专利名称：一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及细胞吞噬外源异物能力的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定细胞是否具有吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法。
背景技术：
吞噬作用(phagocytosis)是指细胞把入侵的病原体(如细菌和病毒)转运到细胞内并加以清除的过程，此过程构成生物体先天免疫的第一道防线。吞噬作用是所有后生动物的一种原始的防御机制。早在1862年，Haeckel就描述了腹足动物血细胞的吞噬作用过程，但是，吞噬作用在免疫防御上的重要性直到1882年才被Metchnikoff意识到(Vaughan，1965)。吞噬作用在动物界中普遍存在，低等单细胞动物通过吞噬作用取食，高等多细胞动物则通过吞噬细胞来清除外来物质，吞噬过程可以概括为识别，粘连，聚集，摄入，清除等(王金星等，2004)。S^derhMl等(1986)发现透明细胞具有较强的吞噬能力。由于吞噬能力在一定程度上反映了机体免疫力的变化，而吞噬能力一般用吞噬百分比和吞噬指数来表示。在研究吞噬作用中，不同学者采用不同的感染源。目前有文献报道了腊蛾 (Galleria mellonella)、贻贝、Procambarus zonangulus 等吞噬细胞对用 FITC 标记的硅胶颗粒、酵母和酵母聚糖A (zymosan Α)的吞噬作用；而国内研究主要是利用金黄色葡萄球菌作为外源感染源，甲醇固定、Gimesa染色后用显微镜观察。由于酵母细胞透明，在显微镜下不易辨认；FITC荧光素不稳定，易受温度、PH值、杂质、细胞固定剂及溶剂等多种因素的影响；而金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，能引起人和动物的多种疾病，而且作为感染源时，需甲醇固定，Gimesa染色，过程繁琐且不易观察吞噬过程。因此选择一种效果明显、 易观察的感染源非常必要。(Tojo et al. ,2000 ；Cima et al. ,2001 ；Barracco t al. ,1999 ；Cardenas et al.，2000 ；南旭阳，2009 ；林清华，1999 ；魏克强，2006 ；陈孝煊等，2002 ；)增强型绿色荧光蛋白因能稳定表达，在生物学研究中常被用作指示物，而将PEGFP转化到大肠杆菌的技术相当成熟。表达了绿色荧光蛋白的大肠杆菌具有外源微生物的特性，绿色荧光蛋白还能在大肠杆菌内稳定、持续表达，荧光不易淬灭，样品还可以长时间保存。而吞噬了大肠杆菌的血细胞在荧光显微镜下清楚可见，能迅速准确得到吞噬百分比及吞噬指数，且吞噬大肠杆菌后还可以利用流式细胞仪对有吞噬作用的血细胞进行分选。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有研究吞噬作用中所采用的感染源存在的问题而提供一种鉴定细胞是否具有吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法。本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现
一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法，包括感染源制备步骤、混合培养步骤、在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤、分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤，其特征在于所述感染源制备步骤是制备表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌。所述混合培养步骤是指将所述感染源制备步骤制备的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌与所述研究细胞按照细胞个数10 1的比例混合，培养1小时制成观察液。所述在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤是指将所述混合培养步骤培养的观察液制成血涂片于荧光倒置显微镜下观察。所述分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤是指在显微镜下清晰观察每个视野中参与吞噬的细胞，吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞，并且能辨别参与吞噬细胞的类型；然后将每个视野中的参与吞噬的细胞、吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞的指标累计，以下列公式分别计算所述研究细胞的吞噬百分比及吞噬指数
权利要求
1.一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法，包括感染源制备步骤、混合培养步骤、在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤、分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤，其特征在于所述感染源制备步骤是制备表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合培养步骤是指将所述感染源制备步骤制备的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌与所述研究细胞按照细胞个数10 1的比例混合，培养1小时制成观察液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤是指将所述混合培养步骤培养的观察液制成血涂片于荧光倒置显微镜下观察。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤是指在显微镜下清晰观察每个视野中参与吞噬的细胞，吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞，并且能辨别参与吞噬细胞的类型；然后将每个视野中的参与吞噬的细胞、吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞的指标累计，以下列公式分别计算所述研究细胞的吞噬百分比及吞噬指数视野中参与吞噬的细胞数吞噬百分比(PP)= 视野中的总细胞数 χιοο%细胞内的总细菌数吞噬指数(PI)=被计算具有吞噬作用的细胞数。
全文摘要
本发明公开的一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法，包括感染源制备步骤、混合培养步骤、在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤、分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤，其特征在于所述感染源制备步骤是制备表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌。本发明将能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌作为感染源，研究各类细胞的吞噬作用。具有直观、准确、快速、方便等优点。本发明还可以观察具有吞噬功能的细胞类型。
文档编号G01N21/64GK102251017SQ201110130358
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者乐亚玲, 刘利平, 陈桃英 申请人:上海海洋大学