专利名称：测定含雄黄的药物中可溶性砷和价态砷的含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用仿生提取-ICP-MS法測定含雄黄的药物中可溶性神含量的方法，本发明也涉及ー种采用仿生提取-HPLC-ICP-MS法測定含雄黄的药物中可溶性价态砷含量的方法。
背景技术：
雄黄为我国常用的矿物类中药，临床应用的历史已有几千年，最早入药的记载为《神农本草经》，可内服外用且用途广泛。传统医学认为雄黄具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟等功能。自20世纪50年代以来，国内医者将含雄黄的复方制剂或单方用于治疗血液系统疾病、恶性淋巴系统疾病甚至实体瘤，取得了明显的治疗效果。据初步统计，国家标准中收载的含有雄黄的中成药约200个。说明雄黄对于中药来说，有着极其重要的作用。雄黄中所含大量神具有有效性和有毒性双重作用，但由于其用法用量缺乏科学依据，含其制剂中 缺乏相关质控方法，导致了用药的安全性隐患和国际化认可的阻碍。I、雄黄所含的砷具有有效性和有毒性两重作用，安全性限量的缺乏影响其用药安全。它作为复方药物的组成部分，既是药物的有效成分，也是有毒成分。由于缺乏用法用量的科学依据，其安全剂量难以合理评价，用药安全问题一直困扰着我国中药行业。2、雄黄的药效、毒性的物质基础不明严重阻碍了其获得国际认可国际上难以认可高含量的神中药。雄黄及其制剂若以总砷为标准，该类中药的含量将大大高于国际限度标准，使其应用受到限制，从而长期以来一直被国际上认为有毒而限制销售和进ロ。以砷总量作为控制标准缺乏合理性。研究表明，神存在多种不同价态，其毒性存在较大的差异。雄黄现行质量标准中仅对总量砷进行控制，对可溶性砷及价态砷的含量未进行控制，不能反映雄黄在人体实际应用的情况，以元素的总量衡量是否安全是不合理的，也是不科学的。3、雄黄的现有质量标准无法体现有效性和安全性，用法用量缺乏依据我国的2010年版《中国药典》雄黄项下仅收载了的氧化还原滴定法的含量測定方法；缺乏有效性成分的科学质控方法及有毒性成分的限量控制方法；并且其用法用量缺乏科学依据，急需进一歩提高完善。4、大量含雄黄的制剂缺乏相关研究和质控方法，导致实际应用的安全性问题现有的国家标准中收载了含雄黄朱砂的成方制剂约460种；目前中国药典2010年版一部中收录的含雄黄品种有10种、含雄黄和朱砂的品种有23个，未收载到中国药典2010年版一部的品种中，含雄黄的为72种，含雄黄和朱砂的有94种。其中小儿用药品种就有22种之多。如何做到对上述制剂的严格质控和安全使用，急需借鉴雄黄的质控方法。根据《中国药典》2010年版一部，雄黄的主要成分为硫化神(AsS)和四硫化神(As4S4)计，还含有少量游离砷和可溶性砷盐，硫化砷和四硫化神不溶于水，溶于碱，可被硝酸分解，极微溶于热ニ硫化碳和苯中。现有研究证明，雄黄在人工胃液、人工肠液中As (III)的溶出量大于水中的溶出量。随着人们对雄黄及含其制剂的日益重视，现通常认为雄黄的药效及毒性主要来自其所含的少量可溶性神，故对雄黄中的可溶性神的研究近来呈上升趋势。为更好评价、雄黄的药效及毒性作用，有必要对其的可溶性砷进行研究。通过文献查阅，发现每篇文献报道的雄黄中可溶性神方法基本相似，均采用人工胃液或人工肠液作为提取溶剤，但得到的可溶性神含量相差较大。另雄黄饮片与复方制剂中的可溶性神含量也不匹配，各文献结果也不全一致。分析原因，主要与样品处理方法有夫，为能较好提取出雄黄中可溶性神，有必要对供试品前处理方法进行详细的研究。自然界的砷主要以金属神、砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、ニ甲基砷、一甲基砷或砷酸根存在。可溶性神及价态砷具有药效及毒性两方面作用，其神存在的形式及价态对雄黄的毒性存在一定意义，因此需要对雄黄中所含的可溶性砷及价态砷的含量进行研究，以便控制雄黄的毒性。
因此对含雄黄的药物中可溶性砷和价态砷的含量的测定方法进行深入的研究,对保障用药安全和促进国际认可有极为重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术的上述不足，本发明在明确了雄黄的基源及品种的基础上，对具相关性的药材、饮片和制剂进行研究，同时对雄黄药材及饮片建立了体现有效性和安全性的质量标准，对代表性制剂建立了科学的质控方法。在雄黄及含其制剂的质量控制方法和安全性研究方面取得了突破性的进展，为人民用药安全提供了保障。本发明的第一个目的是测定含雄黄的药物中可溶性砷的含量的方法，其特征在于该方法包括步骤(I)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性神；(3) ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性神的含量。本发明中，术语“含雄黄的药物”是指含雄黄成分的药物。本发明中，术语“ICP-MS法，，是指电感耦合等离子体质谱法。根据本发明的ー个优选实施方式，所述含雄黄的药物选自雄黄药材、雄黄饮片和含雄黄的制剂。根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(I)中的仿生溶剂选自人工胃液(胃蛋白酶活力大于等于I : 27000)、人工肠液或其组合；更优选地，仿生溶剂为人工肠液。从模拟人体环境的角度而言，雄黄经胃肠进行吸收，人工胃液与人工肠液是与人体胃液与肠液相当的溶液，因此雄黄应先用人工胃液提取，再用人工肠液提取，两者结果相加才能体现雄黄在人体内的吸收情況。但具体实验吋，因为分离雄黄颗粒有困难，因此操作性不强。如果分别用人工胃液和人工肠液提取的结果之和，与先用人工胃液提取，分离残渣再用人工肠液提取的结果之和相比，结果相当或较大，则可用前者代替后者，以保证试验的简便性及可操作性。本实验分别进行了这两种提取方法的比较，结果人工胃液(先)+人工肠液(后)与人工胃液+人工肠液的含量相差较大，后者含量普遍较前者高二倍，但人工胃液(先)+人工肠液(后)与人工肠液的含量基本相当，说明雄黄主要经胃吸收，到肠后吸收较少，因此可用人工肠液直接提取。因此根据本发明的一个优选的实施方式，用人エ肠液提取，即可代表雄黄在体内的吸收量。
发明人对分别采用超声6小时、振摇24小时，不同转速溶出24小时的方法提取雄黄药材和饮片溶液，结果表明，超声提取的方法得到的可溶性神含量最高，说明该方法可有效提取出可溶性神。溶出是模拟人体环境最佳的方式，但由于雄黄密度较大，一直沉于瓶底，无法有效混悬，影响了溶出了效果。从结果可显示，每分钟250转的结果高于每分钟100转的結果。振摇提取出的可溶性神含量较少，主要原因也是由于雄黄密度较大，振摇不完全。上述的溶出度方法和振摇的方法均无法有效代表雄黄在体内的吸收情况，超声的方法虽远较体内实际吸收方式剧烈，但其所测得的可溶性神含量是雄黄在机体所能吸收的最大可溶性神量，能科学的反映出雄黄中实际存在的可溶性神含量，从而排除了因为病理、生理、人种、年龄、性别等各种因素带来的误差，使雄黄能在同一条件下进行质量比较，最大限度体现了雄黄产生可溶性神的含量，对雄黄的药效及毒性能从根本上进行认识。因此，本发明可以采用超声的提取方式。37°C超声时间为2小时后，可溶性砷的含量基本趋于稳定，从简化实验操作考虑，超声2小时可以满足目前提取效率的要求。但需注意超声时应每隔10-15分钟振摇I次，以避免细小雄黄颗粒粘附于瓶壁，无法完全超声。根据本发明的另ー个优选的实施方式，也可以采用磁力搅拌的方法，经试验，与超 声处理结果一致。。因此，根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(2)中的超声处理/磁力搅拌为大于等于2小吋。雄黄样品经超声/磁力搅拌2小时后，混悬液体处于颗粒高度运动状态，若此时取样，溶液中充满未溶解的雄黄细小颗粒，测得的可溶性神含量会偏高，不能准确代表实际溶剂中的可溶性神。只有待混悬液中未溶解的雄黄细小颗粒全部沉降下来后，此时测得的可溶性砷含量才是实际溶出的量，因此优选地，超声/磁力搅拌后的雄黄提取物进ー步进行净化处理。因此，根据本发明的ー个优选实施方式，所述方法还包括步骤(2)对步骤(I)提取得到的溶液进行净化。发明人推測溶液中神可能有部分大分子化合物存在，浄化方式不恰当会造成大分子神化合物除去。因此，根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(2)中采用(a)先静置，再用滤膜进行浄化；或(b)采用静置进行净化。所述(a)中的静置时间为大于5小时，优选6-8小时；所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。本发明人选择显微镜法进行雄黄样品溶液粒径的考察。采用OLYMPUS CHA显微镜进行測定，倍数为40 X 10倍。根据测得的結果，发现溶液中大多数粒子均在I μ m左右，有个别大于I μ m但均小于3 μ m,随着静置时间的増加，大粒子有減少的趋势，但趋势不甚明显。由此可判断，可溶性神在溶液中以Iym左右的粒子形式存在，因此如果浄化方式不当，即会造成含量数据的不准确和平行性较差。根据本发明的ー个优选实施方式，在静置一段时间后，选择孔径大小约为10 15 μ m+2 3 μ m的双层滤膜进行过滤,例如10 μ m+3 μ m和10 μ m+2 μ m孔径的滤膜，能兼顾浄化和含量。为避免相互污染，滤膜应选用一次性的针头滤器。根据本发明的ー个优选实施方式，当采用静置方式对雄黄样品溶液进行净化吋，静置时间为大于18小时,优选20-24小时。根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(I)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。因采用人工胃液或人工肠液提出的供试品溶液中可溶性神含量较高，因此最好进一歩稀释，以保证稀释溶液中可溶性神的含量稳定。根据本发明的ー个优选实施方式，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)浄化得到的溶液。进ー步地，为了使大分子神化合物完全解离，以便于ICP-MS能更加准确地測定，稀释后的溶液可进行消解处理。根据本发明ー个特别优选的实施方式，将稀释后的溶液置顶空进样瓶中，加硝酸I. O 5. 0ml、盐酸O 2ml，加盖密封，70°C 100°C水浴水解I 3小时，置量瓶中，用水稀释至刻度备用。雄黄药材和饮片在人工胃液和人工肠液中，使用不同的稀释溶剂，结果趋势基本一致，在碰撞池模式下，盐酸对砷测定影响不明显，但浓度波动较大，应该避免使用。本发明所用人工胃液配制时采用了盐酸，最終选择盐酸系统溶液作为稀释溶剤。考虑到高浓度盐酸能加强仪器信号，且会产生ArCl，对砷的測定可能造成干扰，故在可能条件下，尽量选择较低浓度的盐酸溶液作为稀释溶剤。根据本发明一个优选的实施方式，选择O. 125mol/L盐 酸溶液作为稀释溶剤。雄黄中可溶性砷的含量较小，因此采用灵敏度较高的电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行測定，因此根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(3)中ICP-MS法的质谱条件为采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。本发明还研究了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法測定雄黄及雄黄粉中可溶性砷价态的含量测定方法。自然界的砷主要以金属神、砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、ニ甲基砷、一甲基砷或砷酸根存在。可溶性神及价态砷具有药效及毒性两方面作用，其神存在的形式对雄黄的毒性存在一定意义，因此需要对雄黄中所含的可溶性神及价态砷含量进行研究，以便控制雄黄的毒性。因此，本发明的另ー个目的是提供一种测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(I)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性价态砷；(2)可选的对步骤⑴提取得到的溶液进行净化；(3)HPLC-ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量。本发明中，术语“HPLC-ICP-MS法”是指高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法。本发明测定含雄黄的药物中可溶性价态砷含量的方法中的步骤(I)和(2)与本发明測定含雄黄的药物中可溶性神含量的方法中的步骤(I)和(2)完全一致；即，对按照上述
(I)提取得到的溶液，任选经过静置和稀释溶剂稀释后，再用HPLC-ICP-MS法測定其中可溶性价态砷的含量。根据本发明的ー个优选实施方式，所述可溶性价态砷选自砷胆碱、神甜菜碱、亚砷酸根、ニ甲基砷、一甲基砷或砷酸根。根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的色谱条件为色谱柱为Hamilton PRP-X100 ；以磷酸ニ氢铵溶液(调节pH值至8. O)为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱。
根据本发明的ー个优选实施方式，所述流动相的流速为I. Oml/min ；所述磷酸ニ氢铵溶液的浓度为O. 025mol/L。根据本发明的ー个优选实施方式，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的质谱条件为采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。本发明测定含雄黄的药物中可溶性砷和价态砷含量的方法的优点如下I、采用模拟体内的提取方式，创建了可溶性砷与价态砷的通用提取方法，有效代表雄黄药效和毒性主要成分体内吸收量，为准确測定可溶性神及价态砷提供可靠方法；2、采用ICP-MS和HPLC_ICP_MS建立了雄黄药效和毒性主要成分的测定方法，方法 灵敏、准确，填补了国内空白。
图I为实施例I “雄黄药材中可溶性价态砷的含量測定”项下对照品(上图)和供试品(下图)的高效液相色谱图，其中ASC、ASB、AS(III)、DMA、MMA、AS(V)分别代表砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、ニ甲基砷、一甲基砷、砷酸根；图2为实施例I测得的各批雄黄药材中可溶性砷的含量图；图3为实施例2测得的各批雄黄饮片中可溶性神的含量图；图4为实施例I测得的各批雄黄药材中可溶性价态砷的含量图；图5为实施例2测得的各批雄黄饮片中可溶性价态砷的含量图；图6为实施例3测得的各批雄黄制剂中可溶性神的含量图；图7为实施例3测得的各批雄黄制剂中可溶性价态砷的含量图。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进ー步阐述本发明，但以下具体实施例不对本发明构成任何形式的限制。实施例I雄黄药材中可溶性砷的含量测定按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XI D)測定。试药和仪器美国Agilent公司7700ce型电感稱合等离子体质谱仪；必能信超声(上海)有限公司B9500S-DTH型超声波清洗机(功率300W，频率45kHz);美国Millipore公司Milli-Q超纯水机。砷标准溶液(1000mg/L，批号HC961324)，购自Merk公司。硝酸、盐酸均为优级纯(Merck公司)；胃蛋白酶为生化试剂，酶活力为I : 27000，批号为100710，购自上海惠兴生化试剂有限公司；胰酶为生化试剂，酪蛋白转化カ彡25.0，批号为F20100714，购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高纯液态氩气(纯度> 99. 99% )和氦气(纯度为99. 999% )由上海成功气体エ业有限公司提供。ICP-MS 工作条件Agilent Micromist Nebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2. 5mm中心通道；石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2°C ;镍采样锥和截取锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700ce型电感耦合等离子体质谱仪具体操作条件和采集參数见表I。表I、Agilent 7700Ce ICP-MS 仪器工作參数
权利要求
1.測定含雄黄的药物中可溶性神含量的方法，其特征在于该方法包括步骤 (1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中可溶性神； (3)ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性神的含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述含雄黄的药物选自雄黄药材、雄黄饮片和含雄黄的制剂。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的仿生溶剂选自人工胃液、人工肠液或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的仿生溶剂是人工肠液。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的超声处理或磁力搅拌为大于或等于2小吋。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤 (2)对步骤(I)提取得到的溶液进行净化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤⑴中采用采用(a)先静置，再用滤膜进行浄化；或(b)采用静置进行净化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述滤膜为双层滤膜。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述双层滤膜孔径大小约为10 .15 μ m+2 3 μ m。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述(a)中的静置时间为大于5小时，优选6-8小时。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。
12.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。
13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)浄化得到的溶液并进行消解。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述稀释溶剂为盐酸溶液。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为O.0125 .O. 250mol/L，优选 O. 125mol/L。
16.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中ICP-MS的质谱条件为采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
17.測定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (I)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性价态砷； (3)HPLC-ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述含雄黄的药物选自雄黄药材、雄黄饮片和含雄黄的制剂。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述可溶性价态砷选自砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、ニ甲基砷、一甲基砷或砷酸根。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的仿生溶剂选自人工胃液、人工肠液或其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的仿生溶剂是人工肠液。
22.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的超声处理或磁力搅拌时间为大于或等于2小吋。
23.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤 (2)对步骤(I)提取得到的溶液进行净化。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中采用(a)先静置，再用滤膜进行浄化；或(b)采用静置进行净化。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述滤膜为双层滤膜。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述双层滤膜孔径大小约为10 15 μ m+2 3 μ m。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述(a)中的静置时间为大于5小吋，优选6-8小时。
28.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。
29.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。
30.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)浄化得到的溶液。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述稀释溶剂为盐酸溶液。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为O.0125 O. 250mol/L，优选 O. 125mol/L。
33.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的色谱条件为色谱柱为Hamilton PRP-X100 ;以磷酸ニ氢铵溶液为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在干，所述流动相的流速为O.7 I. 5ml/min,优选 I. Oml/min。
35.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述磷酸ニ氢铵溶液的浓度为O.01 O.05mol/L,优选 O. 02mol/L。
36.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述磷酸ニ氢铵溶液的pH值为6.5 9. 0，优选 8. O。
37.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的质谱条件为采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
全文摘要
本发明公开一种测定含雄黄的药物中可溶性砷含量的方法，其特征在于该方法包括步骤(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性砷；(2)可选的对步骤(1)提取得到的溶液进行净化；(3)ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性砷的含量。本发明还公开一种测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量的方法。本发明通过采用模拟体内的提取方式以及采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS建立了雄黄药效和毒性主要成分的测定方法，该方法灵敏、准确。
文档编号G01N30/72GK102692470SQ20111006738
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者于建, 吴赵云, 夏晶, 孙健, 孟茜, 季申, 张甦, 张道广, 李丽敏, 毛丹, 毛秀红, 王少敏, 王枚博, 王柯, 王欣美, 简龙海, 胡青, 苗水, 许勇, 郏征伟, 郑荣, 钟吉强, 陆继伟, 陈铭, 陈静 申请人:上海市食品药品检验所