专利名称：：在食物中发现的酚类化合物的协同相互作用的制作方法在食物中发现的酚类化合物的协同相互作用相关申请的交叉引用要求2009年10月20日提交的美国临时专利申请61/279，368;2010年3月2日提交的美国临时专利申请61/339，244;和2010年7月14日提交的美国临时专利申请61/399，548的权益，在此通过引用将它们并入。
背景技术：
：植物产生酚类化合物，以起到细胞信号传导分子、抗氧化剂、或侵袭害虫的毒素(Crozier和其他人,2006)的作用。研究已经探讨了水果成分(Robards和其他人，1999;Franke和其他人，2004；Harnly其他人，2006)，主要的重点放在酚类化合物上，这是因为它们的高抗氧化能力。在水果中发现的浓度下的单个酚类化合物的抗氧化能力和全果的抗氧化能力之间有差异(Miller和Rice-Evans,1997;Zheng和Wang,2003);全果的抗氧化能力更高。针对该差异的可能的解释可包括水果中未被识别的化合物、以低浓度存在于水果中的很多化合物的总和或酚类化合物之间的协同相互作用。LiIa和Raskin(2005)讨论了植物内可改变其药理学作用的内相互作用(endointeraction)或相互作用、以及外相互作用(exointeraction)方面的相加或协同增强，所述相互作用为不相关的植物成分和/或药物之间的相互作用。通过外相互作用的抗氧化协同作用已经受到了ー些关注。Yang和Liu(2009)报告了苹果提取物和槲皮素3-β-D-葡萄糖苷的组合显示了对人乳腺癌细胞的协同抗増殖活性。大豆和苜蓿植物雌激素提取物和针叶楼桃(acerolacherry)提取物的组合协同地起作用，抑制LDL体外氧化(Hwang和其他人，2001)。Liao和Yin(2000)说明了在Fe2+-诱导的脂质氧化系统中与单独的任一化合物相比，α-生育酚和/或抗坏血酸与咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、杨梅黄酮、五倍子酸、槲皮素和芸香苷的组合具有更大的抗氧化活性。目前的兴趣在于开发或发现有效的天然防腐剂(Galal，2006)。方法包括使用提取物(Serra和其他人，2008;Conte和其他人，2009)、酌·类化合物(Rodr'iguezVaquero和Nadra,2008)或作为抗菌剂的化合物的混合物(Oliveira和其他人，2010)。理解潜在抗氧化混合物功能之后的机制对于它们作为防腐剂的潜在开发是重要的。參考文献Amie1D,Davidovi1cD,Be.sloD,RastijaV,Lu.cB,Trinajsti1oftheantioxidantactivityoffiavonoids.CurrMedChem14:827-45.Bravo,L,1998.Polyphenols:Chemistry,dietarysources,metabolism,andnutritionalsignificance.NutritionReviews56,317-333.BuettnerGR.1993.Thepeckingorderoffreeradicalsandantioxidants:lipidperoxidation,alpha-tocopherol,andascorbate.ArchBiochemBiophys300:535-43.ConteA,ScroccoC,SinigagliaM,DelNobileMA.2009.Lemonextractasnaturalpreservativeinfruitsalad.JFoodSaf29:601-16.CrozierA,CliffordMN,AshiharaHjeds.2006.Plantsecondarymetabolites.Oxford:Blackwe11Publishing.372p.CuvelierC，BondetV，BersetC.2000.Behaviorofphenolicantioxidantsinapartitionedmedium:structure-activityrelationship.JAmOilChemSoc77:819-23.DavalosA,Gomez-CordovesCjBartolomeB.2004.ExtendingApplicabilityoftheOxygenRadicalAbsorbanceCapacity(ORAC-Fluorescein)Assay.JAgricFoodChem52:48-54.Delgado-VargasjF.;Jimenez,A.R.;Paredes-Lopezj0.,2000.Naturalpigments:Carotenoidsjanthocyanins,andbetalains—Characteristics，biosynthesis,processing，andstability.CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition40，173—289.DiMajoD，GiammancoM，LaGuardiaM，TripoliE，GiammancoS，FinottiE.2005.Flavanonesincitrusfruit:structure-antioxidantactivityrelationships.FoodResInt38:1161-6.FoleySjNavaratnamSjMcGarveyDJjLandEJjTruscottTGjRice-EvansCA.1999.Singletoxygenquenchingandtheredoxpropertiesofhydroxycinnamicacids.FreeRadicBiolMed26:1202-208.FrankeA,CusterLjArakakiCjMurphyS.2004.VitaminCandflavonoidlevelsoffruitsandvegetablesconsumedinHawaii.JFoodCompostAnal17:1-35.FrankelEN，HuangSWjKannerJ，GermanJB.1994.Interfacialphenomenaintheevaluationofantioxidants:bulkoilvs.emulsions.JAgricFoodChem42:1054-9.Freeman,B.;EggettjD.;Parker,T.Synergisticandantagonisticinteractionsofphenoliccompoundsfoundinnaveloranges.J.Food.Sci.2010，inpress.GalalAM.2006.Naturalproduct-basedphenolicandnonphenolicantimicrobialfoodpreservativesandI,2,3,4-tetrahydroxybenzeneasahighlyeffectiverepresentative:areviewofpatentliterature2000-2005.RecentPatAntiinfectDrugDiscov1:231-9.GitzjD.;LiujL.;McClure，J.PhenoIicmetabolism,growth,anduv_btoleranceinphenylalanineammonia_lyase—inhibitedredcabbage.Phytochemistry.1998，49，377-386.HalliwelljB.，Zhao,K.，Whiteman,M.，2000.Thegastrointestinaltract:AmajorsiteofantioxidantactionFreeRadicalsResearch33，819—830.HarnlyJMjDohertyRF,BeecherGR，HoldenJMjHaytowitzDB,BhagwatS，GebhardtS.2006.FlavonoidcontentofU.S.fruits,vegetablesandnuts.JAgricFoodChem54:9966-77.Hidalgo,M.;Sanchez-MorenojC;dePascual-TeresajS.，2010.Flavonoid-flavonoidinteractionanditseffectontheirantioxidantactivity.FoodChemistry121，691-696.HwangJ，HodisHNjSevanianA.2001.Soyandalfalfaphytoestrogenextractsbecomepotentlow-densitylipoproteinantioxidantsinthepresenceofacerolacherryextract.JAgricFoodChem49:308-14.J01*gensenLVjSkibstedLH.1998.Flavonoiddeactivationofferrylmyoglobininrelationtoeaseofoxidationasdeterminedbycyclicvoltammetry.FreeRadicRes28:335-51.JovanovicSVjSteenkenS，TosicMjMarjanovicB，SimicMG.1994.Flavonoidsasantioxidants.JAmChemSoc116:4846-51.KogaTjTeraoJ.1995.Phospholipidsincreaseradical-scavengingactivityofvitaminEinabulkoilmodelsystem.JAgricFoodChem43:1450-4.LiaoKjYinM.2000.Individualandcombinedantioxidanteffectsofsevenphenolicagentsinhumanerythrocytemembraneghostsandphosphatidylcholineliposomesystems:importanceofthepartitioncoefficient.JAgricFoodChem48:2266-70.LilaMAjRaskinI.2005.Health-relatedinteractionsofphytochemicals.JFoodSci70:R20-7.MillerNJjRice-EvansCA.1997.Therelativecontributionsofascorbicacidandphenolicantioxidantstothetotalantioxidantactivityoforangeandapplefruitjuicesandblackcurrantdrink.FoodChem60:331-7.OliveiraCEVjdeStamfordTLMjGomesNetoNJjdeSouzaEL2010.InhibitionofStaphylococcusaureusinbrothandmeatbrothusingsynergiesofphenolicsandorganicacids.IntJFoodMicrobiol137:312-16.OsmanijS.A.;Hansen,E.H.;Malien-AubertjC;Olsen,C.-E.;BakjS.;MOIIerjB.L.,2009.Effectofglucuronosylationonanthocyanincolorstability.JournalofAgriculturalandFoodChemistry57，3149-3155.OuB，HuangDjHampsch-WoodillM，FlanaganJA，DeemerEK.2002.Analysisofantioxidantactivitiesofcommonvegetablesemployingoxygenradicalabsorbancecapacity(ORAC)andferricreducingantioxidantpower(FRAP)assays:acomparativestudy.JAgricFoodChem50:31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发明内容酚类化合物已知具有抗氧化和抗菌性质。这些性质可用于食物或饮料的保存。食物内酚类化合物的交互抗氧化能力还没有被很好地探究。理解水果抗氧化剂的组合如何一起作用将有助于它们未来在食物和/或饮料保存中的使用。ー个方面为发现抗氧化酚类化合物的协同组合存在于食物中。协同的内相互作用发生在抗氧化剂本身之间的发现是重要的。另ー个方面为用于确定抗氧化剂的协同组合的系统，以及发现协同作用部分取决于这些抗氧化化合物存在于混合物中的比率。另ー个方面为使用食物例如水果作为模型，用于确定可能的协同抗氧化组合和比率。与其进行尝试所有存在于食物中的抗氧化剂可能的比率和组合的不切实际地漫长和昂贵的过程，不如组合并以它们存在于食物中的比率试验抗氧化剂。以此方式，将试验更可能具有协同抗氧化能力的组合。ー个方面为制造具有协同抗氧化能力的营养添加物的方法。在食物中，至少两种抗氧化化合物在食物中被识别，并且它们各自的抗氧化能力被确定。另外，食物中它们相互的比率即食物比率被确定。通过确定混合物的抗氧化能力是否大于相加或预期的能力——其为单独来看混合物中化合物抗氧化能力之和，可确定是否在化合物之间在抗氧化能力上存在协同作用。抗氧化化合物为具有抗氧化能力的化合物。任何合适的系统可被用于测量抗氧化能力。在实施例中，单ー化合物和混合物的抗氧化能力通过氧自由基吸收能力(ORAC)分析被确定。当目标之ー是表明结果潜在应用于人营养或食物保存吋，由于其在学术研究之外常用和熟悉，在抗氧化分析的很多选择中选择氧自由基吸收能力(ORAC)分析。然而，考虑确定抗氧化能力的任何合适的方法。合适的方法包括但不限于；ORAC-氧自由基吸收能力分析，NORAC-过亚硝酸盐ORAC分析，HORAC-羟基ORAC分析，ORAC-PG-氧自由基吸收能力连苯三酚红分析，DPPH-2,2_ニ苯基-I-苦基肼基自由基分析，FRAP-血衆的三价铁还原能力分析，TEAC-Trolox等同物抗氧化能力分析，VCEAC-维生素C等同物抗氧化能力分析，ABTS-2丨-连氮基双-(3-こ基苯并噻唑啉_6_磺酸)分析，CUPRAC-ニ价铜还原抗氧化能力分析，TRAP-总自由基捕获抗氧化參数分析，以及CAA-细胞抗氧化活性分析。抗氧化混合物中的协同作用通过首先形成以食物比率包括至少两种抗氧化化合物的混合物并确定混合物的抗氧化能力进行确定，该食物比率为食物中化合物彼此的比率。协同作用通过将混合物的抗氧化能力与预期的或相加的抗氧化能力值比较确定。该相加值为，単独来看或假定每个都独立地起作用，混合物的单个抗氧化化合物中每ー个的组合抗氧化能力。该比较可通过从所有抗氧化化合物的混合物所得的抗氧化能力中减去各个化合物抗氧化能力之和进行计算。正结果表明协同作用。负或统计学上小正值或无值表明化合物之间的对抗作用或无相互作用。在进行抗氧化能力的測量中，几个样品的平均将给出统计学上更好的值。另ー个方面为通过形成具有协同抗氧化能力的化合物的混合物制成的营养添加物，其为某些抗氧化化合物的混合物，相互之间的比率已经确定以具有协同抗氧化性质。已经发现，通过以在具体食物例如水果中发现的浓度比率下的各个酚类抗氧化剂开始，可仅用内相互作用表明所述协同作用。这有助于解释整个食物和单个成分之间的抗氧化能力差异，并且也形成优化的水果源抗氧化防腐剂的开发依据。食物包括任何种植用于人消费的植物来源的食物，包括已经受到后加工的食物，后加工例如干燥、冷冻、加热(包括巴氏消毒)、与其他成分混合，或任何在被制成可用于人消费前应用于食物的加工。任何包含酚类抗氧化化合物的食物被考虑作为食物，并且可被分析以确定抗氧化化合物的协同组合。例子包括水果(例如以下举例说明的橙子、草莓和蓝莓)、蔬菜、坚果、鸡蛋、植物油、谷物(包括黒米)、大豆、巧克力、肉桂、牛至、发酵酒(红葡萄酒)、茶和咖啡。某些肉包括抗氧化剂，例如家禽和鱼，并且可被考虑为用于确定协同抗氧化剂比率的食物。图I:组合减去组合中各个化合物(等式I至等式3)的氧自由基吸收能力(ORAC)差异。所示出的所有组合都是统计学上显著的(P〈0.05，利用Fisher’s最小显著性差异)；统计学上不显著的组合没有示出。C=绿原酸；H=橙皮苷；L=藤黄菌素；M=杨梅黄酮；N=柚配基；P=对香豆酸；Q=槲皮素。HC表示H和C的混合物的ORAC减去H的ORAC和C的0RAC，对于其他组合也同样。每个值都是4次重复的平均值。图2:在橙子中发现的浓度下的3种酚类化合物组合的氧自由基吸收能力(ORAC)减去2+1ORAC数据之和(等式4)。以此方式分析数据解释了组合模式(pattern)并使其有可能确定哪种化合物相互作用对ORAC最有影响(见进一步讨论的正文)。所示出的所有组合都是统计学上显著的(P〈0.05，利用ANOVA估算)；统计学上不显著的组合未示出。C=绿原酸；H=橙皮苷；L=藤黄菌素；M=杨梅黄酮；N=柚配基；P=对香豆酸；Q=槲皮素。HC+N表示H、C和N的混合物的ORAC减去HC的混合物的ORAC和N的0RAC，对于其他组合也同样。每个值都是4次重复的平均值。图3:在橙子中发现的浓度下的4种酚类化合物的组合的氧自由基吸收能力(ORAC)减去3+1ORAC数据之和(等式5)。以此方式分析数据解释了组合模式并使其有可能确定哪种化合物相互作用对ORAC最有影响(见进一步讨论的正文)。所示出的所有组合都是统计学上显著的(P〈0.05，利用ANOVA估算)；统计学上不显著的组合未示出。C=绿原酸；H=橙皮苷；L=藤黄菌素；M=杨梅黄酮；N=柚配基；P=对香豆酸；Q=槲皮素。HC+N表示H、C和N的混合物的ORAC减去HC的混合物的ORAC和N的0RAC，对于其他组合也同样。每个值都是4次重复的平均值。图4:酚类化合物的结构和它们的单电子还原电势。图5:草莓中抗氧化化合物的结构。图6:蓝莓中各个化合物的ORAC。图7:1:1比率的混合物和水果比率混合物与预期结果相比较的0RAC。发明详述实施例I脐橙中发现的酚类化合物的协同和对抗相互作用针对它们的抗氧化能力分析了脐橙(甜橙)中发现的浓度下的各个酚类化合物(绿原酸、橙皮苷、藤黄菌素、杨梅黄酮、柚配基、对香豆酸和槲皮素)的相互作用，以观察潜在的对抗、相加、或协同相互作用。制备2、3和4种酚类化合物的混合物。氧自由基吸收能力(ORAC)分析用于定量这些组合的抗氧化能力。发现2种化合物的三种不同的组合和3种化合物的5种组合是协同的。也发现2种化合物的ー种对抗组合。添加第四种化合物，无另外的协同作用发生。开发了ー种模型以解释该結果。还原电势、相对浓度和儿茶酚(邻ニ羟基苯)基团的存在与缺少是模型中的因子。材料和方法化学品通过FisherScientificInc.(Waltham,Mass.，U.S.A.)购买Trolox((±)_6_轻基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸)(97%纯度，AcrosOrganics)、柚配基(95%,MPBiomedicalsInc.)、槲皮素水合物(95%,AcrosOrganics)、氢氧化钠(50%溶液)、K2HPO4和KH2PO4(MallinckrodtInc·)。hkSigma-Aldrich(St.Louis,Mo.,U.S.A.)购买绿原酸(95%)、橙皮苷(>80%)、藤黄菌素(99%)、杨梅黄酮(95%)、对香豆酸(98%)和荧光素(Na盐)ο从WakochemicalsU.S.A.Inc.(Richmond,Va.,U.S.A.)购买AAPH(2,2，-偶氣ニ(2-甲基丙基味)ニ盐酸)。化学物质制备选择橙子中发现的七种最浓的酚类绿原酸、橙皮苷、藤黄菌素、杨梅黄酮、柚配基、对香豆酸和槲皮素(Proteggente和其他人,2003；Franke和其他人,2004；USDA类黄酮数据库，2007)。除橙皮苷外，每种都在引用的參考文献中作为糖苷配基(aglycone)定量。所有化合物以公布的浓度制备(表I)。表I选择的脐橙中发现的酚类化合物和量。化合物Mg/100g新鲜水果绿原酸αΤθ橙皮苷31藤黄菌素01杨梅黄酮0.0权利要求1.一种确定具有协同抗氧化能力的营养添加物的组成的方法，包括(a)识别食物中的抗氧化化合物；(b)測量所述食物中识别的至少两种所述抗氧化化合物的食物比率，所述食物比率为所述至少两种化合物的一个与另一个之间的比率；(C)測量所述至少两种抗氧化化合物的抗氧化能力；(d)以它们的食物比率，形成所述至少两种抗氧化化合物的混合物；(e)測量所述混合物的抗氧化能力；(f)通过将所述混合物的抗氧化能力与基于所述混合物中所述抗氧化化合物的单独抗氧化能力值之和所预期的抗氧化能力相比较，确定所述混合物是否具有协同抗氧化性质，当所述抗氧化能力大于所述预期的抗氧化能力时显示协同作用。2.根据权利要求I所述的方法，另外包括在所述至少两种抗氧化化合物的至少ー种是不同的情况下，对于识别的至少两种抗氧化化合物重复(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。3.根据权利要求I所述的方法，其中四种或更多种抗氧化化合物被识别，并且所述混合物包括至少三种所述抗氧化化合物的组合。4.根据权利要求2所述的方法，其中至少三种抗氧化化合物被识别，并且对于两种或三种抗氧化化合物的可能组合的另外混合物进行所述重复。5.根据权利要求4所述的方法，其中对于两种或三种抗氧化化合物的所有可能混合物进行所述重复。6.—种包括抗氧化化合物的营养添加物，所述抗氧化化合物基本上由两种或三种抗氧化化合物以提供协同抗氧化性质的相互比率组成。7.根据权利要求6所述的营养添加物，其中所述两种或三种抗氧化化合物为由如下确定的相互比率(a)识别食物中的抗氧化化合物；(b)測量所述食物中识别的至少两种所述抗氧化化合物的食物比率，所述食物比率为所述至少两种化合物的一个与另一个之间的比率；(C)測量所述至少两种抗氧化化合物的抗氧化能力；(d)以它们的食物比率，形成所述至少两种抗氧化化合物的混合物；(e)測量所述混合物的抗氧化能力；(f)通过将所述混合物的抗氧化能力与基于所述混合物中所述抗氧化化合物的单独抗氧化能力值之和所预期的抗氧化能力相比较，确定所述混合物是否具有协同抗氧化性质，当所述抗氧化能力大于所述预期的抗氧化能力时显示协同作用。8.根据权利要求I所述的方法，其中所述食物为水果。9.根据权利要求I所述的方法，其中所述抗氧化能力由以下測量氧自由基吸收能力分析(ORAC)、过亚硝酸盐ORAC分析(NORAC)、羟基ORAC分析(HORAC)、氧自由基吸收能力连苯三酚红分析(ORAC-PG)、.2，2-ニ苯基-I-苦基肼基自由基分析(DPPH)、血浆的三价铁还原能力分析(FRAP)、Trolox等同物抗氧化能力分析(TEAC)、维生素C等同物抗氧化能力分析(VCEAC)、2’-连氮基双-(3-こ基苯并噻唑啉-6-磺酸)分析(ABTS)、ニ价铜还原抗氧化能力分析(CUPRAC)、总自由基捕获抗氧化參数分析(TRAP)或细胞抗氧化活性分析(CAA)。10.根据权利要求I所述的方法，其中所述抗氧化能力通过ORAC測量。全文摘要多种抗氧化化合物的协同营养添加物，其比率源自自然产生的食物中的比率。文档编号G01N33/02GK102667469SQ201080058083公开日2012年9月12日申请日期2010年10月19日优先权日2009年10月20日发明者T·L·帕克申请人:布莱阿姆青年大学