专利名称：抗-cmet抗体及其用于癌症的检测和诊断的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及在患者中预后和/或诊断增殖性疾病的领域。更为具体地，本发明涉及能够特异性结合人CMet受体的新型抗体、以及此抗体的氨基酸序列和编码此抗体的核酸序列。本发明同样包括所述抗体用于检测和诊断与cMet表达有关的病理性过度增殖性致癌疾病的用途，以及相应的方法。在某些实施方案中，所述疾病是与相对于正常提高的cMet多肽表达有关的致癌疾病、或者任何与cMet过度表达相联系的其它病理。本发明最后还包括产品和/或组合物或试剂盒，其至少包含用于某些癌症预后或诊断的这种抗体。
背景技术：
受体酪氨酸激酶(RTK)靶向的药物，比如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、伊马替尼和吉非替尼抑制剂，已显示出对靶向此类蛋白质用于治疗某些癌症的兴趣。cMet, RTK亚家族的原型成员，所述亚家族还包括RON和SEA。所述cMetRTK亚家族结构上不同于其它RTK家族，是唯一已知的肝细胞生长因子(HGF)的高亲和性受体，也作离散因子(SF)。(D. P. Bottaro 等，Science 1991, 251,802-804 ;L. Naldini 等人，Eur.Mol. Biol. Org. J. 1991，10 :2867-2878)。cMet和HGF广泛表达于多种组织，通常其表达分别限于上皮和间充质来源的细胞(M. F. Di Renzo等人，Oncogene 1991,6 =1997-2003 ；E. Sonnenberg等人，J. Cell. Biol. 1993，123 :223-235)。他们都是哺乳动物正常发育所需要的，在细胞迁移、形态分化、和三维小管结构的组织以及生长和血管生成方面显得尤其重要(F. Baldt 等人，Nature 1995，376 :768-771 ；C. Schmidt 等人，Nature. 1995 :373 699-702 ；Tsarfaty 等，Science 1994，263 :98-101)。然而，cMet 和 HGF 的受控调节在哺乳动物发育、组织的维持和修复中显得重要(Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, KamiguchiH,Shibuya M,Katoh Y，Itoh J,Shinohara Y. , Brain Res. 2004，5 ；999 (2) :155-66 ；TaharaY, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H. , J PharmacolExp Ther. 2003,307(1) :146-51)，其失调与癌症进展有关。不适当的cMet激活导致的异常信号驱动是人类癌症中观察到的最频繁的变化之一，并在肿瘤发生和肿瘤转移中发挥重要作用(Birchmeier等人，Nat. Rev. Mol. CellBiol. 2003,4 :915-925 ；L.Trusolino and Comoglio P. M. , Nat Rev.Cancer. 2002, 2(4)289-300)。可通过配体依赖性和非依赖性机制引发不适当的cMet激活，其包括cMet的过度表达、和/或旁分泌或自分泌激活、或通过功能获得突变(J. G. Christensen, Burrows J.和Salgia R.，Cancer Latters. 2005，226 :1-26)。然而，存在或不存在配体，需要 cMet 受体的低聚反应来调节激酶对ATP和含酪氨酸的肽底物的结合亲和性和结合动力学(Hays JL,Watowich SJ, Biochemistry, 2004Aug 17,43:10570-8)。激活的 cMet 召集信号效应分子至其位于细胞质结构域的多停靠位点，导致多种关键信号通路的激活，包括Ras-MAPK、PI3K、Src 和 Stat3(Gao CF, Vande Woude GF, CellRes. 2005,15(1) :49-51 ；Furge KA,Zhang YW，Vande Woude G F, Oncogene. 2000,19(49) :5582-9)。这些通路对于肿瘤细胞增殖、侵入和血管生成以及躲避细胞凋亡是必需的(Furge KA, Zhang Yff, Vande WoudeGF, Oncogene,2000,19(49) :5582-9 ;Gu H， Neel BG, Trends Cell Biol.2003Mar,13(3)122-30 ；Fan S, Ma YX, Wang JA,Yuan RQ, Meng Q,Cao Y,Laterra JJ,Goldberg ID, RosenEM, Oncogene. 2000Apr 27,19(18) :2212-23)。此外，相对于其它 RTK，cMet 信号的独特方面在于其被报道和局部粘着复合物和非激酶结合伙伴(partner)比如a 63 4整联蛋白(Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell. 2001,107 :643-54)、CD44v6 (Van derVoort R, TaherTE, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G,Gherardi E, Pals ST, J Biol Chem. 1999, 274 (10) :6499-506)、Plexin BI 或脑信号蛋白(Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, TamagnoneL, Comoglio PM, Nat Cell Biol.2002,4(9) :720-4 ；Conrotto P, Valdembri D, Corso S,Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005,105(11)4321-9 ；Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004,23 :5131-7)相互作用，可通过此受体进一步增加细胞功能调节的复杂性。最后，最近的数据说明cMet可参与肿瘤对吉非替尼或厄洛替尼的抗性，这表明靶向EGFR和cMet的化合物的组合可能尤其受到关注(Engelman JA等人，Science, 2007, 316 :1039-43)。
在过去的几年里，已经发展出很多不同的策略来减弱cMet在癌细胞系中的信号。这些策略包括 i)中和抗 cMet 或 HGF/SF 的抗体(Cao B, Su Y, Oskarsson M, ZhaoP, KortEJ,Fisher RJ,ffang LM,Vande Woude GF,Proc Natl Acad Sci USA.2001，98 (13) :7443-8 ；Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, SchwalIR, WestphalM, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006,12(20) :6144-52)或使用 HGF/SF 拮抗剂 NK4 来防止配体结合至 cMet (Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T,Cancer Res. ,2000,60 =6737-43), ii)对cMet的小ATP结合位点抑制剂，其阻断激酶的活性(Christensen JG,Schreck R,Burrows J,Kuruganti P, Chan E,Le P, Chen J, Wang X,Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB,Cancer Res. 2003,63 :7345-55)，iii)干扰接近多停靠位点的工程SH2结构域多肽，以及降低受体或配体表达的RNAi或核酶。大多数这些方法显示出cMet的选择性抑制,导致肿瘤抑制并表明cMet在癌症中的治疗性干预可受到关注。本发明目的在于提供至少一种可用作诊断或预后生物标志物的试剂，其以用于检测和/或监测致癌疾病，尤其是那些特征在于cMet表达或那些异常cMet表达介导的致癌性疾病。之前尚未报到过开发可用作诊断或预后工具的有价值的抗体的尝试。此处所述的是满足此原则的新型抗体。
发明内容
通过如下详细的描述和实施例，本发明的其它特征和优点将变得清楚。第一方面，本发明的受试者是分离的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其以高度的亲和性结合至cMet受体(cMet)优选人类cMet,并可因此用于诊断由cMet表达介导的病理性过度增殖致癌疾病的方法。所述表达“功能片段和/或衍生物”将随后在本说明书中详细定义。
此处必须了解，本发明不涉及天然形式的抗体，就是说他们不处于其天然环境中，但他们能够自天然来源通过纯化分离或获得、或者通过遗传重组、或者通过化学合成获得，然后他们可以包含非天然氨基酸，正如将在此后描述。
更加具体地，根据本发明的另一方面，涉及能够特异性结合至cMet的分离的抗体、或其功能片段或衍生物之一的权利，其尤其能够结合cMet，所述抗体特征在于其包括至少一个选自包括氨基酸序列SEQ ID No. I至12或29至39的⑶R的互补决定区(OTR)，或者包括至少一个最佳比对之后其序列和序列I至12或29至39具有至少80%、优选85%、90%、95%和 98% —致性的 CDR。抗体的“功能片段”表示，尤其是，抗体片段，比如片段Fv、scFv (sc =简单链)、Fab、F(ab’ )2,Fab\scFv-Fc或双特异抗体、或任何半衰期延长的片段。本说明书中将随后详细描述这种功能片段。抗体的“衍生化合物”或“衍生物”表示，尤其是，由肽支架和为了保留其被识别的能力的至少一个原始抗体CDR组成的结合蛋白。这种本领域技术人员公知的衍生化合物，将随后在本说明书中详细描述。更优选，本发明包括根据本发明通过遗传重组或化学合成获得的抗体、其衍生化合物或其功能片段。根据优选实施方案，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于其由单克隆抗体组成。“单克隆抗体”理解为表示来自早期同种抗体群的抗体。更具体地，除了以最小比例可以发现的少数可能天然存在的突变外，群的各个抗体是一致的。换言之，单克隆抗体由来自单细胞克隆(例如杂交瘤、转染有编码同种抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染有编码同种抗体的DNA分子的原核宿主细胞等)生长的同种抗体组成，通常其由一类且仅一类及亚类的重链和仅一种类型的轻链表征。单克隆抗体是高度特异性的，并针对单一抗原。此夕卜，和制备多克隆抗体(其通常包括针对多种决定簇、或表位的多种抗体)对比，各单克隆抗体针对单个抗原表位。此处必须了解，本发明不涉及天然形式的抗体，S卩，他们不取自其天然环境，但他们通过自天然来源纯化分离或获得、或者通过遗传重组或者通过化学合成获得，因此他们可以带有非天然氨基酸，正如将在此后描述的。在本发明的第一和优选实施方案中，将根据IMGT编号系统定义抗体的CDR。无论抗原受体、链的类型、或物种如何，IMGT独特编号限于用来比较可变结构域(Lefranc M. -P. , Immunology Today 18,509 (1997)/Lefranc M. -P. , TheImmunologist,7,132-136 (1999) /Lefranc, M. -P. , Pommie, C. , Ruiz, M. , Giudicelli, V. , Foulquier, E.,Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev. Comp. Immunol. ,27,55-77(2003))。在IMGT独特编号中，保守的氨基酸总是具有相同的位点，例如半胱氨酸23(第一 -CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二 -CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或J-TRP)。MGT独特编号提供框架区的标准界限(FR1-MGT :位点I至26、FR2-IMGT 39 至 55.FR3-IMGT 66 至 104 以及 FR4-IMGT :118 至 128)以及互补决定区的标准界限:CDRHMGT :27 至 38、CDR2-IMGT 56 至 65 以及 CDR3-IMGT :105 至 117。正如间隔代表未占据的位点，CDR-IMGT长度(显示于括号之间，并由点隔开，如(8.8. 13))成为重要的信息。在二维图示中使用IMGT独特编号，指定为IMGT Colliers de Perles (Ruiz,M.和Lefranc,M. -P. ,Immunogenetics,53,857-883(2002) /Kaas, Q.和 Lefranc, M. -P. , CurrentBioinformatics，2，21-30 (2007))，以及三维结构于頂GT/3D 结构-DB 中(Kaas, Q.，Ruiz,M.和Lefranc,M.-P. ,T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res. ,32,D208-D210(2004))。存在三个重链⑶R和三个轻链⑶R。术语⑶R此处用于表示，根据情况，一个或多个、或甚至全部这些区，所述区含有大部分和结合有关的氨基酸残基，其中所述结合是通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和性。
更具体地，根据第一方面，本发明涉及能够特异性结合C-Met蛋白的分离的抗体、或其功能片段或衍生物，其包括i)包括至少如下根据MGT编号系统所定义的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3之一的重链，其中CDR-Hl包括序列SEQ ID No. 55，CDR-H2包括序列SEQID No. 56，以及CDR-H3包括序列SEQ ID如.57;和/或11)包括至少如下根据IMGT编号系统所定义的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3之一的轻链，其中CDR-Ll包括序列SEQ ID No. 58，CDR-L2 包括序列 SEQ ID No. 59 以及 CDR-L3 包括序列 SEQ ID No. 60。在优选实施方案中，本发明涉及分离的抗体、或其功能片段或衍生物，其能够特异性结合c-Met蛋白，特征在于其包括i)包括至少如下三个根据MGT编号系统所定义的CDRCDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3 的重链，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQ ID No. 55，CDR-H2 包括序列SEQ ID No. 56，以及CDR-H3包括序列SEQID No. 57 ;和/或ii)包括至少如下三个根据頂GT编号系统所定义的⑶R⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的轻链，其中⑶R-Ll包括序列SEQ IDNo. 58，CDR-L2 包括序列 SEQ ID No. 59 以及 CDR-L3 包括序列 SEQ ID No. 60。为了清楚，本发明的一致序列SEQ ID No. 55至60总结于下表I。表I
权利要求
1.一种分离的抗体、或其功能片段或衍生物，其能够特异性结合C-Met蛋白，其特征在于其包括i)包括至少如下三个根据頂GT编号系统所定义的CDRCDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-Hl包括序列SEQ ID No. 55，CDR_H2包括序列SEQ ID No. 56，以及CDR-H3包括序列SEQ ID No. 57 ;和/或ii)包括至少如下三个根据MGT编号系统所定义的⑶RCDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 的轻链，其中 CDR-Ll 包括序列 SEQ ID No. 58，CDR-L2 包括序列SEQ IDNo. 59 以及 CDR-L3 包括序列 SEQ ID No. 60。
2.根据权利要求I所述的抗体、或其功能片段或衍生物，其特征在于其包括选自如下的重链 a)包括如下三个根据MGT编号系统所定义的CDR的重链，分别地，具有序列SEQIDNo. 7 的 CDR-H1，具有序列 SEQ ID No. 2 的 CDR-H2,以及具有序列 SEQ ID No. 8 的 CDR-H3 ；以及 b)包括如下三个根据MGT编号系统所定义的CDR的重链，分别地，具有序列SEQIDNo. 29 的 CDR-Hl，具有序列 SEQ ID No. 30 的 CDR-H2，以及具有序列 SEQ ID No. 31 的 CDR-H3。
3.根据权利要求I所述的抗体、或其功能片段或衍生物，其特征在于其包括选自如下的轻链 a)包括如下三个根据MGT编号系统所定义的CDR的轻链，分别地，具有序列SEQIDNo. 4 的 CDR-L1，具有序列 SEQ ID No. 5 的 CDR-L2,以及具有序列 SEQ ID No. 6 的 CDR-L3 ；以及 b)包括如下三个根据MGT编号系统所定义的CDR的轻链，分别地，具有序列SEQIDNo. 32 的 CDR-Ll，具有序列 SEQ ID No. 33 的 CDR-L2，以及具有序列 SEQ ID No. 34 的 CDR-L3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体、或其功能片段或衍生物，其特征在于其选自如下 a)抗体、或其功能片段或衍生物，包括 -包括如下三个根据頂GT所定义的⑶R的重链，分别地，具有序列SEQ IDNo. 7的CDR-Hl，具有序列SEQ ID No. 2的CDR-H2以及具有序列SEQ ID No. 8的CDR-H3 ;以及 -包括如下三个根据頂GT所定义的⑶R的轻链，分别地，具有序列SEQ IDNo. 4的CDR-Ll，具有序列SEQ ID No. 5的CDR-L2以及具有序列SEQ ID No. 6的CDR-L3 ;以及 b)抗体、或其功能片段或衍生物，包括 -包括如下三个根据MGT所定义的⑶R的重链，分别地，具有序列SEQ IDNo. 29的CDR-H1，具有序列SEQ ID No. 30的CDR-H2以及具有序列SEQ ID No. 31的CDR-H3 ;以及 -包括如下三个根据頂GT所定义的⑶R的轻链，分别地，具有序列SEQ IDNo. 32的CDR-Ll，具有序列 SEQ ID No. 33 的 CDR-L2 以及具有序列 SEQ ID No. 34 的 CDR-L3。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体、或其功能片段或衍生物，其特征在于其选自如下 a)抗体、或其功能片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQID No. 13的重链可变结构域序列和包含氨基酸序列SEQ ID No. 14的轻链可变结构域序列；以及 b)抗体、或其功能片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQID No. 40的重链可变结构域序列和包含氨基酸序列SEQ ID No. 41的轻链可变结构域序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体、或其功能片段或衍生物，其特征在于其是鼠科抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项的所述抗体、或其功能片段或衍生物，其特征在于其不阻断配体HGF对c-Met蛋白的结合。
8.一种鼠科杂交瘤，其能够分泌如权利要求1-7任一项所述的抗体，所述鼠科杂交瘤选自于2008年3月12日保藏于CNCM，法国巴黎巴斯德研究所，号码为1-3949以及于2010年01月14日保藏于CNCM，法国巴黎巴斯德研究所，号码为1-4273的杂交瘤。
9.一种分离的核酸，其特征在于其选自如下核酸 a)编码如权利要求1-7任一项所要求的抗体的核酸，DNA或RNA； b)包括包含选自序列SEQID No. 15至26或42至52的序列的DNA序列的核酸； c)包括包含序列SEQID No. 27、28、53或54的序列的DNA序列的核酸； d)a)、b)或c)中所定义的核酸所对应的RNA核酸； e)a)、b)和c)中所定义的核酸的互补核酸；以及 f)至少18个核苷酸的核酸，其能够在高度严格的条件下，和序列SEQID No. 15至28或42至54、或其互补序列的至少一个⑶R杂交。
10.权利要求I至7任一项所述的抗体、或其功能片段或衍生物用于体外诊断和c-Met表达有关的致癌疾病、或用于体外确定发展和c-Met表达有关的致癌疾病的预后的用途。
11.一种体外检测受试者中c-Met表达肿瘤的存在和/或位点的方法，其中所述方法包括步骤(a)用如权利要求I至7中任一项所述的抗体、或其功能片段或衍生物接触来自受试者的样本，以及(b)检测所述抗体和样本的结合。
12.—种体外确定来自受试者的c-Met表达肿瘤中c-Met表达水平的方法，其中所述方法包括步骤(a’)用如权利要求I至7任一项所述的抗体、或其功能片段或衍生物接触来自受试者的样本，以及(b’ )定量确定抗体在所述样本中结合c-Met的水平。
13.根据权利要求12所述的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)测量c-Met表达水平。
14.一种体外诊断受试者中c-Met表达肿瘤或体外确定患者中发展c-Met表达肿瘤的预后的方法，其中所述方法包括步骤⑴根据权利要求12确定c-Met表达水平，以及(ii)比较步骤(i)的表达水平和来自正常组织的c-Met的参考表达水平。
15.一种体外确定受试者的肿瘤c-Met等级的方法，其中所述方法包括步骤(I)根据权利要求12确定c-Met表达水平，(2)为所述肿瘤c-Met表达水平评分，以及(3)比较所述评分和获自对照样本的评分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述评分包括使用基于两个参数的适当等级，其中所述两个参数是染色强度和阳性细胞百分比。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述适当等级是O至3+的等级，其中没有肿瘤细胞膜反应性得分为0，在10%以上肿瘤细胞中强烈完整的反应性得分为3+。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述适当等级是O至3+的等级，其中没有肿瘤细胞膜反应性得分为O ;在10%以上肿瘤细胞中微弱察觉的膜反应性得分为1+ ;在10%以上肿瘤细胞中从弱到中等完整的膜反应性得分为2+ ；以及在10%以上肿瘤细胞中强烈完整的反应性得分为3+。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述肿瘤是得分为2+或3+的c-Met(+)。
20.一种确定致癌疾病对用抗-c-Met抗体、或其片段或衍生物的治疗是否敏感的方法，其中所述方法包括步骤(a)根据权利要求19体外确定受试者的肿瘤c-Met等级，以及(b)如果等级是c-Met (+)，确定致癌疾病对用抗-c-Met抗体、或其片段或衍生物的治疗敏感。
21.一种包括至少如权利要求I至7任一项所述的抗-c-Met抗体、或其功能片段或衍生物的试剂盒，所述抗体优选是经标记的。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其用于在受试者中体外检测c-Met表达肿瘤的存在和/或位点，所述试剂盒还包括用于检测所述抗-c-Met抗体和c-Met之间结合范围的试剂。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其用于在c-Met表达肿瘤中体外确定c-Met的表达水平，所述试剂盒还包括用于定量所述抗-c-Met抗体和c-Met之间结合水平的试剂。
24.根据权利要求21或22所述的试剂盒，其用于体外确定肿瘤的c-Met等级，所述试剂盒还包括 i)用于检测所述抗-c-Met抗体和c-Met之间结合范围的试剂；以及 ii)用于c-Met表达水平评分的阳性和阴性对照样本。
25.根据权利要求24的试剂盒，其用于体外确定肿瘤的c-Met等级，所述试剂盒还包括专门针对鼠科抗体的多克隆抗体，优选所述专门针对鼠科抗体的多克隆抗体是经标记的。
全文摘要
本发明涉及在患者中预后和/或诊断增殖性疾病的领域。更为具体地，本发明涉及能够特异性结合人cMet受体的抗体、以及此抗体的氨基酸序列和编码此抗体的核酸序列。本发明同样包括所述抗体用于检测和诊断与cMet表达有关的病理性过度增殖性致癌疾病的用途，以及相应的方法。在某些实施方案中，所述疾病是与相对于正常提高的cMet多肽表达有关的致癌疾病、或者任何与cMet过度表达相联系的其它病理。本发明最后还包括产品和/或组合物或试剂盒，其至少包含用于某些癌症的预后或诊断的这种抗体。
文档编号G01N33/577GK102639564SQ201080036635
公开日2012年8月15日 申请日期2010年8月23日 优先权日2009年8月21日
发明者A·茹阿诺, L·格奇 申请人:皮埃尔法布雷医药公司