用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验的制作方法

专利名称：用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验的制作方法
用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验相关申请的交叉参考本申请要求2009年10月20日提交的美国临时申请号61/253，393、2010年2月16日提交的美国临时申请号61/305，084、2010年4月23日提交的美国临时申请号61/327，487和2010年9月15日提交的美国临时申请号61/383，037的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
背景技术：
融合蛋白还称为嵌合蛋白，是通过连接两个或多个原始编码分离蛋白的基因产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有衍生自各原始蛋白的功能性质的单一多肽。当大规模突变(通常是染色体移位)产生含两个不同基因的部分编码序列的新编码序列时，出现嵌合突变蛋白。天然产生的融合蛋白在癌症中很重要，其中所述蛋白起癌蛋白的作用。 BCR-ABL融合蛋白是致癌融合蛋白的熟知示例。其被认为是慢性髓细胞性白血病(CML)的主要致癌驱动物，但其还与急性淋巴细胞白血病相关。事实上，CML的细胞遗传学特征是费城染色体(Ph)，其形成编码210kDa蛋白的BCR-ABL融合基因。确实，产生的BCR-ABL融合蛋白是对CML发病机理关键的活性酪氨酸激酶。尽管伊马替尼(GleeveP)目前是新诊断的CML患者的一线疗法，但约20-25%的患者没有实现持久的完全细胞遗传学反应。研究显示存在连续伊马替尼治疗时BCR-ABL信号传导的再激活是产生抗性的主要原因。在大多数患者中，再激活是BCR-ABL激酶结构域中突变的结果，所述突变损害伊马替尼结合并诱导药物抗性。因此，发现BCR-ABL活性的检测可用于预测对用酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的治疗响应以及鉴定对所述抑制剂产生抗性的患者。当前，可用的检测BCR-ABL活性的方法依赖于对BCR-ABL底物-磷酸化CRKL (pCRKL)的测量。例如 La Rosee^ (Haematologica, 93:765-9 (2008))描述了 Western印迹分析总白细胞裂解物以检测替代BCR-ABL活性的pCRKL水平(也参见，Hochhaus等，Leukemia, 16:2190-6(2002) ;White 等，J. Clin. Oncol.，25:4445-51 (2007))。相似地，Khorashad等(Haematologica, 94:861-4(2009))描述了基于流式细胞分析的方法测量pCRKL 水平以评估 BCR-ABL 活性(也参见，Hamilton 等，Leukemia, 20:1035-9 (2006))。然而，这些方法缺少测定样品中BCR-ABL活性存在或水平所需的特异性和灵敏度，因为它们是依赖于检测替代蛋白磷酸化的单一抗体试验。因此，需要检测BCR-ABL活性以及其他致癌融合蛋白活性的特异性和灵敏方法用于诊断、预后和治疗目的。本发明满足这种需要，并提供相关优点。发明概述本发明提供用于检测生物样品如全血(如从分离的稀有循环细胞或白细胞制备的裂解物)或肿瘤组织(如细针吸出物)中一种或多种致癌融合蛋白的活性状态和/或总量的基于抗体的阵列及其使用方法。在某些情况下，样品中存在的所述致癌融合蛋白的活性状态和/或总量可与一种或多种信号转导分子联合测量。本发明的组合物和方法具有酶联免疫吸附实验相关的特异性、信号放大相关的敏感性、和微阵列相关的高通量多重性的优势。在一个方面，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括(a)将细胞提取物与特异于第一全长蛋白的第一结构域的第一结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转化为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不存在，所述融合蛋白包含与第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第二不同结构域。(b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白的细胞提取物；(C)将步骤(b)中的细胞提取物与特异于所述第一全长蛋白的第二不同结构域的第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转化为含所述致癌融合蛋 白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和(d)测定步骤(C)中复合物的水平或活化状态，从而测定所述致癌融合蛋白的水平或活化状态。在具体实施方式
中，测定致癌融合蛋白的水平或激活状态包括检测致癌融合蛋白(如细胞提取物中)的表达(如浓度)水平和/或活化(如磷酸化)。在优选实施方式中，本发明的步骤(C)和(d)包括本文所述的酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞分析、标签分选试验或邻近双检测(proximity dual detection)试验。在邻近双检测试验的一个具体实施方式
中，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括(a)用致癌融合蛋白特异性捕获抗体的稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的致癌融合蛋白，其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上，其中所述致癌融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。(b)用特异于所述致癌融合蛋白的第二结构域的至少两种类型检测抗体孵育所述多种捕获的致癌融合蛋白，形成多种捕获的可检测致癌融合蛋白，其中所述检测抗体包括(I)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，和(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述协助部分生成传送至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂；(C)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测致癌融合蛋白，生成放大的信号；和(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。在邻近双检测试验的另一个具体实施方式
中，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括(a)用致癌融合蛋白特异性捕获蛋白的稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的致癌融合蛋白，其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上，其中所述致癌融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。(b)用至少两种类型的检测抗体孵育所述多种捕获的致癌融合蛋白，形成多种捕获的可检测致癌融合蛋白，其中所述检测抗体包括(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性 抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域，和(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态依赖性抗体，其中所述活化状 态依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第二结构域，其中所述协助部分生成传送至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测致癌融合蛋白，生成放大的 信号；和(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。在另一方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降 低毒性的方法，所述方法包括(a)给予抗癌药后分离癌细胞；(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或活化水 平；和(d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白 的表达和/或活化水平作比较；和(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的 疗程。在某些实施方式中，除了一种或多种致癌融合蛋白以外，还检测存在于所述细胞 提取物中的一种或多种信号转导分子。信号传导的示例包括但不限于，受体酪氨酸激酶、非 受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号级联组分、和/或所述一种或多种致癌融合蛋白的底物 (如BCR-ABL底物)。在一些情况中，用本文所述方法检测所述信号转导分子，除了根据试验 有两种抗体(即所述捕获抗体和所述检测抗体)或三种抗体(即所述捕获抗体和两种检测抗 体)针对相同蛋白。在其他情况中，用本领域技术人员已知的任何方法检测所述信号转导分 子。在具体实施方式
中，用本文所述试验(如免疫试验)联合检测一种或多种致癌融合蛋白 以及存在于所述细胞提取物中的一种或多种信号转导分子。在某些实施方式中，本发明还提供实施本文所述邻近双检测试验的试剂盒，所述 试剂盒包括(a) —种或多种限制在固体支持物上的捕获抗体稀释系列，其中所述捕获抗 体特异于一种或多种感兴趣的分析物(如致癌融合蛋白或信号转导分子)；和(b)各感兴 趣的分析物的多种(如至少两种类型)检测抗体。所述试剂盒还任选包含其他试剂例如 所述信号放大对的第一和第二元件。通过以下详细说明和附图，本领域技术人员能明白本发明的其它目的、特征和优
附图简要说明

图1显示本发明试验形式的一个实施方式，其依赖于两种与酶相连的额外检测抗 体的共定位，用于每结合靶标致癌融合蛋白的后续通道事件。图2显示本发明的阵列在整个癌症治疗过程中的药物选择上的应用。图3A-D显示本发明检测致癌融合蛋白如BCR-ABL的表达和活化水平的试验形式的各种实施方式。图4显示移除游离的BCR后K562细胞中的BCR-ABL信号。图5显示移除游离的BCR后K562细胞中的BCR信号。图6显示K562细胞中BCR-ABL的总水平和磷酸化水平的检测。图7显示用或不用BCR C末端抗体偶联珠消耗游离BCR的情况下，K562人慢性 髓细胞性白血病细胞中检测的BCR-ABL的磷酸化水平(“磷酸化BCR-ABL”)和总量(“总 BCR-ABL”)。图8显示用或不用BCR C末端抗体偶联珠移除游离BCR的情况下，K562细胞中的 磷酸化BCR-ABL信号。具体地，图8A提供移除或不移除全长BCR (( “非珠处理”=BCR未移 除与“珠处理”=BCR用含所述全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除)的K562细胞裂解 物中检测的磷酸化BCR-ABL信号的微阵列比较。图8B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧 光单位(RFU)随着细胞数量而变化。图9显示用或不用BCR C末端抗体偶联珠移除游离BCR的情况下，K562细胞中的 总BCR-ABL信号。具体地，图9A提供移除或不移除全长BCR (( “非珠处理”=BCR未移除与 “珠处理” =BCR用含全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除)的K562细胞裂解物中检测 的总BCR-ABL信号的微阵列比较。图9B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU) 随着细胞数量而变化。图10显示K562细胞提取物与偶联BCR C末端抗体的珠接触后从所述细胞提取物 中移除游离的全长BCR。具体地，图10A提供移除或不移除全长BCR (( “非珠处理”=BCR未 移除与“珠处理”=BCR用含所述全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除)的K562细胞裂 解物中检测的总BCR信号的微阵列比较。图10B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单 位(RFU)随细胞数量而变化。图11显示白细胞(WBC)中存在游离的全长BCR和ABL蛋白，但没有BCR-ABL融合蛋白。图12显示K562细胞提取物中掺入WBC提取物时，WBC中存在的游离全长BCR抑 制所述K562细胞提取物中的磷酸BCR-ABL信号。图13显示用BCR C末端抗体偶联珠移除游离BCR后，掺入WBC提取物的K562细 胞中的总BCR-ABL信号。具体地，图13A显示K562细胞提取物中掺入WBC提取物时，游离 BCR信号饱和。用偶联BCR C末端抗体的珠治疗后，所述游离BCR被移除。图13B显示在相 同实验中用或不用珠处理情况下，BCR-ABL信号没有变化。图14显示BCR-ABL抑制剂伊马替尼(Gleevec )在K562细胞中剂量依赖性抑制 BCR-ABL蛋白的活化(即磷酸化)，而非其表达(即总水平)。图15显示BCR-ABL抑制剂尼洛替尼(Tasigna )在K562细胞中剂量依赖性抑制 BCR-ABL蛋白的活化(即磷酸化)，而非其表达(即总水平)。图16显示BCR-ABL抑制剂达沙替尼(Sprycel )在K562细胞中剂量依赖性抑制
BCR-ABL蛋白的活化(即磷酸化)，而非其表达(即总水平)。图17显示CRKL在K562细胞中存在并活化(即磷酸化)。图18显示CRKL在A431人表皮样癌细胞中存在并在EGF处理后活化(即磷酸化)。
图19显示CRKL在T47D人乳腺导管上皮肿瘤细胞中存在但在EGF处理后未活化 (即磷酸化)。图20显示CRKL在T47D细胞中存在并在调蛋白(HRG)处理后低水平活化(即磷酸 化)。图21显示CRKL在MCF-7人乳腺癌细胞中存在并在调蛋白(HRG)处理后低水平活 化(即磷酸化)。图22表示不同供体的白细胞(WBC)中存在活化(即磷酸化)的CRKL。图23表示JAK2在K562细胞和A431细胞中活化(即磷酸化)。图24表示可检测并测量用抗CD45磁珠从血液中分离的K562细胞所制备的细胞 裂解物中磷酸化的BCR-ABL。图25显示当针对天然全长BCR C末端的抗体(BCR-ABL中不存在C末端结构域)与 针对BCR-ABL的N末端区域的抗体点样在同一板的同一片上时，总BCR-ABL水平不变化。图26显示当针对天然BCR C末端的抗体点样在同一板的同一片上时，用N末端特 异性BCR抗体检测到的游离天然BCR信号下降。发明详述导言血液恶性肿瘤是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。由于这三种通过免疫系统 密切相连，影响所述三种之一的疾病常还会影响其他两种。例如，尽管淋巴瘤严格意义上 是淋巴结疾病，但其常扩散到骨髓和血液中。产生具有含两种不同基因部分编码序列的新 编码序列的融合蛋白的染色体易位是这些疾病的常见病因，但对于实体瘤是不太常见的病 因。因此，重要的是鉴定关联血液恶性肿瘤的致癌融合蛋白的存在和/或活性从而为这类 癌症患者提供合适的预后和治疗。例如，所述BCR-ABL融合蛋白与慢性髓细胞性白血病(CML)以及急性淋巴细胞白 血病(ALL)相关。具体地，所述BCR-ABL蛋白是对癌症发病机理关键的活性酪氨酸激酶。尽 管伊马替尼(Gleevec )目前是新诊断的CML患者的一线疗法，但约20-25%的患者没有实 现持久的完全细胞遗传学反应。研究显示存在连续伊马替尼治疗时BCR-ABL激酶活性的再 激活是产生抗性的主要原因。因此，发现BCR-ABL活性的检测可用于预测对用酪氨酸激酶 抑制剂的治疗响应以及鉴定对所述抑制剂产生抗性的患者。本发明提供用基于抗体的阵列试验系统检测分离细胞中一种或多种融合蛋白(单 独或与一种或多种信号转导分子联合)的活化状态和/或总量的方法。从分离的白细胞、循 环细胞、或其他细胞类型制备的细胞提取物在本文所述方法中尤其有用。在一些实施方式 中，本发明的多重、高通量免疫试验可在单细胞水平检测一种或多种致癌融合蛋白和/或 信号转导分子的活化状态。事实上，信号转导分子如EGFR可用约100仄摩尔(zeptomole (10_21摩尔)的灵敏度和约100仄摩尔到约100飞摩尔的线性动态范围检测。因此，一种或 多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活性状态的单细胞检测有助于癌症预后和诊断 以及个性化、靶向治疗的设计。图I说明本发明的示例性邻近双检测试验，其中致癌融合蛋白如BCR-ABL结合捕 获抗体和两种检测抗体(即活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体)。所述捕获抗体 I结合融合蛋白的BCR部分而不依赖于其活化状态。活化状态非依赖性抗体2结合融合蛋白的ABL部分而不依赖于其活化状态，活化状态依赖性抗体3根据活化状态结合融合蛋白 的ABL部分(如活化状态依赖性抗体仅结合具有磷酸化残基的BCR-ABL的活化形式)。活化 状态非依赖性抗体用协助部分4 (“酶A”)标记且活化状态依赖性抗体用信号放大对5的第 一元件(“酶B”)标记。两种检测抗体与所述融合蛋白的ABL部分的结合使所述协助部分与 所述信号放大对的第一元件足够邻近，从而所述协助部分生成的信号可传至所述信号放大 对的第一元件，因而生成可检测和/或可放大信号。本文描述本领域已知的邻近沟道作用 的各种方法，包括但不限于FRET、时间分辨荧光-FRET、L0CI等。本发明方法中所用邻近沟 道作用的优点是仅对那些结合所有三种抗体的分析物(如融合蛋白或信号转导分子)生成 可检测信号，使试验特异性增加、背景降低并简化检测。如本文详细描述，为了评价个体患者的潜在抗癌治疗，所述分离的细胞可与一种 或多种不同剂量的抗癌药物孵育。然后可进行数分钟(如约1-5分钟)或数小时(如约1-6 小时)的生长因子刺激。有或没有抗癌药的信号通路的差异活化可有助于针对各个体患者 选择适当剂量的合适癌症治疗。还可在抗癌药治疗期间从患者中分离细胞并用一种或多种 生长因子刺激以确定是否需要改变治疗。因此，图2显示本发明的方法优选通过以正确剂 量在正确时间为各患者提供正确抗癌药来帮助临床医生。定义除非另有说明，本文所用的以下术语具有属于它们自身的涵义。术语“癌症”包括一类表征为异常细胞的不受控生长的疾病的任何成员。所述术 语包括特征为恶性、良性、软组织、或实体的所有已知癌症和肿瘤病症，和所有阶段和级别 的癌症包括转移前和转移后癌症。不同类型癌症的非限制性示例包括血液恶性肿瘤(如白 血病、淋巴瘤)；成骨肉瘤(如尤因肉瘤)；软组织肉瘤(如隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、横 纹肌肉瘤)；其他软组织恶性肿瘤、乳头状甲状腺癌；前列腺癌；胃癌(如胃);乳腺癌；肺癌 (如非小细胞肺癌)；消化和胃肠道癌(如结直肠癌、胃肠道基质肿瘤、胃肠道类癌瘤、结肠 癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、和小肠癌)；食道癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；卵巢癌； 肾癌(如肾细胞癌)；中枢神经系统癌；皮肤癌；绒膜癌；和头颈癌。如本文所用，“肿瘤” 包含一种或多种癌细胞。“血液恶性肿瘤”包括是影响血液、骨髓和/或淋巴结的任何癌症类型。血液恶性 肿瘤的示例包括但不限于白血病、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。不同种类白血病的非限制性 示例包括慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、急性髓细胞性、白血病(AML)和大颗粒淋巴细胞白血病。CML的亚型包括例如慢性单 核细胞白血病。ALL的亚型包括例如前体B细胞急性淋巴细胞白血病、原B细胞急性淋巴细 胞白血病、前体T细胞淋巴细胞白血病、和急性双表型白血病。CLL的亚型包括例如B细胞 前淋巴细胞性白血病。AML亚型包括例如，急性早幼粒细胞白血病、急性成髓细胞白血病、 和急性成巨核细胞白血病。不同类型淋巴瘤的示例包括但不限于霍奇金淋巴瘤(四亚型) 和非霍奇金淋巴瘤例如小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡 性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多毛细胞白血病(HCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、伯基特 淋巴瘤(BL)、移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、T细胞前淋巴细胞性白血病(T-PLL)、B细胞 前淋巴细胞性白血病(B-PLL)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(还称为淋巴浆细胞性淋巴 瘤)、和其他NK或T细胞淋巴瘤。
术语“分析物”包括測定其存在、含量和/或特性的任何感兴趣分子，通常是大分 子，例如多肽。在某些情况中，分析物是癌细胞的细胞组分，优选致癌融合蛋白或信号转导 分子。术语“转化”或“转变”包括分析物或样品的物理和/或化学改变以提取分析物或 者改变或修饰本文所述分析物。如本文所用，提取、处理、化学沉淀、ELISA、复合化、免疫提 取、物理或化学修饰分析物或样品以测量分析物的水平或浓度或活化状态都构成转化。换 句话说，只要分析物或样品在转化步骤之前与之后不相同，所述改变或修饰就是转化。本文所用的术语“稀释系列” g在包括一系列浓度递降的特定样品(例如，细胞裂 解液)或试剂(例如，抗体)。一般通过以下过程产生稀释系列混合測定量的起始浓度样 品或试剂与稀释液(例如，稀释缓冲液)产生较低浓度的样品或试剂，重复该过程足够次数 以获得所需数量的稀释系列。可将样品或试剂连续稀释至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、100、500、或 1000 倍而产生包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、或50种浓度递降的样品或试剂的稀释系列。例 如，通过将一定量起始浓度的捕获抗体与等量稀释缓冲液混合，产生浓度为0. 5毫克/毫升 的捕获抗体，重复该过程获得浓度为0. 25晕克/晕升、0. 125晕克/晕升、0. 0625晕克/晕 升、0. 0325晕克/晕升等的捕获抗体,可生成包含起始浓度为I晕克/晕升的捕获抗体试剂 的2倍系列稀释。术语所用的术语“优越的动态范围”指该试验能够检测少至I个细胞或多至数千 细胞中的特异性分析物。例如，本文所述免疫试验具有高动态范围，因为它们用捕获抗体浓 度的系列稀释有利地检测约1-10，000个细胞(例如，约1、5、10、25、50、75、100、250、500、 750、1000、2500、5000、7500或10000个细胞)中感兴趣的特定致癌融合蛋白或信号转导分子。术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包括通过连接两个或多个最初编码分离蛋白的基 因而产生的蛋白。所述基因融合通常在染色体移位将ー个基因的末端外显子替换为第二 基因的完整外显子时生成。这样产生可转录、剪接和翻译产生功能融合蛋白的单基因。在具体实施方式
中，所述融合蛋白是致癌融合蛋白，即參与癌发生的融合蛋白。致癌融合蛋 白的示例包括但不限于 BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、RAR a -PML, IREL-URG, CBF ^ -MYHl I、 AML1-MTG8、EffS-FLI, LYT-IO-Ca I、HRX-ENL, HRX-AF4、NPM-ALK, IGH-MYC、RUNX I-ETO, TEL-TRKC、TEL-AMLI、MLL-AF4、TCR-RBTN2,COLlAl-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、 RET-PTC、TMRSS-ERG、和 TPR-MET。术语“信号转导分子”或“信号转导物”包括细胞将胞外信号或刺激转变成响应过 程中起作用的蛋白质和其它分子，所述过程通常涉及细胞内的生物化学反应有序顺序。信 号转导分子的示例包括但不限于受体酪氨酸激酶，例如EGFR(例如，EGFR/HER-1/ErbBl、 HER-2/Neu/ErbB2、HER_3/ErbB3、HER-4/ErbB4)、VEGFR-1/FLT-U VEGFR-2/FLK-l/KDR、 VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFRH^i^n，PDGFRA、PDGFRB)、c-Met、c_KIT/SCFR、INSR (胰 岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体-相关受体)、CSF_1R、FGFR I-4,HGFR 1-2、 CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYR03、TIE 1-2、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS, V-钙粘蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK (退行发育性淋巴瘤激酶)、 ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3, RTK 106以及受体酪氨酸激酶的截短形式如p95ErbB2 ;非受体酪氨酸激酶，例如 Src> Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack 和 LIMK ;酪氨酸 激酶信号级联组分，例如 Akt、MAPK/ERK、MEK、RAF、PLA2、MEKK, JNKK, JNK, p38、She (p66)、 PI3K、Ras (例如，K-Ras, N-Ras, H-Ras)、Rh。、Racl、Cdc42、PLC, PKC, p70S6 激酶、p53、细胞 周期蛋白 Dl、STATl、STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、 PTEN、RSK 1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；核激素受体如雌激素受体(ER)、孕酮 受体(PR)、雄激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类 视色素受体、甲状腺激素受体和孤儿受体；核受体辅激活物和抑制物；及其组合。本文所用的术语“样品”包括获自患者的任何生物样本。样品包括但不限于全 血、血浆、血清、乳管灌洗液、乳头抽吸物、淋巴(例如淋巴结的播散肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、 唾液、尿液、粪便(即，排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、细针抽吸物(例如通过随机乳晕缘 细针抽吸收集)、任何其它体液、组织样品(例如，肿瘤组织)，如肿瘤活检(例如，针吸活检) 或淋巴结活检(例如前哨淋巴结活检)和其细胞提取物。在一些实施方式中，样品是全血或 其部分组分，例如血浆、血清、红细胞、白细胞如外周血单核细胞、和/或稀有循环细胞。在 具体的实施方式中，采用本领域已知的任何技木通过从全血或其细胞组分中分离实体瘤白 细胞或循环细胞来获得样品。在其他实施方式中，样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的 例如获自实体瘤的肿瘤组织样品。本文所用的术语“循环细胞”包括从实体瘤转移或微转移的瘤旁细胞 (extratumoral cell)。循环细胞的示例包括但不限于循环肿瘤细胞、癌症干细胞和/或 迁移至肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、循环促血管生成髓样细胞、循 环树突细胞等)。〃活检〃指为诊断或预后评估取出组织样品的过程，和所述组织样品本身。可将 本领域已知的任何活检技术应用于本发明的方法和组合物。所用的活检技术通常取决于 待评估的组织类型和肿瘤大小及类型(即，实体瘤或悬浮肿瘤(即，血液或腹水))等因 素。代表性活检技术包括切除活检、切开式活检、针吸活检(例如，芯针活检、细针抽吸活 检等)、手术活检和骨髓活检。活检技术的描述可參见，例如Harrison' s Principles of Internal Medicine (《哈里森内科学》)，Kasper等编，第16版，2005，第70章，以及整个第 V部分。本领域技术人员将理解，可通过活检技术来鉴定给定组织样品中的癌细胞和/或癌 前细胞。术语“对象”或“患者”或“个体”通常包括人，但也可包括其它动物，例如其它灵长 类、哨齿类、犬、猫、马、绵羊、猪等。〃阵列〃或〃微阵列〃包括固定或限于固相支持物上的捕获抗体的独立组和/或 系列稀释，所述固相支持物例如玻璃(例如，载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠(例如，磁珠， 聚苯こ烯珠，等等)、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素，聚偏ニ氟こ烯(PVDF)等)、纤维束或 任何其他合适的基质。捕获抗体一般通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互 作用、氢键、范德华力、偶扱-偶极键)而固定或限于固体支持物上。在某些情况下，捕获抗 体包含能与结合于固相支持物的捕获剂相互作用的捕获标记。本发明试验所用的阵列通常 包含偶联于固体支持物表面的不同已知/可寻址位置的多个不同捕获抗体和/或捕获抗体 浓度。术语〃捕获抗体〃意指包括对样品中一种或多种感兴趣分析物如白血球或稀少循环细胞的细胞提取物具有特异性(即，结合、被结合或形成复合体)的固定抗体。在优选的 实施方式中，捕获抗体限于阵列中的固体支持物上。用于将各种致癌融合蛋白或信号转导 分子固定在固体支持物上的合适捕获抗体可购自奥普斯特公司(Upstate, Temecula, CA)、 加利福尼亚州卡马里奥市生物资源公司(Biosource,Camarillo,CA)、马萨诸塞州丹弗斯市 细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technologies, Danvers,MA)、明尼苏达州明尼阿 波利斯研发系统公司(R&D Systems, Minneapolis, MN)、加利福尼亚州弗里蒙特市LV公司 (Lab Vision,Fremont, CA)、加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、密苏里州圣路易斯市西格玛公司(Sigma, St. Louis, MO) 和加利福尼亚州圣何塞市BD生物科学公司(BD Biosciences, San Jose, CA)。本文所用的术语“检测抗体”包括含有样品中一种或多种感兴趣分析物特异性 (即，结合、被结合或与之形成复合物)可检测标记的抗体。该术语还包括一种或多种感兴 趣分析物特异性的抗体，其中所述抗体可被包含可检测标记的另一种类结合。可检测标记 的示例包括但不限于生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如，寡核苷酸)标记、化学反应 活性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记和其组合。用于检测各种致癌融合蛋白或信号转 导分子中任何一种的活化状态和/或总量的合适检测抗体可购自奥普斯特公司(加州特默 库拉)、生物源公司(加州卡玛利奥)、细胞信号传导技术公司(马萨诸塞州丹维斯)、安迪 生物(明尼苏达州明尼阿波利斯)、视觉实验室公司(加州弗里蒙特)、圣克鲁斯生物技术公 司(加利福尼亚州圣克鲁斯)、西格玛公司(密苏里州圣路易斯)、以及BD生物科技公司 (加州圣何塞)。一个非限制性的示例是针对各种磷酸化形式信号转导分子如EGFR、c-KIT、 c-Src、FLK-1、PDGFRA、PDGFRB、Akt、MAPK、PTEN、Raf 和 MEK 等的磷酸特异性抗体，可购自圣 克鲁斯生物技术公司。术语“活化状态依赖性抗体”包括对样品中一种或多种感兴趣分析物的特定活化 状态具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的检测抗体。在优选的实施方式 中，所述活化状态依赖性抗体能检测一种或多种分析物例如一种或多种致癌融合蛋白或信 号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合状态。在一些实施方式中，利用活化状态依赖性抗 体检测BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶结构域的磷酸化。在其他实施方式中，利用活化状态 依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶EGFR家族成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间形成的 异质二聚体复合物。适于用活化状态依赖性抗体检测的活化状态致癌融合蛋白的非限制性示例包括 BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、RAR a -PML、IREL-URG、CBF ^ -MYH11、AML 1-MTG8、EWS-FLI、 LYT-10-Ca 1、HRX-ENL、HRX-AF4、NPM-ALK、IGH-MYC、RUNX1-ET0、TEL-TRKC、TEL-AML1、 MLL-AF4、TCR-RBTN2、⑶L1A1-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR,ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、 和TPR-MET的磷酸化形式。适合用活化状态依赖性抗体检测的信号转导分子的活化状 态(括号中所列)示例包括但不限于EGFR (EGFRvII I、磷酸化(p_) EGFR、EGFR: She、泛 素化(u-)EGFR、p-EGFRvIII) ；ErbB2(p95:截短(Tr)_ErbB2、p_ErbB2、p95:Tr_p_ErbB2、 HER-2:Shc、ErbB2:PI3K、ErbB2:EGFR、ErbB2:ErbB3、ErbB2:ErbB4) ；ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3: PI3K> p_ErbB3: PI3K、ErbB3: She) ；ErbB4 (p-ErbB4> ErbB4: She) ;c_Met (p-c-Met 或 c-Met/HGF 复合物)，ER(p-ER(S118，S167) ;IGF-lR(p-IGF_lR, IGF_1R:IRS，IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K) ；INSR(p-INSR) ；KIT(p-KIT) ；FLT3(p-FLT3) ；HGFRI(p-HGFRI)；HGFR2(p-HGFR2) ；RET(p-RET) ;PDGFRa(p-PDGFRa) ；PDGFRP(p-PDGFRP) ；VEGFRI(p-VEGFRI, VEGFRI:PLCg, VEGFRl:Src) ；VEGFR2(p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2:硫酸 肝素，VEGFR2:VE-钙粘蛋白)；VEGFR3 (p_VEGFR3) ;FGFRI (p-FGFRI) ；FGFR2 (p-FGFR2)； FGFR3 (p-FGFR3) ；FGFR4(p-FGFR4) ；Tiel (p-Tiel) ；Tie2 (p-Tie2) ；EphA (p-EphA)； EphB (p-EphB) ；NFKB 和/或 IKB (p_IK (S32)，p-NFKB (S536)，p-P65:1KBa) ;Akt (p-Akt (T308， S473)) ；PTEN(p-PTEN) ；Bad (p-Bad (SI12, S136)，Bad:14-3-3) ；mTor(p-mTor (S2448))； p70S6K(p-p70S6K(T229, T389)) ；Mek(p-Mek(S217, S221)) ；Erk(p-Erk(T202, Y204))； Rsk-I(p-Rsk-1 (T357, S363)) ；Jnk(p-Jnk(T183, Y185)) ；P38(p-P38(T180, Y182))； Stat3(p-Stat-3(Y705, S727)) ;Fak(p_Fak (Y576)) ;Rb(p-Rb (S249，T252, S780))； Ki67 ；p53 (p-p53(S392, S20)) ;CREB (p-CREB(S133)) ；c-Jun (p-c-Jun(S63))； cSrc (p-cSrc (Y416));和桩蛋白(p_ 桩蛋白(Y118))。术语“活化状态非依赖性抗体”包括对样品中一种或多种感兴趣分析物具有特异 性(即，结合、被结合或与之形成复合物)而无论其活化状态的检测抗体。例如，活化状态 非依赖性抗体可检测ー种或多种分析物例如一种或多种致癌融合蛋白或信号转导分子的 磷酸化和非磷酸化形式。术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸 及其聚合物，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷类似物或经修饰主链残基或连接键 的核酸，其可以是合成的、天然产生的和非天然产生的，具有与參比核酸相似的结合特性。 这种类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酷、氨基磷酸酷、膦酸甲酷、手性-膦酸甲酷、 2’-0-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。除非明确限定，该术语包括含有天然核苷的已知 类似物的核酸，其具有与參比核酸相似的结合特性。除非另有说明，特定核酸序列还隐含其 保守性修饰的变体和互补序列以及明确示出的序列。术语“寡核苷酸”指RNA、DNA、RNA/DNA杂交体的单链寡聚物或聚合物和/或其模 拟物。在某些情况中，寡核苷酸由天然产生(即，未修饰)的核碱基、糖和核苷间(主链) 连接构成。在某些其它情况中，寡核苷酸包含修饰的核碱基、糖和/或核苷间连接。本文所用的术语“错配基序”或“错配区”指寡核苷酸中与其互补序列没有100%互 补的部分。寡核苷酸可含有至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区。所述错配区可以是连续 的，或可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸隔开。错配基序或区域可包含一 个核苷酸或可包含2、3、4、5或更多个核苷酸。短语“严谨杂交条件”指寡核苷酸与其互补序列杂交，但不与其它序列杂交的条 件。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂 交。有关核酸杂交的详细指南參见 Ti jssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes (《生物化学和分子生物学技木-与核酸 探针杂父ノ，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (核酸测定的杂交原理和方案概览)”(1993)。通常,严谨条件选择为比特定序 列在确定离子強度、PH下的热解链温度(Tm)低约5-10° C。Tm是50%靶标互补探针与靶序 列杂交平衡时的温度(在确定离子強度、PH和核酸浓度下)(由于靶序列过量，在！ 时50% 探针被平衡地占据)。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。在选择性或特异性杂 交中，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选10倍。
术语“基本相同”或“实质性相同”的两条或多条核酸，指采用序列比较算法或通过 手工比对和目测观察进行比较和比对在比较窗口或指定区域的最大对应性时，相同或含有 相同特定百分比的核苷酸(即，在特定区有至少约60%，优选至少约65%、70%、75%、80%、85%、 90%或95%相同性)的两条或多条序列或子序列。当文中示出该定义时，还类似地指某序列 的互补部分。优选在至少长约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、或100个核苷酸的区域 上基本相同。术语“酪氨酸激酶抑制剂”包括作为受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择或非选 择性抑制剂的各种治疗剂或药物中的任何一种。不受任何具体理论限制，酪氨酸激酶抑 制剂通常通过结合酶的ATP结合位点抑制靶酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制剂的示例包括 但不限于伊马替尼(Gleevec' ; STI571)、尼洛替尼(Tasigna )、达沙替尼(Sprycel )、
博舒替尼(SKI-606)、吉非替尼(Iressa1^、舒尼替尼(Sutent ; SU11248)、埃罗替尼
(TarcevV; 0SI-1774)、拉帕替尼(GW572016;GW2016)、卡纽替尼(CI 1033)、塞马悉尼 (semaxinib) (SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、来氟米特 (SU101)、凡德他尼(vandetanib) (Zactima ; ZD6474)、其衍生物、类似物和组合。其他适用 于本发明的酪氨酸激酶抑制剂描述于例如美国专利号5，618，829,5, 639，757,5, 728，868、 5，804，396,6, 100，254,6, 127，374,6, 245，759,6, 306，874,6, 313，138,6, 316，444、 6，329，380,6,344，459,6,420，382,6,479，512,6,498，165,6,544，988,6,562，818、 6，586，423,6, 586，424,6, 740，665,6, 794，393,6, 875，767,6, 927，293、和 6，958，340。本领 域技术人员了解其它适用于本发明的酪氨酸激酶抑制剂。在某些情况中，所述酪氨酸激酶 抑制剂以药学上可接受的形式给予，所述药学上可接受的形式包括但不限于碱金属或碱土 金属盐如铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐或锌盐；铵盐如叔胺盐或季铵盐；和酸盐如琥 珀酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、二盐酸盐、水杨酸盐、半琥珀酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、 苹果酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、乙酸盐、氨基甲酸盐、硫酸盐、硝 酸盐、甲酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、丙酮酸盐、草酰乙酸盐、延胡索酸盐、丙酸 盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、或苯甲酸盐。术语〃孵育〃与“接触”和“暴露”同义使用，不暗指任何特定时间或温度要求，除 非另有说明。术语“完全细胞遗传学反应”、“完全细胞遗传学缓解”、“CCyR”和” CCgR”包括临 床接受的标准，所述标准定义为如骨髓分离细胞的染色体显带所测定，在至少20种处于 中期的细胞群中缺失处于中期的费城染色体阳性细胞。在某些情况中，当不能获得分离 自骨髓的中期细胞或其不能用染色体显带评价时，所述术语可定义为至少200个评分的 核中存在〈1%的BCR-ABL阳性核，如血细胞的间期荧光原位杂交(FISH)测定。所述间 期FISH可例如用BCR-ABL额外信号、双色、双融合或原位杂交探针进行。这些术语的其 他说明参见例如 0，Brien 等，N. Engl. J. Med. , 348:994-1004 (2003) ;Hughes 等，N. Eng. 1 J. Med.，349:1423-1432(2003);和 Bacarani 等，J. Clin. Oncol.，27:6041-6051 (2009)。在致癌融合蛋白如BCR-ABL的水平比一种或多种对照蛋白如全长BCR和/或全 长ABL的水平下降至少约2-3个数量级时实现“主要分子响应”、“主要分子缓解”或“MMR”。 在某些实施方式中，当抗癌药(如酪氨酸激酶抑制剂)治疗期间致癌融合蛋白水平(如BCR-ABL水平)与对照蛋白水平(如BCR或ABL水平)之比相对抗癌药治疗前相同蛋白之比 下降至少约2-3个数量级时实现主要分子响应。与依赖mRNA转录水平检测的主要分子响应 的定义相反，本发明的基于抗体的邻近双检测试验优选提供在健康供体的约100000细胞 背景中检测一种癌症(如CML)细胞的能力，从而通过测量和对比BCR-ABL、BCR、和/或ABL 蛋白水平检测主要分子响应。在其他实施方式中，主要分子响应是定义为BCR-ABL mRNA转 录本与ABL或BCR mRNA转录本之比(表示为ABL或BCR mRNA转录水平百分比)中对数(底 数10)级别上低于标准基线值至少3个数量级的临床分类。在某些情况中，mRNA转录本的 水平用实时定量RT-PCR(qPCR)方法测定。在其他实施方式中，主要分子响应是通过qPCR 测定的BCR-ABL与ABL、BCR或对照mRNA转录本之比在国际标准(IS)上定义为值切.1%时 的情况。所述IS依据国际干扰素与STI571随机研究(IRIS)的临床研究中参与的实验室 建立的对数降低比例。参见例如，Hughes 等，N. Engl. J. Med.，349:1423-1432 (2003) ; Hughe s 等，Blood，108:28-37 (2006)，fcand 等，Blood, 112:3330-3338 (2008);和 Baccarani 等， J.Clin. Oncol.，27:6041—6051(2009)。在致癌融合蛋白如BCR-ABL的水平比一种或多种对照蛋白如全长BCR和/或全 长ABL的水平下降至少约3-4个数量级时实现“完全分子响应”、“完全分子缓解”或“CMR”。 在某些实施方式中，当抗癌药治疗期间致癌融合蛋白水平(如BCR-ABL水平)与对照蛋白 水平(如BCR或ABL水平)之比相对抗癌药(如酪氨酸激酶抑制剂)治疗前相同蛋白之比下 降至少约3-4个数量级时实现完全分子响应。与依赖mRNA转录水平检测的完全分子响 应的定义相反，本发明的基于抗体的邻近双检测试验优选提供在健康供体的约1，000，000 细胞背景中检测一种癌症(如CML)细胞的能力，从而能通过测量和对比BCR-ABL、BCR、 和/或ABL蛋白水平来检测完全分子响应。在其他实施方式中，完全分子响应是在至少 两种优质连续血样中BCR-ABL mRNA转录本不可用qPCR和/或巢式PCR检测的临床分 类，所述优质血样确保能检测BCR-ABL mRNA水平的4. 0-4. 5个数量级的下降。在某些 情况中，完全分子响应是定义为BCR-ABL与ABL、BCR或对照mRNA转录本之比(表示为 百分比)在对数级别上低于标准基线值至少4. 5个数量级。参见例如，Press等，Blood, 107:4250-4256(2006);Muller 等,Leukemia. , 23:1957-1963 (2009);和 Baccarani 等， J.Clin. Oncol.，27:6041—6051(2009)。术语“疗程”包括用于缓解或阻止有关癌症如血液恶性肿瘤(如白血病、淋巴瘤等) 的一种或多种症状的任何治疗方法。所述术语涵盖给予任何化合物、药物、方法、和/或方 案用于改善患癌个体健康状况，且包括任何本文所述治疗剂。本领域技术人员会理解，可基 于用本发明方法测定的一种或多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的表达和/或活化水 平对所述疗程或当前疗程的剂量进行改变(如增加或减少)。
具体实施例方式本发明提供基于抗体的阵列，用于检测生物样品如细胞提取物或裂解物中一种或 多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活化状态和和/或总量。本发明还提供使用所述 阵列的方法以协助癌症预后和诊断、预测或鉴定药物治疗抗性、以及个性化靶向治疗的设 计。在具体实施方式
中，本发明的组合物和方法优选鉴定对用酪氨酸激酶抑制剂如伊马替 尼的治疗有抗性的患者，这是由于靶蛋白激酶(如BCR-ABL)中的突变、不符合治疗方案、和/或给予了未达最佳的药物剂量。在一个具体实施方式
中，本发明提供例如免疫试验的试验用于实时检测生物样品 如细胞提取物或裂解物中BCR-ABL、其底物和/或其他信号转导分子的表达水平和/或活化 (如磷酸化)程度。因此，本发明优选为接受一种或多种靶向治疗的血液恶性肿瘤如CML患 者提供益处，这是通过在整个疗程中筛选和监控他们并评价他们是否需要变为替代的靶向 治疗如尼洛替尼(Tasigna )以有效抑制所述靶分子(如BCR-ABL)且具有最小毒性。在某些实施方式中，本发明提供具有优秀灵敏度范围的方法用于检测致癌融合蛋 白如BCR-ABL。当前检测细胞提取物中BCR-ABL蛋白的免疫试验一般能在10-100，000正 常细胞中检测一个BCR-ABL阳性细胞，等同于10-0. 001%的检测灵敏度(参见例如，Jilani 等，Leuk. Res. , 32:936-943(2008) ;ffeerkamp 等，Leukemia, 23:1106-1117 (2009) ; Rapon i 等，Haematologica, 94:1767-1770 (2009);和美国专利公开号 US 2006/0172345)。本 文所述邻近试验优选表现出灵敏度提高为约1:100，000-10，000，000细胞(即一个白血 病细胞比约100，000-10，000，000正常细胞；等于检测灵敏度约0.001-0. 00001%)或 约 1:1，000，000-10，000，000 细胞(即一个白血病细胞比约 1, 000, 000-10, 000, 000 正常 细胞；等于检测灵敏度约0. 0001-0. 00001%)，和包括例如约1:100，000细胞、1:200，000 细胞、1:300，000 细胞、1:400，000 细胞、1:500，000 细胞、1:600，000 细胞、1:700，000 细 胞、1:800，000 细胞、1:900，000 细胞、1: 1，000，000 细胞、1: 2，000，000 细胞、1: 3，000，000 细胞、1:4，000，000 细胞、1:5，000，000 细胞、1: 6，000，000 细胞、1: 7，000，000 细胞、 1:8, 000, 000 细胞、1:9，000，000 细胞、1:10，000，000 细胞、1:100，000-500，000 细胞、 1:100，000-1，000，000 细胞、1:500，000-1，000，000 细胞、1:100，000-5，000，000 细胞、 1:500，000-10，000，000 细胞、1: 2，000，000-10，000，000 细胞、1: 5，000，000-10，000，000 细胞、1:1，000, 000-7, 500, 000细胞、1:1，000, 000-5, 000, 000细胞、和其中包括的任何其 他范围。本文所述方法的灵敏度可相当于或超过基于核酸的标准BCR-ABL试验(如qPCR 或巢式PCR)，所述试验的检测范围落在1个白血病细胞比10，000-1，000，000正常细胞 中。基于核酸的标准BCR-ABL试验的灵敏度范围的其他描述参见例如Press等，Blood, 107:4250-4256(2006)和 Radish JP, Blood,114:3376-3381(2009)。在具体实施方式
中，与当前检测BCR-ABL的免疫试验和基于核酸的试验相比，本 发明基于抗体的邻近试验优选在检测致癌融合蛋白如BCR-ABL的存在、水平和/或活性状 态中能产生较高的敏感度和/特异性程度，从而更精确地检测响应指示剂如完全细胞遗传 反应、主要分子响应、完全分子响应及其组合。作为非限制性示例，当前基于核酸的试验灵 敏度不足以检测患者样品中极低量的BCR-ABL转录本，从而用当前基于核酸的试验检测完 全分子响应不一定意味着所述患者被治愈且不再患BCR-ABL介导的疾病(如CML)。在一个方面，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包 括(a)将细胞提取物与对第一全长蛋白的第一结构域特异的第一结合部分在适于将 所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转变为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分 的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不 存在，所述融合蛋白包含与所述第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第 二不同结构域。
(b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白 的细胞提取物；(C)将步骤(b)中的细胞提取物与对所述第一全长蛋白的第二不同结构域特异的 第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转变为含所述致癌融合蛋 白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和(d)测定步骤(C)中复合物的水平或活化状态，从而测定所述致癌融合蛋白的水 平或活化状态。在一个实施方式中，所述细胞提取物含分离自样品的细胞提取物。在某些情况中， 所述样品选自全血、血清、血浆、细针抽吸物(FNA)、尿液、痰、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸 物、淋巴、唾液和其组合物。在另一实施方式中，所述样品获自癌症患者。在一些情况中，所 述癌症可由癌细胞中的染色体移位形成致癌融合蛋白引起。所述癌症的示例包括但不限于 血液恶性肿瘤、成骨肉瘤、软组织肉瘤和其组合。在具体实施方式
中,所述血液恶性肿瘤是 白血病或淋巴瘤。在一个优选实施方式中，所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。在另 一实施方式中，用于制备细胞提取物或裂解物的分离细胞可含循环肿瘤细胞、白细胞或其 组合。在某些实施方式中，所述分离细胞用生长因子体外刺激。在一些情况中，所述分离细 胞在生长因子刺激前与抗癌药孵育。在其他情况中，所述分离细胞在生长因子刺激后裂解 以产生细胞提取物。在一些实施方式中，所述细胞提取物用新鲜收集或冷冻的骨髓或全血样品制 备。作为非限制性示例，用抗凝剂(如EDTA、肝素和/或柠檬酸葡萄糖(ACD))处理的全 血细胞样品首先分离为血浆或血清组分和细胞组分。细胞组分可通过用氯化铵和/或 Ficoll-Hypaque (聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心对红细胞低渗裂解处理以从血液样 品中分离白细胞。可用任何本领域已知的方法裂解细胞组分中存在的分离细胞从而转 化所述分离细胞为细胞提取物，如Raponi等，Leuk Res, 32:923-43 (2008) ; Weerkamp等， Leukemia, 23:1106-1117(2009);和美国专利号 6，610，498 和 6,686，165 中所述的方法。在一些情况中，所述分离的白细胞在裂解前可用一种或多种细胞穿透性蛋白酶抑 制剂处理。细胞穿透性蛋白酶抑制剂包括但不限于氟磷酸二异丙酯(DFP)、4-(2-氨基乙 基)苯磺酰基盐酸氟(AEBSF)、氟化苯基甲磺酰基(PMSF)及其混合物。作为非限制性示例， 分离的白细胞于冰上在含20mM AEBSF和ImM PMSF的PBS缓冲液中孵育10-30分钟。细胞 以520g于4° C温和离心5分钟，分开上清和分离的白细胞。分离的白细胞用蛋白酶抑制 剂处理，如 Weerkamp 等，Leukemia, 23:1106-1117 (2009)所述。在一些情况中，分离的白细胞可于冰上在含一种或多种蛋白抑制剂的RIPA裂解 缓冲液中孵育多至30分钟。RIPA缓冲液包含或主要由50mM Tris HCl、pH7. 5、150mM NaCl, 1%NP40、和O. 1%十二烷基硫酸钠组成。在某些其他情况中，RIPA缓冲液不含脱氧胆酸钠。 孵育后，所述细胞混合物于4° C以>18，OOOg离心1-10分钟以分离细胞提取物和细胞碎 片。收集所述细胞提取物。对于细胞裂解方案的其他描述，参见例如Raponi等，Haematol ogica, 94:1767-1770 (2009) ; Weerkamp 等，Leukemia, 23:1106-1117(2009);和美国专利公 开号 US 2006/0172345。在一些实施方式中，血浆从收集的新鲜外周全血样中制备并用一种或多种抗凝 剂(如 EDTA、肝素或 ACD)处理，如 Jilani 等，Leuk. Res.，32:936-943(2008)所述。作为非限制性示例，血液样品可分离为血浆或血清组分和细胞组分。所述血浆可在试验前存 于-70-80° C，或在血液样品收集96小时内进行试验。在某些实施方式中，所述致癌融合蛋白选自下组BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、 RARa -PML、IREL-URG、CBFP -MYH11、AML1-MTG8、EWS-FLI、LYT-10-Ca 1、HRX_ENL、HRX_AF4、 NPM-ALK、IGH-MYC、RUNX 1-ET0、TEL-TRKC、TEL-AML1、MLL-AF4、TCR-RBTN2、C0L1A1-PDGF、 E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、TPR-MET 和其组合。在具体实施方 式中，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL。在某些情况中，所述第一全长蛋白是BCR，所述第一全 长蛋白的第一结构域含BCR的羧基末端区(BCR-C)，且所述第一全长蛋白的第二不同结构 域含BCR的氨基末端区(BCR-N)。在某些其他情况中，所述第二不同全长蛋白是ABL，所述 第二不同全长蛋白的第一结构域含ABL的羧基末端区(ABL-C)，且所述第二不同全长蛋白 的第二不同结构域含ABL的氨基末端区(ABL-N)。在一个替代实施方式中，所述第一全长蛋 白是ABL且所述第二不同全长蛋白是BCR。在一些实施方式中，所述活性状态选自下组磷酸化状态、泛素化状态、复合状态 和其组合。在一个优选实施方式中，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL且所述活化状态是磷酸 化状态。在其他实施方式中，本发明的试验方法还包含测定一种或多种信号转导分子的水 平或活化状态。在具体实施方式
中，所述一种或多种信号转导分子含BCR-ABL底物如CRKL、 JAK2、STAT5、Src、FAK、c_ABL、c_CBL、SHC、SHP-2、VAV、BAP-1 和其组合。在一个具体实施方式
中，所述第一结合部分含第一抗体。在一些情况中，所述第 一抗体与固体支持物结合。固体支持物的非限制性示例包括玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、 珠、纸、膜、纤维束和其组合。在优选实施方式中，所述第一抗体结合珠(如磁珠、聚苯乙烯珠 等)，且所述珠起消耗标签功能以从细胞提取物中去除所述第一全长蛋白。在另一具体实施方式
中，所述第二结合部分含第二抗体。在一些情况中，所述第一 抗体与固体支持物结合。固体支持物的非限制性示例包括玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、 纸、膜、纤维束和其组合。在一个优选实施方式中，所述第二抗体限于可寻址阵列的固体支 持物如膜上(如尼龙、硝酸纤维素、PVDF等)。在另一实施方式中，所述第二抗体结合珠(如 磁珠、聚苯乙烯珠等)，其中所述珠可任选包含染料如荧光团(如有色珠)。在使用多种珠的 情况中，各珠可含独立选择的染料如不同强度或有不同激发和/或发射光谱的荧光团(如 红色或红外荧光团)。在优选实施方式中，步骤(c)和(d)含本文所述邻近双检测试验(还称为协作邻 近免疫试验(“C0PIA”))。在其他实施方式中，步骤(c)和(d)包括本文所述的酶联免疫 吸附实验(ELISA)、流式细胞分析、或标签分选试验。在步骤(c)和(d)含邻近双检测试验的实施方式中，步骤(c)还包括(c’ )将步骤(b)中的细胞提取物与第三结合部分和第四结合部分在适于将细胞 提取物中存在的致癌融合蛋白转化为含所述致癌融合蛋白与所述第二、第三和第四结合部 分的复合物的条件下接触，其中所述第三结合部分用协助部分标记且对下述结构域或序列中的一种或多种 表位特异(如特异性结合)a)所述第二不同全长蛋白的第一结构域；ai)所述第一全长 蛋白的第二不同结构域；或(iii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域和所述第二不同全长蛋白的第一结构域的融合位置，其中所述第四结合基序用信号放大对的第一元件标记，且对所述第二不同全长 蛋白的第一结构域特异，和其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。在步骤(c)和(d)含邻近双检测试验的实施方式中，步骤(d)还包括(c)用信号放大对的第二元件孵育步骤(c’ )中的复合物，生成放大的信号；和(d”)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。在某些实施方式中，步骤(b)的细胞提取物可与所述第二结合部分的稀释系列接 触，形成多种含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物。在一些实施方式中，所述 第三和第四结合部分可分别包括第三和第四抗体。在一些情况中，所述第三和第四抗体均 为活化状态非依赖性抗体。在该情况中，所述信号放大对的第一和第二元件与致癌融合蛋 白的总量相关。在其他情况中，所述第三抗体是活化状态非依赖性抗体且所述第四抗体是 活化状态依赖性抗体。在该情况中，所述信号放大对的第一和第二元件产生的放大信号与 活化(如磷酸化)的致癌融合蛋白总量相关。在其他实施方式中，所述第三结合基序可直接用协助部分标记。在其他实施方式 中，所述第四结合基序部分用所述信号放大对的第一元件直接标记。在替代的实施方式中， 所述第四结合部分用所述信号放大对的第一元件标记，这是通过偶联第二检测抗体的结合 对第一元件结合偶联所述信号放大对第一元件的结合对的第二元件。在这些实施方式中， 所述结合对的第一元件是生物素和/或所述结合对的第二元件是链霉亲和素。在其它实施方式中，所述协助部分是葡萄糖氧化酶。在某些情况中，所述葡萄糖氧 化酶和所述第三结合部分偶联巯基活化的右旋糖苷分子。在该情况中，巯基活化的右旋糖 苷分子的分子量约为500kDa。在其他情况中，氧化剂是过氧化氢(H202)。在该情况中，所述 信号放大对的第一元件是过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)和/或所述信号放大对的第 二部件是酪胺试剂如生物素_酪胺。在具体实施方式
中，所述放大信号由生物素-酪胺的过 氧化物酶氧化产生活化的酪胺而生成。在某些情况中，所述活化的酪胺被直接检测。在某 些其他情况中，所述活化的酪胺在添加信号检测剂后检测。信号检测剂的非限制性示例包 括链霉亲和素标记的荧光团以及链霉亲和素标记的过氧化物酶和发色剂如3，3’，5，5’ -四 甲基联苯胺(TMB)的组合。在某些实施方式中，本发明试验方法还包括(e)将细胞提取物与对所述第二不同全长蛋白的第二结构域特异的第五结合部分 在适于将所述细胞提取物中存在的第二不同全长蛋白转化为含所述第二不同全长蛋白和 所述第五结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第二不同全长蛋白在所述致癌融合蛋 白中不存在；和(f)将步骤(e)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第二不同全长蛋 白的细胞提取物；其中步骤(e)在步骤(a)之前、之中或之后进行。在一个具体实施方式
中，所述第五结合部分含第五抗体。在一些情况中，所述第五 抗体与固体支持物结合。固体支持物的非限制性示例包括玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、 纸、膜、纤维束和它们的组合。在优选实施方式中，所述第五抗体结合珠(如磁珠、聚苯乙烯珠等)，且所述珠用作消耗标签以从细胞提取物中去除所述第二不同全长蛋白。图3A显示用于检测致癌融合蛋白如BCR_ABL(310)存在(总水平)和/或活化状态 (磷酸化水平)的示例性邻近试验(300)。由嵌合BCR-ABL基因编码的致癌融合蛋白大小不 同，取决于所述BCR基因的断裂点。BCR-ABL融合基因由位于9号染色体长臂上的ABL基因 和位于22号染色体长臂上的BCR基因的相互易位生成，产生22q_染色体上的致癌融合基 因，又称为费城染色体。参见例如 Kurzock 等,N. Engl. J. Med. 319:990-8 (1988) ; Rosenberg 等，Adv. In Virus Res. 35:39-81 (1988)。根据将ABL基因移位到BCR基因N末端上的染色体 断裂点而形成不同长度的BCR-ABL融合基因。已测定ABL基因的断裂点分布在外显子lb-a2 的约200kb上，且BCR基因断裂点聚集于3个区域；外显子13-15 (b2-b4)之间的主要断裂 点(M-BCR);选择性外显子1和2(el和e2)之间的次要断裂点(m-BCR);和内含子19(el9) 中的微断裂点(mu-BCR)。因此，根据BCR-ABL基因重排形成独特的BCL-ABL蛋白。参见例 如 Konopka 等，Cell 37:1035-42(1984);van Dongen, JJM, Leukemia 19:1292-5(2005)。p210BCR_ABL蛋白从b3a2(el4a2)和/或b2a2 (el3a2)基因转录本生成，其在多 于95%的CML病例和ALL亚组中检测到。该蛋白含1790个氨基酸并由来自BCR N末端的 寡聚化结构域(0LI)组成，然后是正常BCR中不存在的BCR氨基酸序列插入物-BCR的S/T 激酶结构域，然后是来自ABL的SH3、SH2和Y激酶结构域以及ABL的C末端富含脯氨酸的 结构域。pl90BCR-ABL融合蛋白由ela2融合基因转录本编码，其主要与Ph-阳性的ALL关 联。CML的罕见病例是由于pl90型的BCR-ABL基因移位，且在这些情况中，疾病倾向于具 有显著的单核细胞组分，类似慢性粒单核细胞白血病(CMML)。p230BCR-ABL蛋白从el9a2 基因转录本形成，其与嗜中性粒细胞CML、经典CML和AML相关联。参见例如Konopka等， Cell 37:1035-42(1984) ; van Dongen, JJM, Leukemia 19:1292-5 (2005)。已描述例外的 CML 病例，BCR断裂点在所定义的三种聚集区之外或ABL中有不寻常的断裂点ABL(参见例如 Melo, Baillieres Clin. Haematol.，10:203-22(1997))。本文所述邻近试验能检测在 BCR 基因中任何位置有断裂点的嵌合BCR-ABL基因编码的BCR-ABL蛋白的总水平和活化水平。如图3A所示，全长BCR蛋白可通过用对全长BCR羧基末端区域(311)特异的消耗 标签首先从患者样品中移除。该消耗标签的非限制性示例是结合全长BCR羧基末端区域特 异性抗体的珠(321b)。一旦全长BCR从样品中移除，用BCR氨基末端区域(BCR-N)特异性 捕获抗体捕获BCR-ABL融合蛋白。一旦BCR-ABL通过BCR-N和BCR-N特异性捕获抗体之 间的结合所捕获，测定BCR-ABL的总浓度(340)，还测量活化BCR-ABL (350)。在一些实施 方式中，所述协助部分(如G0)偶联ABL羧基末端区域(ABL-C)特异性抗体，且所述信号放 大对的第一元件(如HRP)在不同于所述协助部分偶联抗体识别的表位偶联ABL-C特异性 抗体。在某些情况中，所述信号放大对偶联的抗体是活化状态非依赖性抗体，其结合ABL-C 而不论其活化状态，从而测量BCR-ABL (340)的总浓度。在某些其他情况中，所述信号放 大对偶联的抗体是活化状态依赖性抗体，其结合磷酸ABL-C (如pY245，pY412)，从而测量活 化的BCR-ABL (350)浓度。在一个替代实施方式中，所述协助部分(如G0)在不同于与所 述BCR-ABL捕获抗体识别的表位偶联BCR-N特异性抗体，且所述信号放大对的第一元件(如 HRP)偶联ABL-C特异性抗体。所述信号放大对偶联的抗体可为本文所述的活化状态非依赖 性抗体或活化状态依赖性抗体。在一些实施方式中，在捕获和通过使用全长ABL (330)氨基末端区域特异性消耗标签来检测BCR-ABL表达和/或活化前，全长ABL蛋白可额外地或选择性地从患者样品中 移除。该消耗标签的非限制性示例是结合全长ABL氨基末端区域特异性抗体的珠(321a)。 在这些实施方式中，一旦BCR-ABL通过ABL-C和ABL-C特异性捕获抗体之间的结合所捕获， 测定BCR-ABL的总浓度(360)，还测量活化的BCR-ABL (370)。在一些实施方式中，所述协 助部分(如GO)在不同于所述BCR-ABL捕获抗体识别的表位偶联ABL-C特异性抗体，且所述 信号放大对的第一元件(如HRP)偶联BCR-N特异性抗体，。在某些情况中，所述协助部分 偶联的抗体是活化状态非依赖性抗体，其结合ABL-C而不论其活化状态，从而测量BCR-ABL (360)的总浓度。在某些其他情况中，所述协助部分偶联的抗体是活化状态依赖性抗体，其 结合磷酸ABL-C (如pY245，pY412)，从而测量活化的BCR-ABL (370)浓度。在所述协助部分是G0且所述信号放大对的第一元件是HRP的实施方式中，G0偶 联的抗体和HRP偶联的抗体与BCR-ABL融合蛋白的结合使得G0基序充分邻近HRP部分，从 而G0部分生成的信号(即H202)可传至HRP部分，产生可检测和/或可放大的信号。如本文 所述方法中所用，邻近沟道效应的优点在于与BCR-ABL蛋白的总水平或活化水平相关的单 一可检测信号仅在所有三种抗体(例如捕获抗体、协助部分偶联的抗体和信号放大对偶联 的抗体)结合时生成，使试验特异性增加、背景降低并简化检测。用连接抗体检测BCR-ABL (410)的存在(总水平)和/或活化状态(磷酸化水平)的 一个替代实施方式中(400)示于图3B。同样，采用珠(421a和/或421b)通过例如其羧 基或氨基末端分别移除全长BCR和/或ABL蛋白。然后，使用固定在固体支持物上的特异 性结合部分通过捕获BCR-ABL的N末端部分，测定BCR-ABL的总浓度(440)，并测量活化的 BCR-ABL (450)。总BCR-ABL (460)和活化蛋白(470)还可通过捕获ABL-C测量，并且用连 接抗体测量总BCR-ABL水平或用ABL磷酸化特异性抗体测量活化的BCR-ABL水平。具体地，图3B (440)显示生物样品如血清中存在的BCR-ABL总量可通过将捕获分 析物与以下接触来检测(i)对BCR氨基末端区域(BCR-N)和ABL羧基末端区域(ABL-C)之 间的融合位置或位点特异的第一检测抗体(即连接抗体)，和(ii)对ABL-C特异的第二检测 抗体。第一和第二检测抗体都结合BCR-ABL而独立于其活化状态。所述第一检测抗体(即 连接抗体)用葡萄糖氧化酶(G0)标记，所述第二检测抗体用辣根过氧化物酶(HRP)标记。第 一和第二检测抗体与BCR-ABL融合蛋白的结合使得G0部分充分邻近HRP部分，从而G0部 分生成的信号(即H202)可传至HRP部分，产生可检测和/或可放大的信号。图3B (450)还显示生物样品如血清中存在的活化BCR-ABL量可通过将捕获分析 物与以下接触来检测(i)对BCR-N和ABL-C之间的融合位置或位点特异的第一检测抗体 (即连接抗体)，和(ii)对BCR-ABL的活化(如磷酸化)形式特异的第二检测抗体。所述第 一检测抗体结合BCR-ABL而独立于其活化状态，而所述第二检测抗体结合所述融合蛋白的 ABL-C结构域上存在的活化(如磷酸化)位置。所述第一检测抗体(即连接抗体)用葡萄糖氧 化酶(G0)标记，所述第二检测抗体用辣根过氧化物酶(HRP)标记。第一和第二检测抗体与 BCR-ABL融合蛋白的结合使得G0部分充分邻近HRP部分，从而G0部分生成的信号(H202)可 传至HRP基序，产生可检测和/或可放大的信号.在步骤(c)和(d)含ELISA的实施方式中，所述ELISA可包括夹心ELISA。任何 合适的抗体对可用于在夹心ELISA中捕获并检测抗体。本领域技术人员知道并理解如何选 择用于试验的合适抗体对。通常，选择在不同表位结合感兴趣靶标如BCR-ABL的两种抗体，从而第一(捕获)抗体的结合不干扰第二(检测)抗体。在优选的实施方式中，所述第一 (捕获)抗体结合所述第一全长蛋白的第二不同结构域(如BCR-N)且所述第二(检测)抗体 结合所述第二不同全长蛋白的第一结构域(如ABL-C)。在某些实施方式中，所述检测抗体 可偶联有酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)，以协助检测所述复合物。在 其它实施方式中，所述试验中可使用结合所述检测抗体的酶(例如，HRP或AP)偶联二级抗 体。通常，所述复合物随后用发光底物检测，例如，Ultra LITE (NAG研究实验室公司((NAG Research Laboratories)) ； SensoLyte (AnaSpec 公司)；SuperSignal ELISA 飞克级最 高灵敏度底物(赛默飞世尔(Thermo Scientific)) ；SuperSignal ELISA皮克级化学发光 底物(赛默飞世尔)jPCPSD(3-(4-甲氧基螺旋{1，2_ 二氧杂环丁烷-3，2’-(5’_氯)三环 [3. 3. 1. 13，7]癸烷}_4_基)磷酸苯二钠盐；Tropix公司)。所述CPSD底物可见于化学发 光检测系统中，例如ELISA-Light 系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))。在 一个优选实施方式中，所述BCR-ABL夹心ELISA包括使用抗BCR-N抗体作为捕获抗体，其中 所述捕获抗体限制在固体支持物上如微板孔，且HRP偶联的抗ABL-C抗体用作检测抗体，其 中所述检测抗体可包括活化状态非依赖性抗体或活化状态依赖性(如磷酸特异性)抗体。图3C显示用于检测BCR-ABL(510)存在(总水平)和/或活化状态(磷酸化水平)的 示例性夹心ELISA实施方式(500)。采用珠(521a和/或521b)通过例如其羧基或氨基末 端分别移除全长BCR和/或ABL蛋白。然后，通过ELISA和用特异结合部分捕获BCR-ABL 的N末端部分，测定BCR-ABL的总浓度(540 )，并测量活化的BCR-ABL (550 )。还可通过捕 获ABL-C然后将捕获的BCR-ABL融合蛋白与BCR-N特异性检测抗体或ABL-C上磷酸化位置 特异性检测抗体接触，用ELISA分别测定总BCR-ABL(560)和活化的蛋白(570)。在步骤(c)和(d)包括流式细胞(FCM)试验的实施方式中，所述FCM试验可包括荧 光活化细胞分选(FACS)试验。流式细胞分析是用于计数和检验微观分子如细胞的技术，将 其悬浮于液流中并使之通过电子检测仪器。流式细胞分析可同时进行每秒多至上千个分子 的物理和/或化学特征的多参数分析。在流式细胞分析中，单一波长的光束(通常为激光) 直接照射在流体聚焦的液流上。许多检测器对准所述流体通过光束的位点一个与所述光 束成一行(正面散射或FSC)和数个与之垂直(侧面散射(SSC)和一个或多个荧光检测器)。 穿过所述束的约0. 2-约150微米的各悬浮颗粒使射线散射，颗粒中发现的或结合所述颗粒 的荧光化学物可激发成发射比光源波长更长的光。散射光和荧光的组合由检测器并通过分 析各检测器亮度的波动(各荧光的发射峰值用一个)来挑选，然后可得出关于各个体颗粒的 物理和化学结构的各类信息。FSC与细胞体积关联，SSC取决于所述颗粒的内部复杂度。一 些流式细胞分析不需要荧光且仅用光散射测量，而其他流式细胞分析形成各个体颗粒的荧 光、散射光和透射光的图像。FACS是一种特殊类型的流式细胞分析。其提供将异质颗粒混合物分选到两种或多 种容器中的方法，一次一种颗粒，其基于各颗粒的特定光散射和荧光特征。它是有用的科学 仪器，因为其提供个体颗粒荧光信号的快速、客观和定量的记录以及具体感兴趣的颗粒的 物理分离。颗粒悬浮液夹带在狭窄、快速流动的液流中央。安排所述流动从而相对于颗粒 直径产生颗粒间的大间隔。振荡机制引起颗粒流碎为个体小滴。调整所述系统从而每个小 滴极少可能含多于一种颗粒。在流体碎为小滴之前，所述液流穿过检测各颗粒的感兴趣荧 光特征的荧光检测位置。充电环就置于流体碎为小滴的位点。基于之前刚进行的荧光强度检测将电荷置于所述环上，且相反电荷在流体碎为小滴时陷于小滴上。然后带电的小滴穿 过静电偏移系统，其根据电荷将小滴转移到容器中。在一些系统中，所述电荷直接应用于所 述液流，且碎裂的小滴保留与所述液流一祥符号的电荷。然后所述小滴碎裂后，所述液流恢 复中性。FACS试验可用获自BD生物科学公司(加利福尼亚州圣何赛)的FACS Calibur流 式細胞仪进行。在某些实施方式中，用在不同表位结合感兴趣靶标如BCR-ABL的两种抗体进行 FACS试验，从而第一(捕获)抗体的结合不干扰第二(检测)抗体。在优选的实施方式中， 所述第一(捕获)抗体结合所述第一全长蛋白的第二不同结构域(如BCR-N)且所述第二(检 測)抗体结合所述第二不同全长蛋白的第一结构域(如ABL-C)。在某些实施方式中，所述捕 获抗体结合珠如聚苯乙烯珠，且所述珠内部用荧光团染色。在一些实施方式中，所述检测抗 体可偶联荧光团或酶，以帮助检测所述复合物。所述检测抗体可包括活化状态非依赖性抗 体或活化状态依赖性(如磷酸特异性)抗体。在其它实施方式中，所述试验中可使用结合所 述检测抗体的荧光团、酶或其他检测部分。通常，所述复合物随后可如上所述检測。在步骤(c)和(d)包括标记分选试验的实施方式中，所述标记分选试验可包括 LuniinexぐH式验。LuniinexH式验可获自例如英杰公司(Invitrogen Corporation(加利福 尼亚州卡尔斯巴德))。在一些情况中，所述标记分选试验包括多重Luminex 试验形式。 通常，选择在不同表位结合感兴趣靶标如BCR-ABL的两种抗体，从而第一(捕获)抗体的结 合不干扰第二(检测)抗体。在优选的实施方式中，所述第一(捕获)抗体结合所述第一全 长蛋白的第二不同结构域(如BCR-N)且所述第二(检测)抗体结合所述第二不同全长蛋白 的第一结构域(如ABL-C)。在某些实施方式中，所述捕获抗体结合聚苯乙烯珠，且所述珠内 部用不同強度的红色和红外荧光团染色。在一些实施方式中，所述检测抗体可偶联荧光团 或酶，以帮助检测所述复合物。所述检测抗体可包括活化状态非依赖性抗体或活化状态依 赖性(如磷酸特异性)抗体。在其它实施方式中，所述试验中可使用结合所述检测抗体的荧 光团、酶或其他检测部分。通常，所述复合物随后可例如通过使用检测系统如Luminex 100 或200 检测系统来检測，其中所述珠可根据各分析物的分类和定量在单个文件中由 双波长激光器读取。图3D显示用于检测BCR-ABL(610)存在(总水平)和/或活化状态(磷酸化水平)的 示例性流式細胞分析和标记分选实施方式(600)。采用珠(621a和/或621b)通过例如其羧 基或氨基末端分別移除全长BCR和/或ABL蛋白。然后使用通过特定捕获部分来特异性捕 获BCR-ABL氨基部分的珠和对ABL的C末端特异的珠。总蛋白(640)通过计数具有两种特 定标记或颜色的珠的分子来測定。相似地，活化蛋白的量可通过使用具有ABL磷酸化部分 和BCR-ABL N末端特异性捕获抗体的珠来測定。通过计数这两种特定颜色珠或标记，测量活 化的BCR-ABL量(650)。还可通过捕获具有特定捕获珠的ABL的C末端并将捕获的BCR-ABL 融合蛋白与对BCR-N特异的珠或对ABL磷酸化部分特异的珠接触，测定总BCR-ABL(660)和 活化的蛋白(670)。通过计数这两种特定颜色珠或标记，測量BCR-ABL蛋白的总量(660)和 活化量(670)。适用于如图3A-3D所示測量BCR-ABL总蛋白和/或活化蛋白水平方法的抗体的非 限制性示例包括下表1中所列的那些。表1本发明BCR-ABL试验的示例性抗体。
权利要求
1.一种测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括 (a)将细胞提取物与对第一全长蛋白的第一结构域特异的第一结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转变为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不存在，所述融合蛋白包含与第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第二不同结构域； (b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白的细胞提取物； (C)将步骤(b)中的细胞提取物与对所述第一全长蛋白的第二不同结构域特异的第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转变为含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和 (d)測定步骤(C)中复合物的水平或活化状态，从而測定所述致癌融合蛋白的水平或活化状态。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞提取物含分离自样品的细胞的提取物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品选自下组全血、血清、血浆、尿液、痰、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物(FNA )、和其组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样品获自癌症患者。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌症由癌细胞中染色体移位形成的致癌融合蛋白引起。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述癌症是血液恶性肿瘤、成骨肉瘤或软组织肉瘤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血液恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离细胞选自下组循环肿瘤细胞、白细胞、及其组合。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离细胞用生长因子体外刺激。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离细胞在生长因子刺激前与抗癌药孵育。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离细胞在生长因子刺激后裂解以产生细胞提取物。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离细胞在裂解前未清洗以产生细胞提取物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白选自下组BCR-ABL, DEK-CAN、E2A-PBX1、RARa-PML, IREL-URG, CBFP -MYHlI、AML1-MTG8、EffS-FLI,LYT-IO-Ca I、HRX-ENL, HRX-AF4、NPM-ALK, IGH-MYC, RUNXI-ETO, TEL-TRKC, TEL-AMLUMLL-AF4、TCR-RBTN2、C0L1A1-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、TPR-MET和其组合。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白是BCR。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白的第一结构域包括BCR的羧基末端区域(BCR-C)。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白的第二不同结构域包括BCR的氨基末端区域(BCR-N)。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二不同全长蛋白是ABL。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第二不同全长蛋白的第一结构域包括ABL的羧基末端区域(ABL-C)。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白是ABL。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第二不同全长蛋白是BCR。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自下组磷酸化状态、泛素化状态、复合状态和其组合。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL且所述活化状态是磷酸化状态。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含測定ー种或多种信号转导分子的水平或活化状态。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述ー种或多种信号转导分子是BCR-ABL底物。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述BCR-ABL底物选自下组CRKL、JAK2、STAT5、VAV、BAP-I、和其组合。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一结合部分包含第一抗体。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一抗体连接固相支持物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二结合部分包含第二抗体。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第二抗体连接固相支持物。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述第二抗体限制在可寻址阵列的固相支持物上。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(d)包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞分析试验、标签分选试验。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述ELISA包括夹心ELISA。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在干，所述流式细胞分析试验包括荧光激活细胞分选(FACS)试验。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述标签分选试验包括LuminexH式验。
39.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(d)包括邻近双重检测试验。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，步骤(c)还包括 (c’ )将步骤(b)中的细胞提取物与第三结合部分和第四结合部分在适于转化细胞提取物中存在的致癌融合蛋白成为含所述致癌融合蛋白与所述第二、第三和第四结合部分的复合物的条件下接触， 其中所述第三结合部分用辅助部分标记并对下述之ー特异(i)所述第二不同全长蛋白的第一结构域；(ii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域；或(iii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域和所述第二不同全长蛋白的第一结构域的融合位置， 其中所述第四结合部分用信号放大对的第一元件标记，且对所述第二不同全长蛋白的第一结构域特异，和 其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂；和 其中步骤⑷还包括 (d’ )用信号放大对的第二元件孵育步骤(c’ )中的复合物，生成放大的信号；和 (d” )检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的细胞提取物与所述第二结合部分稀释系列接触，形成多种含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物。
42.如权利要求40或41所述的方法，其特征在于，所述第三和第四结合部分分别包括第三和第四抗体。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第三和第四抗体均为活化状态非依赖性抗体。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在干，所述信号放大对的第一和第二元件与致癌融合蛋白的总量相关。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第三抗体是活化状态非依赖性抗体且所述第四抗体是活化状态依赖性抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在干，所述信号放大对的第一和第二元件产生的放大信号与活化的致癌融合蛋白量相关。
47.如权利要求40-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三结合部分直接标记有所述辅助部分。
48.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四结合部分直接标记有所述信号放大对的第一元件。
49.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四结合部分通过偶联第二检测抗体的结合对第一元件和偶联所述信号放大对第一元件的结合对第二元件之间的结合而标记有所述信号放大对的第一元件。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述结合对的第一元件是生物素。
51.如权利要求49或50所述的方法，其特征在于，所述结合对的第二元件是链霉亲和素。
52.如权利要求40-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述辅助部分是葡萄糖氧化酶。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在干，所述葡萄糖氧化酶和所述第三结合部分偶联巯基活化的右旋糖苷分子。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述巯基活化的右旋糖苷分子的分子量为 500kDa。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是过氧化氢(H2O2)15
56.如权利要求55所述的方法，其特征在干，所述信号放大对的第一元件是过氧化物酶。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP) ο
58.如权利要求56所述的方法，其特征在干，所述信号放大对的第二元件是酪酰胺试齐 。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述放大信号由生物素-酪胺的过氧化物酶氧化产生活化的酪胺而生成。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺被直接检测。
62.如权利要求60所述的方法，其特征在干，所述活化的酪胺在添加信号检测剂后检測。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素标记的突光团。
64.如权利要求62所述的方法，其特征在干，所述信号检测试剂是链霉亲和素标记的过氧化物酶和生色试剂的组合。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述生色试剂是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。
66.如权利要求1-65中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括 (e)将细胞提取物与对所述第二不同全长蛋白的第二结构域特异的第五结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第二不同全长蛋白转化为含所述第二不同全长蛋白和所述第五结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第二不同全长蛋白的第二结构域在所述致癌融合蛋白中不存在；和 (f)将步骤(e)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第二不同全长蛋白的细胞提取物； 其中步骤(e)在步骤(a)之前、之中或之后进行。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述第五结合部分包括第五抗体。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述第五抗体连接固相支持物。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。
70.ー种给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括 (a)给予抗癌药后分离癌细胞； (b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；(C)按照权利要求1-69中任一项所述的方法測量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和 (d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平作比较；和 (e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL。
72.如权利要求70或71所述的方法，其特征在于，所述对象在接受所述疗程前确定具有表达所述致癌融合蛋白的癌细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述对象为BCR-ABL阳性。
74.如权利要求70-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白的表达水平和活化水平均在所述细胞提取物中測量。
75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，步骤(c)还包括计算活化的致癌融合蛋白水平与总致癌融合蛋白水平之比。
76.如权利要求75所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括对比所计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比和所述对象早期计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比。
77.如权利要求75或76所述的方法，其特征在于，所计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比与抗癌药处理后活化致癌融合蛋白的抑制百分比关联。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比与对照蛋白水平相关。
79.如权利要求75-78中任一项所述的方法，其特征在于，所述计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比包括磷酸/总BCR-ABL蛋白水平之比。
80.如权利要求78或79所述的方法，其特征在于，所述对照蛋白包括含所述致癌融合蛋白内发现的序列或结构域的天然全长蛋白。
81.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其特征在于，所述对照蛋白选自下组全长BCR、全长ABL、和其组合。
82.如权利要求70-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白活化水平的抑制低于约50%表明需要増加所述疗程的后续剂量或给予不同疗程。
83.如权利要求70-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白活化水平的抑制低于约50%表明所述对象未依从所述疗程、存在与所述疗程相关的可能的副作用或毒性、或其组合。
84.如权利要求70-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白活化水平的抑制高于约80%表明所述患者在以正确的剂量进行正确的疗程。
85.如权利要求70-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是慢性髓细胞性白血病(CML)。
86.如权利要求70-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自下组单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗、和其组合。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组甲磺酸伊马替尼(Gleevec )、尼洛替尼(Tasigna )、达沙替尼(Sprycel )、博舒替尼(SKI-606)、和其组合。
88.如权利要求70-87中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(e)替代地包括 (c’ )測量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白和途径中ー种或多种信号转导分子的表达和/或活化水平；和 (d’ )将所测致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平作比较；和 (e’)基于步骤(d’)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。
89.—种选择用于治疗癌症的合适抗癌药的方法，所述方法包括 (a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； (b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； (c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法測量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和 (d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的參比水平和/或活化分布，測定所述抗癌药适合或是不适合用于治疗癌症。
90.一种鉴定癌症对抗癌药治疗响应的方法，所述方法包括 (a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； (b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； (c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法測量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和 (d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的參比水平和/或活化分布来鉴定所述癌症对所述抗癌药治疗响应或是不响应。
91.一种预测患癌对象响应抗癌药治疗的方法，所述方法包括 (a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； (b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； (c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法測量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和 (d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的參比水平和/或活化分布来预测所述对象响应抗癌药治疗的可能性。
92.一种测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗的方法，所述方法包括 (a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； (b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； (c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法測量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和 (d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时或早期存在抗癌药时产生的參比水平和/或活化分布来測定所述对象对所述抗癌药治疗耐受或是敏感。
93.如权利要求89-92中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是慢性髓细胞性白血病(CML)。
94.如权利要求89-93中任一所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自下组单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗、和其组合。
95.如权利要求94所述的方法，其特征在干，所述单克隆抗体选自下组曲妥珠单抗(Her cep tin )、阿来组单抗(Campath *")、贝伐单抗(Avastins)、西妥昔单抗(Erbitux8·)、吉姆单抗(Mylotarg'、)、帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗(Rituxan )、和托西莫单抗(BEXXAR4*);和其组合。
96.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组甲磺酸伊马替尼(Gleevec )、尼洛替尼(Tasigna )、达沙替尼(SpryceP)、博舒替尼(SKI-606)、吉非替尼(Iressa )、舒尼替尼(Sutentis)、埃罗替尼(Tarceva )、拉帕替尼(Tykerb#)、卡纽替尼(Cl 1033)、塞马悉尼(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY43-9006)、来氟米特(SUlOl)、凡德他尼(ZACTIMA ;ZD6474)、和其组合。
97.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组甲磺酸伊马替尼(Gleevec*")、尼洛替尼(TasignaRI)、达沙替尼(Sprycel )、博舒替尼(SKI-6O6)、和其组合。
98.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自下组培美曲塞(ALIMTA%*西他滨(Gemzar )、西罗莫司(雷帕霉素)、雷帕霉素类似物、钼化合物、卡钼、顺钼、沙钼、紫杉醇(Taxol )、多西他赛(Taxoteree)、坦西莫司(CCI-779)、依维莫司(RADOOl)、和其组合。
99.如权利要求94所述的方法，其特征在干，所述激素治疗剂选自下组芳香酶抑制齐U、选择性雌激素受体调节剂、类固醇、非那雄胺、促性腺激素释放激素激动剂、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物、和其组合。
100.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述放疗剂选自下组47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、1(l5Rh、mAg、mIn、117mSn、149Pm、153Sm、166HO、177Liu 186Re、188Re、211At、和212Bi、和其组合。
全文摘要
本发明提供用于检测生物样品如全血或肿瘤组织中一种或多种致癌融合蛋白的活化状态和/或总量的基于抗体的阵列及其使用方法。在某些情况下，样品中存在的所述致癌融合蛋白的活化状态和/或总量可与一种或多种信号转导分子联合测量。本发明的组合物和方法具有酶联免疫吸附实验相关的特异性、信号放大相关的灵敏度、和微阵列相关的高通量多重性的优势。
文档编号G01N33/50GK102667478SQ201080058150
公开日2012年9月12日 申请日期2010年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者S·辛格, X·刘 申请人:普罗米修斯实验室股份有限公司