间隔为200-400μπι。芯片的进样口 2的直径为500-800 μ m。内侧微立柱栅栏5和外侧微立柱栅栏6将微流体通道4分成内流道41、中间流道42和外流道43。内侧微立柱栅栏5的微立柱之间的距离为3-10μπι，优选为3μπι。外层微立柱栅栏6的微立柱之间的距离为1-3μπι，优选为Ιμπι。内层微立柱栅栏5和外层微立柱栅栏6的截面为圆形或正方形。圆形的分离效果最好，因此内层微立柱5 和外层微立柱6的截面优选为圆形。圆形直径可取为6-30 μ m,正方形边长可取6-30 μ m。 尺寸小于6 μ m时，在加工或分离实验中，易适成立柱断裂，如果尺寸大于30 μ m时，容易加工，但分离沟道中用于分离的缝隙较少，分离效率分降低。利用微型泵或注射泵将混有不同大小的血细胞从芯片的进样口 2注入，利用离心力和微立柱阵列间距大小进行分离，小于内侧微立柱栅栏5间隙的细胞在微流道中运动过程中被分离到中间流道42，而大于内侧微立柱栅栏5间隙的细胞在微流道中运动过程仍在内流道41，小于外侧微立柱栅栏6间隙的细胞在微流道中运动过程中被分离到外流道43，而大于外侧微立柱栅栏6间隙的细胞在微流道中运动过程仍在内流道42。内流道41、中间流道42和外流道43分别对应白细胞出样口、红细胞出样口和血浆出样口。改变芯片1上内侧微立柱栅栏5和外侧微立柱栅栏6的间距，可以用于不同尺寸的血细胞(例如慢回转生物反应器中培养细胞用到的micro beads等)的分离。实施例1 在硅片上加工出离心分离器本实施例的结构参见图1，工艺流程参见图2。1)芯片的硅片结构工艺流程(a)处理、清洗硅片8 ；(b)在硅片正面甩光刻胶9、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀(ICP)硅ΙΟΟμπι左右，形成微流体通道4、微型立柱栅栏5、 6、进样口 2、三个出样口 3 ；2)芯片的盖片聚合物工艺流程(d)处理、清洗硅片8，并在其表面涂上脱模剂10 ；(e)将无气泡的硅橡光刻胶(PDMS) 11均浇在培养皿内，并静置平坦化，然后在 80°C烘箱中烘烤1小时左右；(f)将固化的PDMSll切成与有微流道的硅片一样大，并在相应的进样口和出样口位置打孔。将PDMS和硅结构键合的表面用氧离子处理，适当增加键合强度，否则在进样时会漏液；(g)将PDMS和硅片结构按相应的位置进行键合，安装上进出口的金属管12。实施例2 用聚合物加工出离心分离器本实施例的结构参见图1，工艺流程参见附图3。1)分离器的聚合物结构工艺流程(a)处理、清洗硅片8 ；(b)在硅片正面甩光刻胶9、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀(ICP)硅ΙΟΟμπι左右，形成微流体通道4、微型立柱栅栏、 进样口和出样口；(d)处理、清洗硅结构模具13，并在其表面涂上脱模剂10，将无气泡的PDMSll均浇在硅结构的模具13上，并静置平坦化，然后在80°C烘箱中烘烤1小时左右；(e)将固化了 PDMS从硅模具13上剥离，并切分每个单元；2)盖片聚合物工艺流程(f)处理、清洗硅片8，并在其表面涂上脱模剂10 ；(g)将无气泡的PDMS14均浇在培养皿内，并静置平坦化，然后在80°C烘箱中烘烤 1小时左右；(h)将固化的PDMS14切成与有微流道的硅片一样大，并在相应的进样口和出样口位置打孔；(i)将上下两个键合表面用氧离子处理，适当增加键合强度，否则在进样时会漏液，将两片PDMS按相应的位置进行键合，安装上进出口的金属管12。实施例3 三明治结构的离心分离器本实施例的工艺流程参见图4。
(a)处理、清洗硅片8 ；(b)在硅片正面甩光刻胶9、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀(ICP)硅50 μ m左右，形成微流体通道4、微型立柱栅栏、进样口 2、出样口 3 (与方法一结构类似)；(d)硅片正面与玻璃15阳极键合；(e)将键合后的硅玻璃片的背面减薄硅片，可以采用干法、湿法或CMP的方法；(f)硅片背面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(g)深刻蚀出进出样口 ；(h)将固化的PDMSll切成与硅片一样大，并在相应的进样口和出样口位置打通孔；将PDMS和硅结构键合的表面用氧离子处理，适当增加键合强度，安装上进出口的金属管12。本发明克服了当前分离芯片结构复杂、制备工艺难度大、分离效率低等缺点，实现一个低成本、高性能、高效率的微型片上细胞分离片上集成结构微分析平台，利用MEMS体硅和表面微机械加工技术来制备离心分离器的片上分析系统。最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。
权利要求
1.一种全血离心分离芯片，其特征在于，芯片上设有涡旋式微流体通道，该微流体通道绕行的中心处为进样口，在微流体通道内设有至少一排的微立柱栅栏，所述微立柱栅栏将微流体通道分成两个或多个流道，上述流道连接不同的出样口。
2.如权利要求1所述的全血离心分离芯片，其特征在于，所述微流体通道为半圆对扣形式或阿基米德螺线等任意可展开曲线形式，绕行圈数至少为3圈，每圈的宽度为 50-500 μm0
3.如权利要求2所述的全血离心分离芯片，其特征在于，所述微流体通道内设有两排微立柱栅栏，两个微立柱栅栏将微流体通道分成三个宽度相同的流道，位于微流体通道内侧的微立柱栅栏的立柱间距为3-10 μ m，另一微立柱栅栏的立柱间距为1-3 μ m，两个微立柱栅栏的立柱高度相同或外侧微立柱栅栏的立柱高度略低于内侧微立柱栅栏的立柱高度。
4.如权利要求3所述的全血离心分离芯片，其特征在于，所述微立柱栅栏的每个微立柱的横截面为正方形或圆形，圆形的微立柱的直径至少为6 μ m,正方形的微立柱的边长至少为6μ 。
5.如权利要求1所述的全血离心分离芯片，其特征在于，所述进样口的直径为 500-800 μm0
6.一种权利要求1-5任一项所述全血离心分离芯片的制备方法，其特征在于，包括步骤(1-1)芯片制备；(a)处理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀硅30 200μ m,形成微流体通道、微立柱栅栏、进样口和出样Π ；(1-2)盖片制备；(d)将PDMS与其固化剂按10 1的比例混合，并充分搅拌，用真空泵去除PDMS中的气泡；(e)处理、清洗培养皿，并在其表面涂上脱模剂；(f)将无气泡的PDMS均浇在培养皿内，并静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤30分钟到1小时；(g)将固化的PDMS切成与具有微流体通道的硅片同样大小，并在相应的微流体通道进样口和出样口位置打若干个通孔；(1-3)盖片和芯片键合；(h)将PDMS和硅片键合的表面用氧离子处理；(i)将PDMS和硅片按相应的位置进行键合，在微流体通道进样口和出样口安装金属管。
7.—种权利要求1-5任一项所述全血离心分离芯片片的制备方法，其特征在于，包括步骤(1-1)芯片制备；(a)处理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀硅30 200μ m,形成微流体通道、微立柱栅栏、进样口和出样口的模具；(d)将PDMS与其固化剂按10 1的比例混合，并充分搅拌，用真空泵去除PDMS中的气泡；(e)处理、清洗所述模具，并在其表面涂上脱模剂；(f)将无气泡的PDMS均浇在模具上，静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤30分钟到1 小时；(g)将固化了PDMS从模具上剥离，并切分每个单元； (1-2)盖片制备；(h)处理、清洗培养皿，并在其表面涂上脱模剂；(i)将无气泡的PDMS均浇在培养皿内，静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤1小时； (j)将固化的PDMS切成与具有微流体通道的硅片同样大小，并在相应的微流体通道进样口和出样口位置打若干个通孔； (1-3)盖片和芯片键合；(k)将PDMS的上下两个键合表面用氧离子处理；(1)将两片PDMS按相应的位置进行键合，在进样口和出样口安装金属管。
8. —种权利要求1-5任一项所述全血离心分离芯片的制备方法，其特征在于，包括步骤(1-1)芯片制备；(a)处理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(c)在硅片正面深刻蚀硅30 200μ m,形成微流体通道、微立柱栅栏；(d)将硅片正面与玻璃阳极键合，形成硅玻璃片；(e)采用干法、湿法或CMP的方法将键合后的硅玻璃片背面的硅结构层减薄；(f)硅片背面甩光刻胶、前烘、光刻、显影、后烘；(g)深刻蚀进、出样口； (1-2)盖片制备；(h)将PDMS与其固化剂按10 1的比例混合，并充分搅拌，用真空泵去除PDMS中的气泡；处理、清洗培养皿，并在其表面涂上脱模剂；将无气泡的PDMS均浇在培养皿内，并静置平坦化，然后在80度烘箱中烘烤30分钟到1小时；(i)将固化的PDMS切成与具有微流道的硅片同样大小，并在相应的微流体通道进样口和出样口位置打若干个通孔；(1-3)盖片和芯片键合；(j) PDMS和硅玻璃片键合的表面用氧离子处理，键合并安装上进出口的金属管。
全文摘要
本发明公开了一种全血离心分离芯片，属于微机电系统领域。本发明在芯片上设有涡旋式微流体通道，该微流体通道绕行的中心处为进样口，在微流体通道内设有至少一排的微立柱栅栏，微立柱栅栏将微流体通道分成两个或多个流道，流道连接不同的出样口。本发明利用微泵将全血样品注入离心分离芯片后，通过微立柱栅栏间的缝隙将细胞与血浆分离。本发明结构紧凑，芯片的总面积减小，分离效率提高，且该芯片的分离过程耗时短。
文档编号G01N33/48GK102175840SQ201010614438
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者李志宏, 王玮, 耿照新, 鞠衍睿 申请人:北京大学